Почвоведение, 2019, № 8, стр. 910-922

ВВЕДЕНИЕ

Гуминовые вещества широко распространены в почвах, осадках и природных водах [30]. Они представляют собой темноокрашенные аморфные продукты трансформации органических остатков (гумификации) и составляют до 90% органического вещества (ОВ) почв [6, 19] – главного резервуара С_орг в биосфере [14]. Классификация гуминовых веществ основана на их растворимости: выделяют растворимые в щелочах, но нерастворимые при рН < 2 гуминовые кислоты (ГК), растворимые при всех значениях рН фульвокислоты (ФК) и нерастворимый остаток от щелочной экстракции – гумин.

Гуминовые вещества во многом обусловливают плодородие и биосферные функции почв, однако их происхождение, молекулярная структура и устойчивость являются предметом дискуссий [27, 33]. В последнее время поставлена под сомнение концепция гумификации и факт существования гуминовых веществ как отдельного класса органических соединений; ОВ почв предложено рассматривать как континуум биомолекул на разных стадиях деградации [22]. Для описания органического вещества почв и природных вод вместе с термином “гуминовые вещества” входит в употребление термин “природное органическое вещество” [24]. Тем не менее, результаты количественной твердофазной ¹³С ЯМР спектроскопии показали, что гуминовые кислоты (ГК) черноземов и торфов существенно отличаются от биомолекул органических остатков (лигнина, целлюлозы, белков) высоким содержанием конденсированных и О-замещенных ароматических фрагментов, углерода кетонов и карбоксильных групп [15]. Эти результаты опровергают мнение, что ЯМР сигналы гуминовых веществ могут быть приписаны исключительно интактным или разрушающимся биомолекулам [20], что вещества щелочных экстрактов представляют собой промежуточные продукты трансформации органических остатков [22].

Одной из главных проблем изучения почвенного ОВ является его прочная связь с минеральными компонентами и способ извлечения, основанный на щелочной экстракции. В щелочной экстракт переходит 40–80% от С_орг в зависимости от типа почвы [32], существенная часть ОВ остается во фракции гумина. В щелочных условиях, особенно в присутствии молекулярного кислорода, может происходить окисление фенольных соединений [35], являющихся ключевыми ароматическими компонентами почвенного гумуса. В результате окисления возможны как деструкция соединений гумуса, так и их окислительная конденсация [6, 32]. Поэтому считается, что щелочная экстракция создает артефакты, а соединения щелочных экстрактов имеют мало общего с нативным ОВ почв [22]. Развиваются недеструкционные методы анализа ОВ почв [13], а также последовательное извлечение компонентов ОВ органическими растворителями [17, 25]. Тем не менее, щелочная экстракция является единственным общепринятым методом извлечения ГК из почв в препаративных количествах, это также способ получения гуминовых препаратов для их использования в сельском хозяйстве [29]. Международным обществом по изучению гуминовых веществ (www.ihss.org) рекомендовано выделять ГК в атмосфере азота, чтобы снизить влияние окислительных превращений на структуру извлекаемых соединений [34]. Метод выделения ГК, принятый в Российской школе почвоведения, применение азота или инертного газа не предусматривает [7]. Существует большой массив данных по свойствам препаратов ГК, выделенных из различных объектов без использования азота [1, 6, 10, 26]. Работы по сравнению структуры и физико-химических свойств ГК, выделенных из минеральных горизонтов почв щелочной экстракцией в присутствии и отсутствии O₂, крайне малочисленны и ограничиваются изучением отдельных свойств ГК, например, их молекулярно-массовых распределений [3]. Это не позволяет сопоставлять данные, полученные экстракцией в атмосфере азота и без него, и оценить влияние присутствия О₂ в щелочных экстрактах на свойства ГК из различных типов почв.

