Почвоведение, 2022, № 7, стр. 940-946

ВВЕДЕНИЕ

Основная иерархическая единица почвенной структуры – агрегат, который можно рассматривать как биохимический реактор, где происходит трансформация растительных остатков, поступающих в почву. От размеров агрегатов зависит содержание в них углерода и строение органического вещества [4, 7, 8]. Микросреда в макроагрегатах, способствует замедлению разложения растительных остатков и их гумификации [27]. В связи с этим макроагрегаты допустимо рассматривать как отдельную систему или как микрокосм.

В литературе указывается на анизотропность макроагрегатов, выраженную от его периферии к центру. В качестве примера можно указать неоднородность по влажности, сопровождающуюся аэробными условиями по периферии и анаэробными внутри агрегата [9].

При изучении неоднородности макроагрегатов большую проблему представляет отделение их внешних слоев от внутренних. Это трудоемко (особенно для мелких макроагрегатов) и подходит только для решения специализированных задач. Применяют разделение вручную: тонким лезвием счищают верхний слой с агрегатов [14, 24]. Однако сложность операции затрудняет получение достаточной массы образца для анализов. Другим недостатком ручной разборки агрегатов является то, что работать с мелкими агрегатами (<2–3 мм) практически невозможно, и эти фракции не попадают в выборку. В то же время очень часто в гумусовых горизонтах доминируют именно мелкие фракции агрегатов, например, 2–1 мм [6].

В качестве примера изучения неоднородности агрегатов для решения узкоспециализированных задач можно упомянуть подход для определения ферментативной активности внутри и снаружи водоустойчивых агрегатов, основанный на скорости проникновения веществ внутрь агрегатов [1]. Описано изучение внутриагрегатных микроорганизмов путем их вымывания из агрегатов, а также посредством стерилизации поверхности агрегатов [21–23].

Таким образом, актуальна разработка доступных методов для послойного изучения агрегатов с выделением препаратов для инструментального анализа, которые позволяют при этом получать большие (граммы) количества образцов и не зависеть от размеров исходных агрегатов.

Ранее показана перспективность использования для этой цели истирания агрегатов с помощью их обработки в оборотном ротаторе, когда сухие агрегаты перекатываются вверх-вниз по пробирке и со временем истираются [5].

Цель работы – подбор параметров для выделения слоев, неоднородных по содержанию и строению органического вещества (ОВ) из агрегатов 2–1 мм типичных черноземов (Protocalcic Chernozems) [2, 18].

В выделенных из агрегатов образцах анализировали содержание углерода, азота и молекулярное строение ОВ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Почвы. В работе использовали образцы типичного чернозема [2] (согласно международной классификации ФАО – Protocalcic Chernozem [18]), отобранные на длительном многолетнем полевом опыте ФГБНУ “Курский ФАНЦ” (п. Черемушки). Для исследования выбраны почвенные агрегаты размером 2–1 мм типичных черноземов двух видов использования: пара и залежи.

Бессменный черный пар с 1964 г. (пар) – представляет собой участок, на котором почву ежегодно обрабатывают (перепахивают), не засевая и не допуская появления сорняков; таким образом, на это опытное поле с 1964 г. в почву практически не поступало свежее органическое вещество.

Залежь с 1998 г. после бессменного черного пара с 1964 по 1998 гг. (залежь). Часть участка вышеописанного многолетнего опыта с 1998 г. перестали обрабатывать, отведя под залежь, в настоящее время он зарос ковылем. Отбор образцов этого варианта проводили в 2015 г. Таким образом, вариант позволяет анализировать восстановление почвы в течение 17 лет после экстремальных нагрузок. Подробнее о свойствах почв и методах отбора образцов можно посмотреть в работе [4].

Выделение препаратов внешних и внутренних слоев агрегатов. Для изучения неоднородности почвенных агрегатов была предложена и реализована процедура получения препаратов внешних и внутренних слоев почвенных агрегатов [5]. Принцип этой процедуры заключался в поэтапном истирании почвенных агрегатов на оборотном ротаторе. Для истирания брали 5 г почвенных агрегатов размером 2–1 мм в трехкратной повторности которые помещали в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой (типа Falcon) объемом 50 мл и встряхивали на ротаторе в режиме 40 об./мин с оборотом в 360°.

