Почвоведение, 2022, № 7, стр. 918-928

ВВЕДЕНИЕ

Антропогенное поступление тяжелых металлов в поверхностные континентальные воды может отрицательно повлиять на водные организмы, поскольку некоторые из этих металлов очень токсичны даже при относительно низких концентрациях [47]. Растворенное органическое вещество (РОВ) является одним из факторов, контролирующих формы нахождения металлов в природных водах. Биодоступность и токсичность некоторых металлов в поверхностных водах могут уменьшаться за счет образования комплекса с РОВ [18]. Кроме того, РОВ может сорбироваться на биотических поверхностях (например, поверхностях водорослей), препятствуя внутриклеточному поглощению металлов [17]. Доступность ионов металлов также зависит от такого динамичного, меняющегося в зависимости от времени и сезона, параметра, как размер частиц органической фракции, с которой они связаны [10, 11]. Зеленые микроводоросли рода Scenedesmus – обычные пресноводные виды, часто используемые в физиологических исследованиях. Также Scenedesmus spp. широко встречаются в почвах как переувлажненных [34], так и засушливых районов [22, 46], активно участвуя в депонировании C и N в почве [40]. Они в значительной степени устойчивы к металлам и легко накапливают их, включая Cd, Ni [19, 32], Pb [31] или Zn [14].

Основная часть РОВ в природных водах (до 70% от общего органического углерода) представлена гуминовыми веществами [18, 48]. В ряде работ изучалось влияние гуминовых веществ и подобных органических молекул на токсичность и биодоступность металлов как для макро- [55], так и микроводорослей [18, 38]. Отдельно изучалось влияние РОВ и, в частности, гуминовых веществ на скорость роста водорослей [33, 44, 56]. Влияние фракций РОВ на рост водорослей изучен недостаточно, а исследований влияния фракций РОВ разной молекулярной массы на изменения токсичности тяжелых металлов по отношению к водорослям ранее не проводилось.

Таким образом, для оценки потенциальной токсичности кадмия в природных водах необходимо понимание роли различных фракций органических веществ в токсичности металлов.

В данной работе было изучено влияние пяти фракций РОВ, выделенных с использованием метода ультрафильтрации, на рост Scenedesmus obliquus (Turpin) Kuetzing, 1883. Также было исследовано влияние этих фракций на токсичность кадмия по отношению к S. obliquus.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

РОВ представлено гуминовой кислотой (cas № 1415-93-6, Aldrich), растворенной в 0.01 М NaOH с последующим доведением раствора до pH 7 с помощью 1 M HCl. Основные химические характеристики использованного препарата (Sigma-Aldrich): С – 68.98%, Н – 5.26%, N – 0.74%, S – 4.24% и О – 43.55% СООН-группы – 4.38 ± 0.03 мэкв/г, ОН-фенольные группы – 2.71 ± 0.03 мэкв/г [23, 37]. Дополнительная информация о структуре этой кислоты и ее фракций, полученных методом ультрафильтрации, приведена в следующих работах [16, 23].

Фракционирование РОВ по молекулярным весам. Для дополнительной очистки РОВ перед фракционированием проба была пропущена через фильтр 0.2 мкм. Фракционирование РОВ проводили методом ультрафильтрации с помощью установки фирмы Amicon и фильтров Millipore с размером пор 1, 3, 10 и 30 кДа. В эксперименте исследовали исходное РОВ (РОВ_НФ), а также его фракции: <1 кДа (РОВ_<1 кДа), 1–3 кДа (РОВ_{1–3 кДа}), 3–10 кДа (РОВ_{3–10 кДа}), 10–30 кДа (РОВ_{10–30 кДа}), >30 кДа (РОВ_{>30 кДа}). Концентрации фракций РОВ считали по органическому углероду, который определяли на жидкостном элементном анализаторе (LiquiTOC trace, Elementar).

Определение карбоксильных групп фракций РОВ. Расчет количества карбоксильных групп проводили с учетом их содержания 10 ммоль/г ГK [29].

Растворы ионов кадмия. В опытах по влиянию ионов Cd на рост водорослей использовали водные растворы CdСl₂ (рН 7). Контроль количества Cd²⁺ проводили на оптико-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой Agilent 5110 ICP-OES.