Цель настоящей работы – сравнить структуру и физико-химические свойства ГК, выделенных из почв щелочной экстракцией в атмосфере азота и без его использования. В качестве объектов исследования были выбраны гумусовые горизонты двух контрастных по условиям гумусообразования типов почв: дерново-подзолистой (ДПП) и чернозема. Эти почвы являются зональными типами почв в южной тайге и степи, а препараты ГК из них часто используются в качестве модели в исследованиях свойств почвенного гумуса.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Почвы. Использовали образцы гумусовых горизонтов (A1) дерново-подзолистой среднесуглинистой почвы (ДПП) (Московская область, Россия, N 56.226819, E 37.951602) и чернозема выщелоченного (Липецкая область, Россия, N 53.496117, E 38.990066). Дерново-подзолистая почва (Stagnic Retisol (Loamic, Humic), согласно WRB 2015) развита под ельником мертвопокровным и имеет профиль O(0–1 см)–A(1–6(10) см)–AE(6–20 см)–EB(20–36 см)–Bg(36–70 см). Выщелоченный чернозем (Luvic Chernozem (Siltic, Pachic), согласно WRB 2015), залежь 20 лет, развит под степной растительностью и имеет профиль A1(0–43 см)–AB(43–67 см)–Bt(67–100 см)–BCk(100–122 см). Смешанный образец гор. A1 дерново-подзолистой почвы (10 кг) отобрали в начале мая 2017 г. с глубины 2–10 см на площади около 3 м². Смешанный образец гор. A1 чернозема (10 кг) отобрали в июне 2017 г. с глубины 10–40 см на площади около 2 м². Почвы высушивали на воздухе, растирали и просеивали через сито 1 мм. В почвах определяли ${\text{р }}{{{\text{Н }}}_{{{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}}}}$ (в вытяжках твердая фаза : раствор 1 : 5), содержание органического углерода и азота на анализаторе Vario LIII (Германия), соотношение C_ГК/C_ФК методом Пономаревой и Плотниковой с небольшой модификацией [7]. Для этого образец почвы экстрагировали 0.1 M NaOH (24 ч) после промывки 0.1 M H₂SO₄, затем экстрагировали 0.02 M NaOH (6 ч при 80°C). ГК в экстрактах отделяли от ФК подкислением раствора до рН 2. Концентрацию общего растворенного органического углерода (С_орг) и C_ФК в экстрактах определяли на TOC-анализаторе (Shimadzu, Japan) после фильтрации растворов через бумажный фильтр, отмытый дистиллированной водой. C_ГК находили по разности между общим растворенным С_орг и С_ФК. Отношение C_ГК: C_ФК находили с учетом содержания ГК и ФК в двух последовательных экстракциях. Некоторые свойства почв приведены в табл. 1. Гумусовый горизонт дерново-подзолистой почвы характеризовался кислой реакцией среды (рН 3.80 в слое 0–6 см, 5.01 в слое 6–10 см, среднее – 4.49), содержанием углерода 5.12%, азота – 0.32% и гуматно-фульватным типом гумуса (C_ГК/С_ФК 0.6). Гор. A1 выщелоченного чернозема имел рН 5.31, содержание углерода составляло 4.35%, азота – 0.33%, тип гумуса – гуматный (C_ГК/С_ФК 2.6). В целом, почвы обладали характерными для своего типа свойствами, за исключением содержания углерода. Достаточно высокое его содержание в дерново-подзолистой почве может быть связано с примесью тонких фракций детрита. Низкое содержание углерода в черноземе может быть обусловлено его потерями за период сельскохозяйственного использования.

Экстракция и очистка ГК. К образцам почвы (3 кг) добавляли 0.1 M NaOH в отношении 1 : 5. Проводили три последовательные экстракции (каждая по 24 ч) в атмосфере азота (${\text{Г }}{{{\text{К }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}$) и без него (ГК). Чернозем предварительно декальцировали 0.1 M HCl (48 ч, соотношение почва : раствор 1 : 5), почву промывали 2 раза дистиллированной водой (по 15 л, 24 ч). Щелочные экстракты подкисляли до pH 2 (HCl_конц), ГК отделяли центрифугированием (10 мин, 7000 g). Зольность неочищенных ГК, определенная сжиганием препарата при 800°C (4 ч), составляла 30–60%. ГК очищали от зольных компонентов высаливанием 0.4 M NaCl [7]. Осадок (зольность >70%) отделяли центрифугированием (16000 g, 10 мин). Очищенную ГК в надосадочном растворе переводили в H-форму трехкратным переосаждением HCl_конц. Осадок ГК отмывали от избытка Cl^– H₂O_дист на центрифуге и высушивали на водяной бане при 50°C. Все процедуры с ${\text{Г }}{{{\text{К }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}$ в щелочных условиях проводили в атмосфере N₂.