После обработки содержимое пробирок пропускали через сита и получали 4 фракции размером: >1, 1–0.5, 0.5–0.25 и <0.25 мм. Далее с фракцией >1 мм повторяли процедуру истирания, всего было проведено 4 подобных операции, первые 3 из которых продолжительностью 5 ч, а последняя для большей эффективности процесса истирания составляла 24 ч. Таким образом, агрегаты обрабатывали 5, 10, 15 и 39 ч. Для каждого варианта использования получено по три фракции для первой, второй и третьей обработок (1–0.5, 0.5–0.25 и <0.25 мм) и 4 фракции после четвертой (>1, 1–0.5, 0.5–0.25 и <0.25 мм). В полученных фракциях оценивали содержание C, N и молекулярный состав органического вещества по данным аналитического пиролиза с газовой хроматографией и масс-спектрометрией (ГХ/МС).

Определение С, N. Содержание общего C, N в полученных фракциях определяли методом каталитического сжигания в токе кислорода на C, N- анализаторе Vario Macro Cube компании Elementar (Германия). В связи с тем, что рН всех почв был <7, а реакция с HCl на карбонаты была отрицательная, весь определенный С был отнесен к органическому [3].

Определение молекулярного состава органического вещества. Для оценки состава органического вещества применяли метод аналитического пиролиза с ГХ/МС. Для этого брали 2–5 мг почвы, перетертой в пудру, и проводили пиролиз при температуре 500°С в течение 1 мин; разделение и идентификацию продуктов пиролиза осуществляли на ГХ/МС. В работе использовали пиролизер Frontier Lab Multi-Shot Pyrolizer EGA/PY 3030D оснащенный автосемплером AS1020E и подключенный к газовому хроматографу с масс-детектором Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra. Параметры хроматографирования: температура инжектора 300°С, капиллярная колонка GsBP-5MS длиной 30 м, газ-носитель гелий, скорость потока 1 мл/мин, температурный режим: начальная температура 40°С, без градиента 1.5 мин, затем температура повышалась со скоростью 5°С/мин до 300°С, далее температура задерживалась 7 мин при 300°С, возбуждение молекул проводилось электронным ударом с энергией ионизации 70 эВ, диапазон детектируемых m/z 47–600. Идентификация продуктов пиролиза проводилась с помощью библиотек масс-спектров NIST11 в программе GCMS Postrun Analysis.

Для наглядной интерпретации полученных результатов была использована максимально простая модель неоднородности почвенного агрегата, согласно которой периферическая часть агрегата отличается от внутреннего ядра. Тогда при выбранной обработке с ядра должна стираться периферическая часть в виде частиц <0.25 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Зависимость истирания агрегатов от времени обработки показана на рис. 1.

Рис. 1.

Распределение структурных отдельностей (% от начальной навески в цикле истирания), полученных истиранием сухих агрегатов 2–1 мм через 5, 10, 15 и 39 ч обработки (типичные черноземы, варианты использования бессменный черный пар и 17-летняя залежь после черного парования).

Для интерпретации результатов использовали модель агрегата, состоящего из внутреннего более плотного ядра и рыхлой периферии.

Наибольшее влияние на распределение структурных отдельностей, получаемых в результате истирания агрегатов 2–1 мм, оказывали первые 5 ч обработки. Содержание агрегатов >1 мм уменьшилось почти на 20% в варианте залежь и на 30% в пару. При этом 4% (залежь) и 5% (пар) от взятой навески перешли во фракцию <0.25 мм. Полученные через 5 ч обработки частицы <0.25 мм, по-видимому, представляют более рыхлую (по сравнению с ядром) периферическую часть агрегатов. В пользу этого говорит и тот факт, что после 5 ч обработки выход частиц <0.25 мм резко упал: через 10 ч он составил 1.0 и 1.5% для вариантов залежь и пар соответственно; аналогичные выходы отмечены и через 15 ч; и близкие значения 1.8 (залежь) и 2.2% (пар) отмечены через 39 ч. Резкое уменьшение содержания фракции с диаметром частиц <0.25 мм также может быть связано с разной устойчивостью структурных отдельностей к истиранию. Проводя последовательное истирание агрегатов с предварительным изъятием продуктов предыдущего истирания, мы искусственно отбираем наиболее устойчивые из них. Структурные отдельности 1–0.5 мм, видимо, также следует отнести к ядру агрегатов, так как они образуются при уменьшении агрегатов в процессе истирания до диаметра меньше 1 мм. Однако в силу небольшого выхода этих структурных отдельностей и для упрощения модели их можно отнести и к переходной фракции, включающей в себя как внутреннюю, так и периферическую части агрегатов. Фракцию 0.5–0.25 мм следует считать переходной.