Анализ связанных форм кадмия с РОВ. С учетом химического состава растворов были выполнены расчеты форм кадмия в исследованных системах с использованием программы Visual MINTEQ ver. 3.1 [13] в сочетании с базой данных и моделями привязки гуминовых веществ NICA-Donnan для вариантов с РОВ.

Водоросли. В качестве объекта исследования выбрана пресноводная зеленая водоросль Scenedesmus obliquus (Turpin) Kutzing. Этот вид широко распространен в природе и является типичным объектом для биоиндикации и биотестирования. Предварительное культивирование альгологически чистой культуры водорослей проводили на среде Тамия в разведении 1/2. Состав среды: KNO₃ – 5 г/л, MgSO₄∙7H₂O – 2.5 г/л, KH₂PO₄ – 1.25 г/л, FeSO₄∙7H₂O – 0.003 г/л, Na₂ЭДТА – 0.037 г/л, раствор микроэлементов – 1 мл/л. Раствор микроэлементов (состав): H₃BO₃ – 2.86 г/л, MnCl₂∙4H₂O – 1.81 г/л, ZnSO₄∙4H₂O – 0.222 г/л, MoO₃ – 176.4 мг/10 л, NH₄VO₃ – 229.6 мг/10 л.

Для проведения экспериментов с добавлением солей тяжелых металлов и РОВ водоросли пересаживали на среду Тамия в разведении 1/40, из которой были удалены фосфаты и Na₂ЭДТА. Такая среда необходима, так как при увеличении содержания в воде кальция, магния и фосфатов токсичность солей тяжелых металлов для большинства видов водорослей уменьшается. Na₂ЭДТА способна сорбировать соли тяжелых металлов [2, 36]. Токсичность также зависит от кислотно-щелочных условий. Для поддержания постоянных значений рН в среду был добавлен буферный раствор HEPES. Конечная концентрация HEPES в среде 10^–3 М. рН среды составлял 7.5. Водоросли выращивали в конических колбах объемом 50 мл при непрерывном облучении светодиодными лампами (LED) интенсивностью 20 мкМ квантов/(м² с) при температуре 22°С в накопительной культуре. Для определения относительного содержания хлорофилла а измеряли спектры его поглощения в суспензии водорослей в диапазоне от 350 до 850 нм на однолучевом спектрофотометре с интегрирующей сферой на базе спектрометра USB2000 (Ocean Optics, USA). Спектр поглощения суспензии водорослей вычисляли из двух спектров ослабления света, полученных при установке кюветы с образцом на разных расстояниях от интегрирующей сферы, что позволяло определить и рассеяние света на образце [27]. Относительное содержание хлорофилла определяли из вычисленных спектров как значение оптической плотности на длине волны 678 нм (максимум поглощения хлорофилла). Известно, что существует прямая корреляция между численностью в культуре водорослей и содержанием хлорофилла а. Для выяснения зависимости между относительным содержанием хлорофилла а и численностью водорослей в пробе была проведена калибровка. Для этого численность определяли методом прямого счета клеток в камере Горяева. Начальная концентрация водорослей в экспериментах составляла 0.075–0.11 единиц оптической плотности на длине волны 678 нм, что соответствовало численности 185–230 тыс. клеток/мл.

Постановка экспериментов. В исследованиях влияния РОВ_НФ на рост водорослей добавляли водные растворы РОВ, конечные концентрации были 0.001, 0.01, 0.1, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 50 мг/л. В контрольный вариант добавляли эквивалентное количество дистиллированной воды.

В исследованиях влияния Cd²⁺ на рост водорослей в опытные образцы добавляли водные растворы СdСl, в которых конечная концентрация Cd²⁺ была 5.62, 11.24, 22.5, 56.2, и 112.4 мкг/л. В контрольный вариант добавляли эквивалентное количество дистиллированной воды.

В исследованиях влияния фракций РОВ на рост водорослей добавляли водные растворы РОВ, их конечные концентрации были 0.001, 0.01, 0.1 и 1 мгС/л. В контрольный вариант добавляли эквивалентное количество дистиллированной воды.

