Почвоведение, 2020, № 3, стр. 351-357

ВВЕДЕНИЕ

Агрофизические свойства пахотных почв в виде агрегатного состава и устойчивости агрегатов – ключевой фактор их функционирования, способности обеспечивать жизнедеятельность растений и животных, регулирования водного, воздушного и теплового режимов почвы. Оптимальные агрофизические свойства определяют доступность питательных веществ для растений, скорость подтока влаги и питательных веществ к их корням, формируя диапазоны доступной влаги, температуры и воздухосодержания [1, 6, 10].

Остается слабоизученной проблема оптимизации агрофизических свойств и режимов почвы микробиологическим путем, т.е. роли представителей почвенной микробиоты в создании почвенных агрегатов, прежде всего, в модификации органическим веществом минеральной поверхности твердой фазы. К настоящему времени значение органического вещества в образовании агрономически ценной структуры общепринято. Как правило, указывают на агрегирующее значение гуминовых кислот, насыщенных Са. Подчеркивается роль полисахаридов, увеличения активности дегидрогеназы для формирования устойчивой структуры [13, 16, 19, 22]. Разнообразные исследования водоустойчивости почвенных агрегатов показывают, что это свойство обеспечивается формированием гидрофобно-гидрофильной поверхности твердой фазы почвы [19].

Предложена гипотеза, связывающая образование устойчивой агрегатной структуры почв с особым свойством почвенного органического вещества. Гипотеза основана на амфифильных свойствах почвенного органического вещества, гидрофильные компоненты которого в водной среде формируют связь с минеральными частицами, а гидрофобные – друг с другом, создавая водоустойчивый органо-минеральный агрегат [19, 21].

По указанной гипотезе гидрофобные структурообразующие компоненты формируются почвенной микробиотой, локализуются в микроагрегатах, которые, в свою очередь, образуют устойчивые к механическим и водным воздействиям агрегаты.

Эта гипотеза дополнена данными о значении гиф грибов в первичном (сначала механическом, а затем и биохимическом) формировании агрегатов, а также о пространственном распределении микробиоты в агрегате, где создаются условия квазианаэробиоза за счет увеличения длительности увлажнения, снижения “разрывного” действия защемленного воздуха [17, 18], что в итоге приводит к преимущественному формированию гидрофобных компонентов и органо-минеральных взаимодействий, служащих основами структуры органо-минерального образования в виде устойчивого агрегата [8, 9, 14, 15, 18–22].

Несмотря на кардинальное значение структурообразования, остаются до конца не разрешенным ряд вопросов, связанных с прямыми доказательствами формирования микробиотой гидрофобных структурообразующих компонентов органического вещества: (1) как во времени происходит процесс образования микробиотой органических веществ; (2) имеет ли этот процесс стадийный характер, можно ли выделить ключевые этапы создания микробиотой органических, “склеивающих” элементарные почвенные частицы веществ; (3) возможны ли прямые доказательства формирования микроагрегатов из элементарных почвенных частиц и их физических проявлений на определенных стадиях процесса формирования органических специфических веществ и, соответственно, образования микроагрегатов (или проагрегатов)? На все эти вопросы может ответить только прямой эксперимент по изучению процесса жизнедеятельности определенной группы микроорганизмов в суспензии из элементарных минеральных почвенных частиц и появления структурных формирований за счет органических продуктов жизнедеятельности почвенной микробиоты.

Цель работы: в модельных экспериментах показать возможность агрегатообразования за счет модификации поверхности минерала (каолинит) бактериями Bacillus velezensis. Задачи: (1) в модельном эксперименте с суспензией каолинита, засеянной бактериями, в динамике определить микробиологическую активность бактерий; (2) исследовать динамику краевого угла смачивания и удельной поверхности каолинита в модельном эксперименте; (3) исследовать формирование микроагрегатов (проагрегатов) в модельной суспензии методами лазерной дифрактометрии.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Для получения биомассы чистую культуру Bacillus velezensis, выделенную с поверхности речного песка, в течение 3–5 дней культивировали на твердой питательной среде NA (Nutrient agar, фирма Himedia): пептический перевар животной ткани – 5 г/л; натрия хлорид – 5 г/л; мясной экстракт – 1.5 г/л; дрожжевой экстракт – 1.5 г/л; агар-агар – 15 г/л в термостате при температуре 28°С. Колонии смывали стерильным физраствором в колбу с жидкой питательной средой. Полученную суспензию в концентрации 10⁷ кл/мл использовали для модельного эксперимента по выяснению влияния микроорганизмов на свойства поверхности глинистых минералов.