Выход ГК в щелочной экстракт в присутствии и отсутствии О₂. Для того, чтобы оценить количество ГК, переходящих в щелочной экстракт в присутствии и отсутствии О₂, проводили три последовательные экстракции 0.1 М NaOH в атмосфере азота и без него. Экстракции проводили в микроцентрифужных пробирках Eppendorf объемом 2 мл в трехкратной повторности, к 300 мг почвы добавляли 1.5 мл 0.1 М NaOH, экстракты встряхивали 24 ч на термошейкере при 22°С (Biosan, Латвия). В случае вытяжки с использованием азота щелочь предварительно продували этим газом 15 мин, затем продували щелочной раствор сразу после добавления его к почве (2 мин). Надосадочные растворы отделяли центрифугированием (18000 g, 15 мин), а почву между экстракциями промывали H₂O (2 раза по 1 мл). Общий растворенный углерод в экстрактах и С_ФК после осаждения ГК определяли на TOC-анализаторе (Shimadzu, Япония). Растворы перед определением разбавляли H₂O_дист. С_ГК находили по разности между С_общ и С_ФК.

Молекулярно-массовые распределения гумусовых кислот при последовательной щелочной экстракции. Молекулярно-массовые распределения гуминовых веществ щелочных экстрактов были получены гель-фильтрацией на Сефадексе G-75. Использовали колонку Amicon (1.2 × 60 см, Amicon Corporation) и 0.025 М Трис-HCl (pH 8.2) буфер, в который добавляли 0.05 M NaCl и 0.1% SDS для подавления ионных и гидрофобных взаимодействий соответственно. Скорость элюирования составляла 7 мл/ч. Профили элюирования записывали при 280 нм, используя детектор 2238 UVICORD SII (LKB, Швеция). Свободный и конечный объем колонки определяли с помощью голубого декстрана 2000 и (NH₄)₂Cr₂O₇ соответственно. Пробы надосадочного раствора (2 мл) пропускали через обессоливающую колонку (1.5 × 8 см), наполненную гелем Сефадекс G-10 для перевода их в элюирующий буфер. Относительное содержание фракций оценивали по площадям под хроматографическими пиками как описано в работе [36].

Физико-химические свойства ГК. Элементный состав. Элементный состав определяли на CNH-анализаторе (Vario LIII, Германия). Содержание кислорода находили по разности. Зольность препаратов исследовали после озоления при 800°C, 4 ч.

Содержание функциональных групп и константы диссоциации. Содержание функциональных групп и значения рК_а (где К_а – константа диссоциации) определяли потенциометрическим титрованием. Образцы ГК (50 мг) растворяли в 25 мл 0.05 M NaOH, добавляли 5 мл 1 М KCl и 8.5 мл 0.1 M HCl. Объем раствора доводили до 50 мл с помощью H₂O_дист. Конечная концентрация ГК перед титрованием была 1 мг/мл, pH раствора около 11.2 и ионная сила 0.1. Раствор ГК титровали 0.01 M HCl (добавляя по 0.1 мл раствора) на автоматическом титраторе (Mettler Toledo DG58, США) в атмосфере азота. Количество функциональных групп и величины pK_a определяли как описано ранее [1].

Спектры поглощения в видимой и ИК-областях. Спектры ГК в видимой области снимали на спектрофотометре Specord M40. ГК растворяли в 0.05 M NaOH, насыщенной N₂. Инфракрасные спектры снимали методом KBr-техники на спектрофотометре Bruker Tensor 27 (Германия).

¹H ЯМР и ¹³C ЯМР спектроскопия препаратов ГК. Для спектроскопии ¹H ЯМР и ¹³C ЯМР в жидкой фазе использовали дейтериевую воду (D₂O, 99.95% D) и 40% NaOD в D₂O (99+%D) (Aldrich, Milwaukee, WI).

Спектры ЯМР на ядрах ¹H и ¹³C регистрировали в ампулах для ЯМР спектроскопии диаметром 5 мм на спектрофотометре Bruker Avance 400 (Германия) с несущей частотой для протонов 400 МГц. Преобразование Фурье, фазовую коррекцию и интегрирование преобразованного спектра осуществляли с помощью программного обеспечения MestReC (Mestrelab Research, США). Интегрирование полученных спектров ЯМР осуществляли с использованием программного обеспечения GelTreat, разработанного А.В. Кудрявцевым (Химический факультет МГУ).