В исследованиях с фракциями РОВ в присутствии Cd²⁺ на рост водорослей исследовали две концентрации металла 56.2 и 112.4 мкг/л и одну концентрацию органического вещества – 0.1 мг С/л. В контрольный вариант добавляли эквивалентное количество РОВ.

В экспериментах была трехкратная повторность для опытных вариантов и 12-кратная для контрольного варианта.

В исследованиях влияния связанных комплексов РОВ-Cd²⁺ на рост водорослей использовали растворы комплекса РОВ-Cd в соотношении 1 мг Сd²⁺ к 20 мг С_(РОВ). Мы исходили из того, что максимальная емкость связывания Cd²⁺ (поведение этого катиона в растворах гуминовых веществ сходно с поведением Cu²⁺) фульвокислотами, выделенными из поверхностных вод, составляет в зависимости от условий эксперимента 1/5 – 1/20 мгCd(II)/мгРОВ [26].

Концентрации комплексов составляли 5.62, 11.24, 22.5, 56.2 и 112.4 мкг/л в пересчете по кадмию. В контрольный вариант добавляли эквивалентное количество кадмия или РОВ. В эксперименте была трехкратная повторность.

Расчет максимальной удельной скорости роста. Измерения спектров поглощения хлорофилла проводили сразу после добавления токсикантов и гуминовой кислоты, через 24, 48 и 72 ч после начала инкубации. Максимальную удельную скорость роста водорослей определяли путем логарифмирования значений численности в экспоненциальную фазу роста. Значения скорости роста культуры соответствовали угловому коэффициенту линейного уравнения вида y = kx + b.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Доля фракций в РОВ и содержание карбоксильных групп в них. РОВ состоит преимущественно из фракции РОВ_{>30 кДа} (около 78%), которая содержала меньшее количество карбоксильных групп, чем остальные фракции (табл. 1). Достоверной разницы между содержанием карбоксильных групп в остальных фракциях не выявлено.

Влияние РОВ на рост водорослей. РОВ_НФ достоверно увеличивал скорость роста водорослей при концентрациях 0.25 и 1 мг/л на 9 и 19% соответственно. При концентрациях >30 мг/л происходило уменьшение скорости роста водорослей на 13–16% (рис. 1). В остальных вариантах достоверной разницы с контролем обнаружено не было. Слабовыраженная тенденция уменьшения скорости роста водорослей наблюдалась при воздействии сверхнизких доз РОВ (0.001 и 0.01 мг С/л).

Рис. 1.

Влияние РОВ_НФ на максимальную удельную скорость роста Scenedesmus obliquus.

Влияние фракций РОВ на рост водорослей. РОВ_{>30 кДа} подавляла рост водорослей в низких концентрациях (0.01 и 0.1 мг/л) и стимулировали при концентрации 1 мг/л. РОВ_{10–30 кДа} стимулировала рост водорослей при концентрации 1 мг/л. РОВ_{3–10 кДа} увеличивала рост водорослей при концентрации 0.001 и 0.01 мг/л. РОВ_{1–3 кДа} не влияла на рост водорослей во всех концентрациях, а РОВ_{<1 кДа} стимулировла рост водорослей во всех концентрациях (рис. 2). Разнонаправленное влияние на рост было просуммировано с учетом количества фракций в РОВ (табл. 1) и полученная теоретическая кривая доза-эффект хорошо совпала с практической кривой РОВ_НФ. Таким образом, биологическая активность РОВ_НФ может быть представлена как сумма биологических откликов индивидуальных фракций РОВ.

Рис. 2.

Влияние РОВ_НФ и фракций на изменение максимальной удельной скорости роста Scenedesmus obliquus. РОВ_НФ (сплошная линия) – фактические данные, РОВ_НФ (пунктирная линия) – теоретическая кривая на основе суммирования эффектов с учетом количества фракций в РОВ.

Влияние Cd на рост водорослей. Cd в концентрациях 5.6, 11.2 и 22.5 мкг/л стимулировал скорость роста водорослей на 9, 17 и 24% соответственно и подавлял рост при концентрации 56 и 112.4 мкг/л на 11 и 65% соответственно (рис. 3).

Рис. 3.

Влияние СdСl₂ на скорость роста Scenedesmus obliquus. Концентрация Cd, мкг/л: 1 – контроль, 2 – 5.62, 3 – 11.24, 4 – 22.5, 5 – 56.2, 6 – 112.4.