В ходе модельного эксперимента в течение двух месяцев культивировали микроорганизмы в жидкой среде для силикатных бактерий (сахароза – 0.75 г/л; (NH₄)₂SO₄ – 0.15 г/л; Na₂HPO₄ – 0.30 г/л; MgSO₄ – 0.075 г/л; FeCl₃ – следы; минерал (каолинит) – 5 г/л) [5]. Состав среды подбирали таким образом, чтобы единственным труднодоступным источником калия в ней был ион К из глинистого минерала. Для этого использовали каолинит Еленинского месторождение в Челябинской области, в котором по химическому составу К₂О содержалось менее 1%. В целом, состав используемого образца каолина (в мас. %): SiO₂ не менее 46.3%, Аl₂О₃ не менее 36.3, Fe₂O₃ не более 1, ТiO₂ не более 0.8, СаО не более 0.4, MgO не более 0.3, К₂О менее 1%, Na₂O не более 0.2, SO₃ не более 0.15%. Кроме того, используемый минерал содержал примеси минералов в виде кварца (до 9%), полевого шпата (до 1%), галлуазита (до 2%), до 1% гидрослюд и следы серицита. Рабочая гипотеза эксперимента заключалась в том, что, извлекая калий из природного образца каолинита с указанными примесями, микроорганизмы будут изменять поверхность минералов, а продукты их метаболизма в виде новообразованных органических веществ будут модифицировать их поверхность.

Для проверки этой гипотезы в колбы объемом 1 л помещали навеску образца каолинита с минеральными примесями, содержащими калий (соответственно со средой [5] 2.4 г), и заливали по 400 мл среды. Часть из них (6 шт.) снабжали устройством для стерильного отбора проб [2], оставшиеся 48 сосудов автоклавировали в течение 30 мин при давлении 1 атм.

Половину всего количества колб засевали 4 мл микробной взвеси с концентрацией 2.7 × × 10⁷ КОЕ/мл. Незасеянные колбы служили контролем. После посева все колбы инкубировали при 27°С. Содержимое перемешивали раз в сутки. Сразу после посева отбирали пробы на определение белка (3 мл суспензии) и калия (10 мл). В дальнейшем такие пробы отбирали первые сутки 2–3 раза, далее – раз в сутки. Отобранные жидкие образцы замораживали для дальнейшего анализа. После окончания культивирования, когда были собраны все образцы, их размораживали и центрифугировали. Надосадочную жидкость отфильтровывали шприцевым фильтром с диаметром пор 22 нм для удаления клеток. В полученных образцах определяли содержание калия методом пламенной фотометрии (фирма BEKIFP64 Flame Photometer) и содержание белка – фотометрически (КФК-3-01 ЗОМЗ) с окрашиванием по Лоури [4].

Колбы, не оснащенные системами стерильного отбора проб, предназначались для анализа физических свойств поверхности твердой фазы минерала. Через 10, 23, 39, 42, 52, 63 суток часть из них выводили из эксперимента, их содержимое отмывали водой, надосадочную жидкость сливали, остатки выпаривали на песчаной бане при 60–80°С для получения твердой фазы для дальнейшего исследования. Высушенный минерал пропускали через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

В опытных и контрольных вариантах определяли гранулометрический и микроагрегатный составы методом лазерной дифракции [11], удельную поверхность методом тепловой десорбции газов (азота) на приборе Сорбтометр-М (ЗАО “Катакон”, Новосибирск) [11]. Измерение краевых углов смачивания (КУС) производили с помощью метода “сидячей” капли на цифровом гониометре Drop Shape Analysis System – DSA100 (KRÜSS, Германия) [11, 12]. В качестве тестирующей жидкости использовали дистиллированную воду, подаваемую на поверхность подготовленных образцов каплями, объемом 1.5 мкл. Для проведения анализа на предметное стекло наносили капли почвенных суспензий (1 мас. %), подсушивали при комнатной температуре до испарения жидкости, а затем в сушильном шкафу при 105°С в течение 6 ч [21].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамику роста культуры B. velezensis в опытных и контрольных вариантах оценивали по накоплению белка. Питательную среду для культивации микроорганизмов подбирали таким образом, чтобы единственным источником калия для микроорганизмов был глинистый минерал. При постановке эксперимента предполагалось, что микроорганизмы начнут извлекать калий из минерала, переводя его в раствор. Содержание растворимого калия определяли в исследуемых суспензиях (рис. 1). Концентрация иона калия в контрольных суспензиях в течение всего эксперимента практически не изменялась, оставалась в два раза ниже, чем в суспензии, содержащей микроорганизмы (порядка 0.6 и 1.2 мг/л соответственно). По мере микробного роста содержание углерода в процессе инкубирования возрастало от следовых количеств до 1.6%. Аналогично увеличивалось содержание азота до 0.35%, что приводило к изменению отношения С : N в процессе эксперимента (рис. 2). К 20–60-м суткам инкубации это соотношение стабилизировалось (в пределах 5–8), что указывает на микробное происхождение углерода и азота в вариантах опыта [3].