Для регистрации спектров ¹H ЯМР 10 мг ГК растворяли в 0.5 мл 0.3 M NaOD/D₂O. Спектры регистрировали с релаксационной задержкой 2 с, количество накоплений спектра составило от 30 до 40 сканов. Распределение скелетных протонов по структурным фрагментам (% от общей площади под спектром) определяли интегрированием спектральных областей, используя следующие отнесения (в миллионных долях, м.д.): 0.0–1.8 – Н алкильных звеньев (CH_n – протоны); 1.8–2.9 – Н алкильных звеньев, находящихся в α-положении по отношению к СООН-группам или ароматическому кольцу (α-CH_n); 2.9–4.5 – Н алкоксигрупп (CH_nO); 6.0–12.0 – ароматические протоны (H_Ar) [21].

Для регистрации спектров ¹³C ЯМР 40 мг ГК растворяли в 0.5 мл 0.3 M NaOD/D₂O. Смесь гомогенизировали на встряхивателе Вортекс в течение 10 мин и центрифугировали 5 мин при 10000 об./мин. При регистрации спектров ¹³C ЯМР использовали импульсную технику INVGATE (для исключения ядерного эффекта Оверхаузера и получения количественного спектра) и импульсную последовательность CPMG, как описано в [10]. Время регистрации сигнала составило 0.2 с, время релаксационной задержки – 7.8 с, продолжительность одного ЯМР эксперимента – 10 ч. Распределение атомов углерода по основным структурным фрагментам ГК определяли интегрированием спектральных областей, используя следующие отнесения [4] (м.д.): 220–185 – карбонильный углерод кетонных и хинонных групп (C=O); 185–165 – углерод карбоксильных, сложноэфирных и амидных групп (С=О)–O,N); 165–145 – ароматический углерод, замещенный гетероатомами (С_Ar–O,N); 145–108 – незамещенный или С-замещенный ароматический углерод (С_Ar–H,C); 108–90 – углерод, соединенный одинарными связями с двумя гетероатомами (в ГК это в основном ацетальный углерод в циклических сахаридах ОС–О,N); 90–48 – углерод, связанный одинарной связью с гетероатомом и входящий в состав алифатических фрагментов; 48–0 – углерод алкильных звеньев, не связанный с гетероатомами (CH_n). Спектральный диапазон от 90 до 48 м.д. делили на три части: 90–64 – углерод в группах (CH–O,N); 64–58 – углерод в группах СH₂–O,N; 58–48 – углерод метоксильных групп (CH₃O).

Содержание свободных радикалов в ГК по данным электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Регистрацию спектров ЭПР выполняли на спектрометре Radiopan SE/X-2547 (Польша) в X-диапазоне при комнатной температуре, высокочастотной мощности 1 мВт и амплитуде высокочастотной модуляции 0.06 мТл. Концентрацию свободных радикалов в образцах почв и ГК определяли путем сравнения площадей под кривыми относительных интегральных интенсивностей сигналов ЭПР стандарта и образца [5, 12]. В качестве стандарта использовали дифенилпикрилгидразил. Ошибка определения концентрации свободных радикалов в таком случае не превышает 5% [5, 12, 28]. Ширину линии (в Гауссах) вычисляли по расстоянию между экстремальными точками линии поглощения.