Влияния фракций РОВ на рост водорослей в присутствии Cd. Кадмий во всех вариантах эксперимента подавлял рост водорослей. Наличие в системе РОВ_НФ, РОВ_{>30 кДа}, РОВ_{1–3 кДа} и РОВ_{<1 кДа} достоверно увеличивало скорость роста S. obliquus. В присутствии РОВ_{10–30 кДа}, РОВ_{3–10 кДа} и 112 мкг/л Сd²⁺ рост водорослей полностью отсутствовал (рис. 4).

Рис. 4.

Влияние СdСl₂ на скорость роста Scenedesmus obliquus в присутствии 0.1 мг С/л РОВ и его фракций.

Влияние комплексов РОВ_НФ-Cd на рост Scenedesmus obliquus при разном разбавлении. Комплексы РОВ-Cd оказывали меньшее воздействие на рост водорослей, чем свободный Cd (рис. 5). Снижение токсичности Сd было не связано с биологической активностью РОВ_НФ.

Рис. 5.

Максимальная удельная скорость роста Scenedesmus obliquus в присутствии различных концентраций РОВ_НФ и Cd.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные в наших экспериментах кривые доза-эффект отличались от классических колоколообразных графиков, характерных для эссенциальных элементов: небольшой, плохо выраженный эффект ингибирования роста клеток водорослей в области сверхнизких концентраций РОВ_НФ сменялся слабым стимулированием роста и последующим ингибированием размножения клеток при концентрации РОВ_НФ больше 2.5 мг/л. Ранее в ряде работ отмечено негативное влияние РОВ в концентрациях <0.1 мг/л [43–45]. Негативное влияние высокой концентрации РОВ связывали с повреждением клеточной мембраны и усилением окислительного стресса у микроводорослей [56]. Однако присутствие в среде РОВ в концентрации до 2 мг/л стимулировало синтез хлорофилла и биомолекул [56], а также улучшало питание водорослей, облегчая за счет хелатирования микроэлементов их последующий транспорт в клетки [41]. В наших экспериментах из состава питательной среды был удален хелатирующий агент – ЭДТА, и функцию переносчика ионов Fe²⁺, Zn²⁺ и Mn²⁺ могли играть низкомолекулярные компоненты исходного РОВ_НФ. Вероятно, этим можно объяснить появление слабовыраженного оптимума на кривой доза-эффект при содержании РОВ_НФ около 1 мг С/л. При более высоких концентрациях РОВ_НФ может начинаться повреждение клеточных мембран и действие двух различных механизмов биологического влияния РОВ на клетку вызывает разнонаправленные отклики [56], поэтому, по-видимому, и наблюдаются неклассические кривые доза-эффект. Влияние разных по молекулярной массе фракций РОВ на рост водорослей было ранее исследовано на таких тест-объектах, как динофлагелляты [9, 15, 42], зеленые [50] и диатомовые [9] водоросли, на представителях Scenedesmus sp. такая работа проведена впервые. В одних публикациях отмечалось различное воздействие фракций на рост водорослей: негативное влияние фракций 1–10 кДа [9] и фракции <1 кДа по сравнению с высокомолекулярными фракциями [50], в других, напротив, не обнаружено различий в действии между гуминовыми и фульвокислотами [15].

Анализ представленных на рис. 2 данных позволяет выявить одну из причин, вызывающих эти противоречия, – величина и знак эффекта зависят от использованной в экспериментах концентрации РОВ. Например, при концентрации 0.1 мг С/л влияние РОВ на рост водоросли практически отсутствовало (исключение – фракция РОВ_{<1 кДа}). В то же время эффекты при содержании РОВ в среде 0.01 мг С/л в большинстве случаев максимальны и имеют различный знак: отрицательный для РОВ_НФ, РОВ_{>30 кДа}, РОВ_{10–30 кДа} и РОВ_{1–3 кДа} и положительный для РОВ_{3–10 кДа} и РОВ_{<1 кДа}. Максимальная амплитуда эффектов отмечается для фракций РОВ_{>30 кДа} и РОВ_{<1 кДа}.