Рис. 1.

Динамика содержания белка (мг/см³), определенного по методу Лоури, в суспензии за время эксперимента (сплошная линия – линии тренда, пунктирная – экспериментальные данные).

Рис. 2.

Динамика соотношения C : N за время эксперимента.

В процессе своей жизнедеятельности микроорганизмы, с одной стороны, разрушали минерал, чтобы извлечь из него необходимые питательные элементы, а с другой – выделяли продукты метаболизма, чем изменяли свойства поверхности каолинита. Для оценки этих изменений определяли основные физические свойства исходного минерала при инкубации в присутствии микроорганизмов и в контрольных образцах.

Для всех образцов определяли краевые углы смачивания (КУС) методом статической “сидячей” капли. На рис. 3 представлены величины угла смачивания в момент времени, когда капля “сядет”, т.е. полностью соприкоснется с поверхностью минерала, но еще не начнет впитываться в образец – θ_o. В образцах разного времени инкубации с чистой культурой B. velezensis КУС значимо выше (69°–35°), чем в исходном минерале (19.9°) и в контроле (19.9°–26°). Максимальная гидрофобность поверхности минерала наблюдалась на десятые сутки эксперимента, КУС равнялся 69°. Далее гидрофобность снижалась и к сороковому дню эксперимента достигала постоянного уровня порядка 35°.

Рис. 3.

Динамика краевого угла смачивания (θ_о, град) за время эксперимента. В точках указаны 25, 50 и 75‑процентные квантили экспериментальных данных.

Для характеристики КУС использовали метод изучения скорости впитывания капли – чем дольше капля остается на поверхности анализируемого образца, тем выше КУС. Эти исследования показали, что время впитывания образца каолинита к концу эксперимента достигало 1.3 с, а соответствующего контрольного образца и исходного каолинита – около 0.3 с. По этим данным рассчитывали КУС, они составляли соответственно 38°, 22° и 20°. Это указывает на почти двукратное увеличение КУС во время эксперимента за счет микробной деятельности. Инкубация штаммом B. velezensis во всех случаях вела к гидрофобизации поверхности по сравнению с контрольными образцами, что может быть связано с гидрофобным характером продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. К концу эксперимента в образцах с бактериями происходило существенное увеличение содержания органического углерода. Обнаружена достоверная (при уровне значимости 0.01) корреляция между краевым углом смачивания и содержанием С_орг – коэффициент ранговой корреляции Спирмена равен 0.78, тогда как критическое значение для этого уровня значимости составляет 0.70. На рис. 4 представлены результаты определения удельной поверхности образцов методом низкотемпературной адсорбции азота. Через два месяца инкубации произошел резкий рост удельной поверхности в образцах с микроорганизмами, и к концу эксперимента удельная поверхность модифицированных образцов достигала 14 м²/см³. Из экспериментальных исследований удельной поверхности известно, что это физическое свойство считается консервативным, меняется постепенно и в узком диапазоне. Обычно его преобразования связывают с изменением гранулометрического состава, содержания органического вещества, либо с изменением поверхности минералов. В данном случае, вероятно, произошло изменение поверхности минералов, прежде всего, за счет того, что бактерии потребляли ион К из примесей и, возможно, частично разрушая минеральную структуру каолинита. По-видимому, поверхность минерала при таком воздействии становилась более рыхлой, трещиноватой, с большим количеством каверн и чешуек. Отметим, что последующие эксперименты по анализу поверхности частиц с помощью сканирующей электронной микроскопии подтвердили это предположение.

Рис. 4.

Динамика удельной поверхности (м²/см³) минерала за время эксперимента (сутки).