Молекулярно-массовые распределения препаратов ГК. Молекулярно-массовые распределения ГК были получены гель-фильтрацией на Сефадексе G-75 как описано выше. Пробы ГК (1 мг/мл в 0.05 M NaOH) предварительно пропускали через колонку Сефадекс G-10 (1.5 × 8 см) для перевода их в элюирующий буфер. Молекулярные массы середины хроматографического пика рассчитывали по формуле Детермана для глобулярных белков, а относительное содержание фракций – по площадям под хроматографическими пиками как описано в работе [36].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Количественный выход и молекулярно-массовые распределения гумусовых кислот при их экстракции в атмосфере азота и без его использования. Экстракция гуминовых веществ в щелочной среде сопровождается потреблением кислорода [32]. Щелочная среда и O₂ могут оказывать влияние не только на гуминовые вещества (окисление, конденсация) [34], но и на минеральные компоненты почв (растворение оксидов, гидроксидов, силикатов) [16]. Мы предположили, что если присутствие кислорода при щелочной экстракции оказывает деструктивное влияние на свойства минеральной матрицы почв, то это в первую очередь скажется на количественном выходе гумусовых кислот (он увеличится). Окислительная же полимеризация гуминовых веществ в щелочной среде в присутствии кислорода должна привести к увеличению доли ГК в экстрактах. Был изучен общий выход гумусовых кислот (ГК и ФК), а также отдельно фракции ГК при трех последовательных экстракциях в атмосфере азота и без его использования. Содержание углерода гумусовых кислот (ГК + ФК) и отдельно фракции ГК оказалось очень близким в каждой из трех последовательных щелочных экстракций для вариантов с продувкой азотом и без нее (рис. 1). Суммарный выход С_{ГК + ФК} трех экстракций с азотом (без него) составил, соответственно, 38.9 ± 0.8% (40.4 ± 1.2%) от С_общ в дерново-подзолистой почве и 69.2 ± 3.5% (67.6 ± 4.3%) от С_общ в черноземе. Суммарное содержание С_ГК в вариантах с азотом (без него) составило 27.8 ± 0.8% (28.5 ± 0.8%) от С_общ в дерново-подзолистой почве и 64.9 ± 3.4% (62.8 ± ± 4.3%) от С_общ – в черноземе. Таким образом, установлено, что присутствие кислорода в щелочных экстрактах не влияет на количество ГВ, экстрагируемых щелочью из гумусовых горизонтов дерново-подзолистой почвы и чернозема. Методом гель-фильтрации установлено также отсутствие полимеризующего воздействия кислорода на ОВ в щелочных экстрактах. Органическое вещество щелочных экстрактов изученных почв содержит высоко- (>75 кДа) и низкомолекулярную фракции (10–30 кДа), соотношение которых не отличалось в вариантах экстракции с азотом и без него ни в дерново-подзолистой почве, ни в черноземе (рис. 2). Действительно, показано, что для полимеризации ГК в присутствие кислорода даже в щелочных условиях необходимо наличие биокатализатора (лакказы) [23].

Рис. 1.

Содержание углерода гумусовых кислот (ГК + ФК) и гуминовых кислот (ГК) в щелочных экстрактах из дерново-подзолистой почвы (ДПП) и чернозема: 1 – выделено в атмосфере азота; 2 – без его использования.

Рис. 2.

Содержание высокомолекулярной фракции (>75 кДа) в органическом веществе трех последовательных щелочных экстракций (номер экстракции показан римской цифрой). N₂ – экстракция в атмосфере азота.

Содержание углерода гумусовых кислот резко уменьшалось от первой ко второй и третьей экстракциям (рис. 1). В первую вытяжку в дерново-подзолистой почве переходило около 75% от С_орг трех экстракций, во вторую и третью – около 20 и 5% соответственно. Та же тенденция выявлена и в черноземе. В первый щелочной экстракт переходило около 86% от С_орг трех экстракций, во второй и третий экстракты – около 10 и 3% соответственно. Изучение молекулярно-массовых распределений гумусовых кислот щелочных экстрактов показало нарастание доли высокомолекулярной фракции от первой ко второй и третьей экстракциям в обеих почвах (рис. 2). Высокомолекулярные компоненты, присутствующие в щелочных экстрактах из чернозема, скорее всего, представляют собой органо-минеральные комплексы с высокой зольностью, так как они удаляются на стадии очистки высаливанием. Увеличение содержания этих компонентов от первой ко второй экстракции может быть связано с растворением минеральных частиц и переходом в раствор металл-органических соединений с высокой молекулярной массой. Следует отметить, что в работе [11] показано отсутствие различий в молекулярно-массовых распределениях ГК от экстракции к экстракции, что может быть связано с использованием геля Toyopearl, обладающего сродством к гидрофобным соединениям. Относительная гидрофобность компонентов ГК увеличивается с возрастанием их молекулярной массы [2]. Гидрофобные/высокомолекулярные компоненты ГК сорбируются на геле (данные не показаны), что может быть причиной их кажущегося низкого содержания на хроматограммах в работе [11]. В целом, результаты последовательных экстракций согласуются с литературными данными, полученными для серой лесной [9], дерново-подзолистой почв и чернозема [11], и свидетельствуют о целесообразности использования одной щелочной вытяжки при экстракции гумусовых кислот в препаративных количествах, что дает возможность получить представительный препарат и существенно снизить трудозатраты. Особенно это касается чернозема, где вторая и третья вытяжка сопровождаются выраженной пептизацией коллоидов, что существенно увеличивает время осаждения минеральных частиц и затрудняет дальнейшую очистку препарата.