Для уточнения и подтверждения выводов, полученных на основе выхода размерных фракций в процессе истирания, в них было определено содержание C и N. Зависимость содержания С в структурных отдельностях, получаемых при истирании агрегатов 2–1 мм, приведена на рис. 2a.

Рис. 2.

Содержание С, % (а) и N, % (b) в зависимости от времени обработки агрегатов 2–1 мм в структурных отдельностях: <0.25 (вверху); 1–0.5 и >1 мм (внизу); типичные черноземы, варианты использования 17-летняя залежь после черного парования (1) и бессменный черный пар (2).

Однофакторный дисперсионный анализ не выявил значимых различий между структурными отдельностями одного варианта и одной размерной фракции. Более того, не выявлено различий между структурными отдельностями 1–0.5 и >1 мм, оставшихся после 39 ч обработки (выделены на нижней картинке рис. 2a). Стоит отметить, что дизайн эксперимента не позволял измерять содержание C и N во фракции >1 мм в промежуточное время обработки (через 5, 10 и 15 ч). При этом в крупных структурных отдельностях 1–0.5 и >1 мм содержание С было значимо больше по сравнению с частицами <0.25 мм. В залежи для фракции <0.25 мм показатель изменялся от 2.69 до 3.07%, а во фракциях 1–0.5 и >1 мм от 3.03 до 3.33%. Аналогично, но с меньшим разбросом проявлялась неоднородность по углероду в агрегатах пара: в частицах <0.25 мм содержание углерода изменялось в пределах 1.82–2.19%, а в крупных структурных отдельностях от 2.52 до 2.68%. Полученные результаты демонстрируют неоднородность агрегатов по содержанию С – его больше в ядре агрегата и меньше на периферии.

Аналогичная картина наблюдается и с распределением N в рассматриваемых агрегатах (рис. 2b).

Содержание N значимо не отличается для частиц <0.25 мм и для крупных структурных отдельностей 1–0.5 и > 1 мм. При этом и в варианте залежь, и в варианте пар содержание N значимо больше в крупных структурных отдельностях, то есть внутри агрегатов. Отметим большой разброс значений рассматриваемого показателя во фракции 1–0.5 мм варианта залежь после пяти часов обработки (рис. 2b, внизу). Возможно, это связано с недостаточным временем обработки для четкого разделения периферической и внутренней частей агрегатов. В результате, по обоим основным количественным показателям ОВ показана неоднородность агрегатов.

На следующем этапе исследования методом пиролиза с ГХ МС оценивали различия в молекулярном составе ОВ на периферии и в центре агрегатов. Различия наглядно видны при распределении полученных из агрегатов 2–1 мм структурных отдельностей в пространстве главных компонент на основе их состава. Особенности неоднородности агрегатов 2–1 мм варианта залежь по молекулярному составу показаны на рис. 1.

Две первые главные компоненты, рассчитанные по молекулярному составу, описывают 53% различий между структурными отдельностями. Первая компонента – 41, вторая – 12%.

Видно, что по первой главной компоненте структурные отдельности разделились относительно стадии истирания, в процессе которой они образовались. Вне зависимости от стадии истирания, по молекулярному составу отделяется периферия агрегатов от внутренней части. За единственным исключением – все частицы <0.25 мм расположены в зоне отрицательных значений первой компоненты. Также за единичным исключением, в этой области расположены структурные отдельности, полученные после пяти часов обработки. В отрицательной зоне первой компоненты расположена половина структурных отдельностей 0.5–0.25 мм, а половина – в положительной, что указывает на переходный характер этой фракции.

В положительной зоне первой главной компоненты сосредоточены все полученные фракции >0.5 мм, за исключением двух структурных отдельностей 1–0.5 мм, полученных через 5 ч обработки. Очевидно, пяти часов недостаточно для четкого отделения периферической части от ядра.