Прямым доказательством формирования микроагрегатов (проагрегатов) было исследование гранулометрического и микроагрегатного составов. Для получения полной картины изменения гранулометрического состава суспензии и появления в ней микроагрегатов провели гранулометрический анализ суспензии на разных этапах возможного формирования микроагрегатов (или проагрегатов) каолинита с микроорганизмами. Все дифференциальные распределения гранулометрического и микроагрегатного составов имеют форму кривой с одним ярко выраженным пиком (рис. 5А). В гранулометрическом составе всех образцов преобладает фракция 10–50 мкм, на которую приходится порядка 60%. Также существенным было содержание фракций 5–10 и 1–5 мкм – 20 и 13% соответственно. В микроагрегатном составе также наблюдалось преобладание (более 60%) фракции 10–50 мкм, а содержание фракций 5–10 и 1–5 мкм снижалось в среднем на 5%, в то время как содержание фракций крупнее 50 мкм возрастало (содержание микроагрегатной фракции 50–250 мкм выше гранулометрической на 10%). По-видимому, в данном эксперименте был достигнут второй этап на пути агрегации частиц, определяющий связывание органо-минеральных ядер в микроагрегаты [7]. За время эксперимента происходило уменьшение содержания частиц диаметром 1–5 и 5–10 мкм с 11.1 до 7% и с 15.5 до 13.2% соответственно. В то же время наблюдалось увеличение количества агрегатов диаметром 50–250 и 250–500 мкм на 5.4 и 1.5%. В контрольных образцах за время инкубации не происходило значимых изменений. Содержание микроагрегатов размером от 30 до 2000 мкм к концу эксперимента увеличилось на 8% за счет более мелких фракций. Показатель, который рассчитывали как разность содержания фракций по результатам исследования микроагрегатного и гранулометрического состава образцов, приведен на рис. 6. Отрицательная разница указывает на количество илистых частиц, задействованных в образовании микроагрегатов. Переход значений Δ в положительную область свидетельствует о преобладании в указанном диапазоне размеров частиц микроагрегатных фракций над гранулометрическими, характеризует область устойчивых микроагрегатов. К концу срока инкубации произошло увеличение содержания устойчивых микроагрегатов на 6.5% в основном за счет частиц диаметром от 50 до 400 мкм.

Рис. 5.

Гранулометрический и микроагрегатный составы образцов каолинита к концу срока инкубации штаммом B. velezensis (Б), соответствующего контрольного образца (В) и исходного каолинита (А).

Рис. 6.

Разница между содержанием частиц в микроагрегатном и гранулометрическом составах (Δ, %) в образцах каолинита при инкубации с микроорганизмами к концу срока инкубации штаммом B. velezensis (1), соответствующего контрольного образца (2) и исходного каолинита (3).

Таким образом, микробиологическая активность приводила к уменьшению содержания частиц размерами от 0.5 до 20 мкм (илистых частиц), которые приняли участие в формировании укрупненных частиц (проагрегатов) размерами от 20 до 100 мкм. По результатам проведенного модельного эксперимента можно оценить формирование микроагрегатов (проагрегатов) более крупного диаметра из исходного глинистого материала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного модельного эксперимента с суспензией каолинита в присутствии культуры B. velezensis в течение двух месяцев обнаружено увеличение содержания белка, углерода и азота. Предполагается, что микроорганизмы потребляли необходимый для жизнедеятельности катион калия из глинистого минерала, формируя микробную биомассу и специфические выделения белковой природы. Эти соединения модифицировали поверхность минералов, что подтверждалось существенным изменением краевого угла смачивания, увеличивавшимся от 20° до 40°, а также заметным ростом микроагрегатной фракции. Уже через два месяца инкубации в присутствии B. velezensis наблюдалось увеличение содержания фракций 50–250 и 250–500 мкм микроагрегатного состава на 5.4 и 1.5% соответственно.

Проведенный модельный эксперимент позволил сделать следующее заключение по механизму формирования микроагрегатов (проагрегатов) в минеральной глинистой суспензии. Микроорганизмы извлекают необходимый катион калия из примесей образца природного каолинита, увеличивают суммарную биомассу и выделяют различные метаболиты. Эти вещества модифицируют поверхность глинистого минерала. Происходит превращение ее из гидрофильной в частично гидрофобную, что способствует соединению отдельных частиц минерала в агрегатоподобные образования в результате склеивания мелких минеральных элементарных частиц в проагрегаты.