Физико-химические свойства гуминовых кислот. Элементный состав препаратов ГК находится в интервале значений, характерных для изученных типов почв. Содержание азота в ГКД (2.6–3.0 ат. %, табл. 2) несколько выше средних значений для ГК дерново-подзолистых почв (2.4 ат. %, [6]), но в целом согласуется с данными других авторов [10]. У препарата ГКД без азота несколько выше отношение O : C по сравнению с препаратом, выделенными в атмосфере азота. Это отношение является одним из показателей степени окисленности [6]. Других различий в элементном составе препаратов, выделенных в атмосфере азота и без него, не выявлено.

Спектры препаратов ГК и ${\text{Г }}{{{\text{К }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}$ в видимой и УФ-областях оказались идентичны (данные не показаны). Оптические свойства ГК в видимой области (величины Е) согласуются с литературными данными [6, 32]. Значительно большую оптическую плотность ГК черноземов по сравнению с ГК дерново-подзолистых почв связывают с более развитой цепью сопряженных двойных связей и большей степенью окисленности [6].

Препараты ГК из дерново-подзолистой почвы (ГКД) и чернозема (ГКЧ), выделенные с продувкой азотом и без нее, практически не отличаются по содержанию функциональных групп, за исключением ГК из дерново-подзолистой почвы. В ГКД по сравнению с ${\text{Г К }}{{{\text{Д }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}$ несколько больше содержание групп, титруемых в диапазоне рН 3.9–5.6 и 5.6–8.7 (табл. 3). В первом интервале значений рН предположительно титруются карбоксильные группы, а во втором – карбоксильные, азотсодержащие и, частично, фенольные группы [1]. Повышенное содержание кислых функциональных групп в ${\text{Г К }}{{{\text{Д }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}$ по сравнению с ГКД согласуется с данными элементного анализа (отношение O : C, табл. 2) и может свидетельствовать о несколько более высокой степени окисленности препарата, выделенного без использования азота.

ИК-спектры препаратов ГКД и ГКЧ оказались идентичны для вариантов экстракции с азотом и без него (рис. 3). Спектры содержат набор полос поглощения, типичных для гуминовых кислот из почв [6, 31, 32]. Между спектрами препаратов ГКД и ГКЧ выявлены существенные различия (табл. 4). ГК из обеих почв содержат широкую полосу валентных колебаний ОН- и NH-групп, связанных межмолекулярными водородными связями (3300 см^–1), однако эта полоса имеет намного большую интенсивность у ГКД. ГК обеих почв содержат плечо в области 3050 см^–1, приписываемое валентным колебаниям ароматических С–Н-групп [31]. Слабая интенсивность этой полосы может быть связана с наличием заместителей в ароматических кольцах ГК или ее перекрытием за счет полосы валентных колебаний ОН-групп [31]. Препарат ГКД содержит выраженные пики валентных колебаний алифатических СН₂- и СН₃-групп (2930 и 2845 см^–1), которым соответствует также слабый пик деформационных колебаний этих групп при 1450 см^–1. Эти полосы отсутствуют в ГКЧ, но этот препарат, в отличие от ГКД, содержит интенсивную полосу колебаний ароматических групп С=С (1610 см^–1). Таким образом, данные ИК-спектроскопии свидетельствуют о более высокой степени ароматичности ГКЧ по сравнению с ГКД, что согласуется с данными элементного анализа (отношения H : C) и спектроскопии в видимой области и характерно для ГК данных типов почв [6]. В области 1710–1030 см^–1 ИК-спектр препарата ГКД содержит широкий набор полос поглощения различной интенсивности (рис. 3), тогда как в спектре ГКЧ присутствуют три сильных полосы поглощения при 1720, 1610 и 1230 см^–1 и две полосы в виде плеча (1390 и 1080–1030 см^–1) (рис. 3). В области 1710–1720 см^–1 проявляется характерная для препаратов ГК полоса колебаний свободной СООН-группы, соответствующей Н-форме препарата [6, 31]. Эта полоса хорошо выражена в препарате ГКЧ, ей соответствуют также сильная полоса при 1610 см^–1 и полоса при 1390 см^–1, которые отчасти обусловлены, соответственно, симметричными и ассиметричными валентными колебаниями ионизированных СОО-групп. В препарате ГКД полоса СООН-групп (1710 см^–1) выражена в виде плеча, так как почти полностью перекрывается интенсивной полосой амидных групп (амид I, 1650 см^–1). О присутствии N-содержащих компонентов в ГКД свидетельствуют также узкие полосы слабой интенсивности при 1535 (амид II) и 1420 см^–1 (амид III). Аналогичные спектры ГК, в которых полоса карбоксильных групп перекрыта полосой амид I, описаны в литературе, в частности, для ГК коричневых и подзолистых лесных почв реферативной базы EUROSOILS (рендзин, камбисолей и лювисолей) [31]. Такие спектры свидетельствуют о высоком содержании в ГКД пептидов или белков, с чем может быть связано и повышенное содержание азота в этом препарате. Полосы колебаний С–О и О–Н в СООН (1260–1220 см^–1) намного более выражены в ГКЧ по сравнению с ГКД, что согласуется с более высоким содержанием в ГКЧ функциональных групп, титруемых в диапазоне рН < 8. В области 1080–1030 см^–1 в ГКД проявляется интенсивная полоса валентных колебаний С–О полисахаридов, выраженная в ГКЧ в виде плеча. Таким образом, данные ИК-спектроскопии свидетельствуют о большем содержании алифатических, азотсодержащих и полисахаридных компонентов в ГКД по сравнению с ГКЧ, что согласуется с условиями гумусообразования в этих почвах и меньшей степенью гумификации ОВ дерново-подзолистых почв [6, 31].