Анализ значений собственных векторов (табл. S1 ) позволяет выявить основные молекулярные маркеры, вносящие наибольший вклад в различия на пространстве главных компонент (рис. 3). В варианте залежь для внутренней части характерно возрастание доли пиридина и толуола. Для периферической части характерно увеличение в продуктах пиролиза доли алканов и алкенов. Недавно показано, что пиридин ассоциирован с пиролизатами растворимого и высокой степени разложения ОВ [20]. Схожие данные получены в работе [25], где высокая доля пиридина в продуктах пиролиза была характерна для наиболее разложенного ОВ. Анализируя данные о природе азотсодержащих пиролизатов почвенного ОВ Schulten et al. [26], выявили негативную корреляцию между долей пиридина и содержанием N. Кроме того, пиролизаты белковых производных подобной взаимосвязи не демонстрировали. В результате авторы пришли к выводу, что пиридин в составе пиролизатов отражает содержание азотных соединений – конституционных составляющих почвенного ОВ, например шестичленных азотных соединений в гуминовых веществах [26].

Рис. 3.

Распределение структурных отдельностей разного размера и времени обработки, полученных из агрегатов 2–1 мм типичного чернозема в варианте использования залежь (а) и бессменный черный пар (b), на основе молекулярного состава их ОВ (аналитический пиролиз с ГХ МС).

Толуол трудно соотнести с каким-либо одним компонентом ОВ, он может образовываться при пиролизе разных по своему генезису и строению групп почвенного ОВ: лигнина, деградированного лигнина, кислотонерастворимой части растительных остатков (лигнин Класона), аминокислот и их производных, а также ГВ [11–13, 16, 17, 19, 28]. Учитывая, что относительное содержание маркера переработанного (и видимо, устойчивого) ОВ – пиридина – увеличивается в ядре агрегатов, возрастание доли толуола в пиролизатах внутренней части агрегата тоже логично связать с увеличением доли устойчивой и переработанной части ОВ – лигнина и, вероятнее, деградированного лигнина.

В пиролизатах периферической части ОВ агрегатов варианта залежь возрастает относительное содержание алканов и алкенов – маркеров жирных кислот и микробных метаболитов, которые в свою очередь связаны с микробным разнообразием: большее количество алканов соответствует большему разнообразию жирных кислот [10] и большему биоразнообразию.

Результаты пиролиза демонстрируют, что внутри агрегатов 2–1 мм в типичном черноземе в варианте залежь после бессменного черного парования накапливаются более устойчивые компоненты ОВ, а по периферии наблюдается бо́льшее микробное разнообразие.

Различия по молекулярному составу ОВ в агрегатах 2–1 мм типичного чернозема в варианте землепользования черный пар в пространстве главных компонент показаны на рис. 3b. В варианте пар различия между структурными отдельностями были менее выражены, поэтому для наглядности в пространстве главных компонент рассматривались первая (5 ч) и последняя (39 ч) обработки. По первой компоненте отделяются обработка 5 и 39 ч, различия между периферией агрегатов и центром выражены слабо. Однако время истирания позволило разделить продукты истирания агрегатов по составу ОВ в зависимости от их устойчивости к истиранию во времени. Для продуктов пиролиза ОВ устойчивых к истиранию агрегатов характерна высокая доля фурфурола – производного полисахаридов, пирролов (маркеры пептидов) и ПАУ, которые являются пиролизатами устойчивых соединений “черного углерода” [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные наглядно демонстрируют неоднородность распределения органического вещества в агрегатах 2–1 мм черноземов разного вида использования. По содержанию органического вещества четко видны различия между периферией и внутренней частью агрегатов. При этом бо́льшие значения содержания C и N наблюдаются внутри агрегатов и в варианте пар, и в варианте залежь после пара. Эти связи не зависят от вида использования черноземов.

Неоднородность качественного состава ОВ в агрегатах существенно зависит от вида использования: в варианте залежь четко видны отличия внутри агрегатов от их периферийной части. Для ядра характерно более переработанное и устойчивое ОВ, а для периферии наличие маркеров микробного разнообразия. Для агрегатов варианта пар подобных тенденций не обнаружено.

Проведенное исследование демонстрирует, что применение механического истирания – достаточно эффективный метод для изучения неоднородности макроагрегатов черноземов. На основе полученных данных можно свидетельствовать, что оптимальным временем истирания для отделения ядра агрегата от периферии является временной промежуток от 15 до 39 ч. Исходя из оптимизации работы, следует рекомендовать обработку 24 ч.