Рис. 3.

Инфракрасные спектры гуминовых кислот. ГКД – ГК дерново-подзолистой почвы, ГКЧ – ГК чернозема, N₂ – препарат выделен в атмосфере азота.

Протонные ЯМР-спектры содержат характерные для гуминовых кислот пики (рис. 4). Содержание протонов ароматических фрагментов в ГКЧ несколько выше, чем в ГКД (табл. 5), что согласуется с данными видимой и ИК-спектроскопии и свидетельствует о большей ароматичности ГКЧ. Различий между вариантами щелочной экстракции (с азотом и без) в черноземе не выявлено, тогда как в ГКД в варианте без азота несколько выше содержание алкоксигрупп (3.0–4.4 ppm), α-CH_n-групп (2.05–3.2 ppm) и несколько ниже содержание ароматических протонов. Однако эта тенденция не сохраняется (за исключением CH_nO-групп) на спектрах ¹³С ЯМР (табл. 6). Спектры ¹³С ЯМР содержат характерные для ГК пики хинонных (187–220 ppm) и карбоксильных (165–187 ppm) групп, ароматического углерода (108–165 ppm), замещенного (48–108 ppm) и незамещенного (5–48 ppm) алифатического углерода. Содержание карбоксильных групп в ГКЧ существенно ниже, чем в ГКД, что не вполне согласуется с данными потенциометрического титрования (содержание групп, титруемых в кислом диапазоне, несколько больше в ГКЧ). Общее содержание ароматического углерода (108–165 ppm) в ГКЧ несколько выше, а алифатического (108–5 ppm) – несколько ниже, чем в ГКД (табл. 7), что согласуется с большей степенью ароматичности ГКЧ по данным элементного анализа, видимой и ИК-спектроскопии и ¹H ЯМР. Качественный спектр препарата ГКЧ, выделенного в атмосфере азота, получить не удалось, что не позволяет сравнить данные разных вариантов экстракции. У ГКД вариант экстракции без азота отличается более высоким относительным содержанием хинонных и карбоксильных групп и замещенных кислородом ароматических фрагментов кислородом ароматических фрагментов, что согласуется с данными элементного анализа (отношение O : C больше в ГКД) и может свидетельствовать об окислении ГК данной почвы в процессе экстракции.

Рис. 4.

ЯМР-спектры препаратов гуминовых кислот.

Методом ЭПР установлено несколько большее содержание органических свободных радикалов семихиноидного типа во всех препаратах ГК по сравнению с исходной почвой (табл. 7), что можно объяснить действием щелочного гидролиза [12]. Аналогичные данные были получены ранее другими авторами [18, 28]. Разброс энергетических характеристик свободных радикалов (соответствует ширине спектральной линии ЭПР) в препаратах ГК заметно ниже, чем в спектрах ЭПР почвенных образцов за исключением ГКД без азота. Содержание свободных радикалов в черноземе и выделенной из него ГК выше, чем в дерново-подзолистой почве и ГКД на один и два порядка соответственно. При этом в ГКЧ содержание свободных радикалов только на 15% выше, чем в ${\text{Г К }}{{{\text{Ч }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}},$ тогда как в дерново-подзолистой почве эффект присутствия кислорода при выделении препаратов ГК оказался более значительным – ГКД содержит в два раза больше свободных радикалов, чем ${\text{Г К }}{{{\text{Д }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}.$ Кроме того, в ГКД значительно увеличилась ширина спектральной линии ЭПР (табл. 7). Это свидетельствует о большем разбросе энергетических характеристик свободных радикалов в ГКД, который превысил разброс даже для спектров ЭПР почвенных образцов. Данные ЭПР подтверждают результаты ЯМР спектроскопии, потенциометрического титрования и определения элементного состава и свидетельствуют об исходно меньшей степени окисленности органического вещества дерново-подзолистых почв, что подтверждается и литературными данными [12, 28]. В результате, щелочная экстракция без азота приводит к существенному увеличению концентрации индуцированных кислородом свободных радикалов в ГК из этой почвы.

Помимо оптических свойств, структурно-группового и элементного состава, были изучены молекулярно-массовые распределения ГК. Препарат ГКД состоит из двух фракций: высокомолекулярной, выходящей в свободном объеме колонки (молекулярная масса >75 кДа, относительное содержание 23%) и низкомолекулярной с массой середины пика около 29 кДа, относительное содержание которой составляет 77–78% (табл. 8). Препарат ГКЧ более низкомолекулярный: содержание высокомолекулярной фракции – 2%, низкомолекулярной фракции – 98%, ее молекулярная масса – 10 кДа. Различий между препаратами, выделенными с продувкой азотом или без нее, не выявлено. Результаты, полученные для ГКЧ, согласуются с литературными данными. Показано, что O₂ не влияет на молекулярно-массовые распределения гуминовых веществ, выделенных щелочной экстракцией из обыкновенного чернозема [3]. Таким образом, присутствие кислорода в щелочных экстрактах не приводит к окислительной полимеризации или деполимеризации ГК изученных почв. Относительно низкомолекулярная природа ГКЧ согласуется с условиями гумусообразования в черноземах. В этих почвах достаточно высокий период биологической активности, что способствует глубокой переработке растительных остатков и гуминовых веществ в результате более окисленные и низкомолекулярные [6]. В дерново-подзолистых почвах, являющихся зональными для средней и южной тайги, за счет холодного и влажного климата деструкция растительных остатков и их гумификация замедлены. Поэтому в почвах создаются условия для сохранения и накопления высокомолекулярных соединений гумуса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение структуры и физико-химических свойств ГК из дерново-подзолистой почвы и чернозема показало отсутствие различий в препаративном выходе, молекулярно-массовых распределениях, спектрах поглощения в УФ-, видимой и ИК-областях между препаратами, выделенными щелочной экстракцией в присутствии азота и без его использования. Элементный анализ, потенциометрическое титрование и спектроскопия ЯМР на ядрах ¹H и ¹³С выявили несколько бóльшее отношения O : C, немного более высокое содержание кислых групп, титруемых в диапазоне рН 3.9–8.7, и повышенное содержание хинонных (187–220 ppm) и карбоксильных (165–187 ppm) групп в препарате ГКД по сравнению с ${\text{Г К }}{{{\text{Д }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}},$ что свидетельствует о процессах окисления компонентов щелочной вытяжки из дерново-подзолистой почвы при экстракции в присутствии молекулярного кислорода. Об окислении свидетельствует также увеличение содержания свободных радикалов в ГКД по сравнению с ${\text{Г К }}{{{\text{Д }}}_{{{{{\text{N}}}_{2}}}}}.$ Данных отличий для ГКЧ не выявлено, что может свидетельствовать о глубокой окислительной трансформации ОВ при гумификации в черноземах, поэтому дальнейшего окисления при экстракции в щелочной среде в присутствии кислорода не происходит. Применение инертного газа для выделения ГК из минеральных горизонтов черноземов можно считать нецелесообразным. В случае дерново-подзолистых почв, экстракцию в атмосфере азота следует использовать, если в дальнейшем предполагается изучать реакции окисления ГК – например, при ферментативном катализе.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант 17-14-01207 (отбор проб почв, выделение препаратов гуминовых веществ и их характеристика методами элементного анализа, УФ- и ИК-спектроскопии, гель-хроматографии и потенциометрии) и гранта РФФИ 18-29-25065 (исследование препаратов гуминовых веществ методами спектроскопии ЯМР на ядрах ¹Н и ¹³С).