Хорошее совпадение экспериментальной и расчетной кривых доза-эффект для фракции РОВ_НФ обусловлены в первую очередь тем, что на 80% она состоит из фракции РОВ_{>30 кДа}, но, вероятно, высокая степень аддитивности исключает наличие синергетических эффектов. Высокая биологическая активность РОВ_{<1 кДа} может быть также объяснена возможностью низкомолекулярных органических веществ легче проникать в клетку, участвуя в ее питании [4, 5, 7, 41].

Известно, что Cd подавляет рост водорослей, разрушая клетки и негативно влияя на метаболизм, однако сведений положительного влияния на рост, который мы наблюдали в эксперименте (рис. 3), крайне мало. Так, в концентрациях 46–123 мкг/л Cd стимулировал рост Scenedesmus protuberans [21], при концентрации 21 мкг/л возрастал рост Scenedesmus accuminatus var. biseratus [52], а концентрация 200 мкг/л не влияла на рост Schroederia setigera [28]. Механизмы процесса остаются малоизученными. Отмечалось, что среди родов Ankistrodesmus, Chlorella и Scenedesmus представители рода Scenedesmus являлись наиболее устойчивыми к загрязнению воды Cd [12]. Можно предположить, что при низких концентрациях микроэлементов в растворе (1/40 среды Тамия) ионы Cd²⁺, занимая отрицательно заряженные центры, ассоциированные с клеточной стенкой водоросли, могли хотя бы частично облегчать поступление Fe²⁺, Mn²⁺ и Zn²⁺ в клетку. В то же время низкая концентрация конкурирующих с Cd²⁺ ионов эссенциальных микроэлементов ограничивает верхний предел концентраций, при которых наблюдается стимулирующий эффект Cd: 22.5 мкг/л в наших экспериментах и 123–200 мкг/л зарегистрированная в работах, цитированных выше, в которых использовались стандартные питательные среды.

Имеется множество работ, посвященных изучению влияния РОВ на уменьшение токсичности и биодоступности Cd микроводорослям [20, 51]. Часть авторов описывала явление образованием комплексов Cd-РОВ в растворе и уменьшением доступности свободных ионов к клетке [20, 35], другие объясняли явление адсорбцией РОВ на поверхности клеток [30], что уменьшало количество адсорбционных центров для свободного металла. Некоторые авторы при работе со схожим по поведению ионом Сu²⁺ объясняли снижение токсичности металла защитой РОВ ферментативного аппарата водорослей, что приводило к уменьшению секреции биопленок по сравнению с вариантом Сu²⁺ без РОВ [39]. Имеются данные, что переход на миксотрофию вызывал большую резистентность к Cd у водорослей, чем чисто автотрофное питание [24]. Миксотрофия известна и для Scenedesmus obliquus [54].

Для оценки возможности образования в достаточном количестве комплексов Cd²⁺ c РОВ с помощью программы VisualMinteq ver. 3.1 и модели NICA-Donnan, описывающей взаимодействие ионов металлов с РОВ, были выполнены расчеты для концентрации фракций РОВ в среде 0.1 и 2.5 мг/л и соответствующего количества карбоксильных групп. Полученные результаты показывают, что в использованной культуральной среде доля комплексов Cd²⁺ c РОВ при концентрации последних 0.1 мг С/л равнялась 0.3%, а при 2.5 мг С/л – 10%. Все органическое вещество в растворе было связано в комплексы с катионами питательной среды: абсолютно доминировали комплексы с Mg²⁺, комплексы с Fe²⁺, Mn²⁺ и Zn²⁺ существовали в минорных количествах. Таким образом, основным механизмом уменьшения токсичности Cd в присутствии РОВ_{>30 кДа} не может быть объяснено связыванием ионов Cd² в растворе, а компенсация негативного влияния Cd²⁺ на клетки водоросли за счет положительной биологической активности РОВ возможно только для фракции РОВ < 1 кДа.

Можно предположить, что основным механизмом уменьшения токсичности Cd²⁺ является ограничение скорости переноса катиона через клеточную стенку к плазматической мембране из-за тех затруднений, которые возникают при связывании РОВ на поверхности клеток. Локализация гуминовых веществ на клетках может рассматриваться как один из механизмов проявления защитного действия этих полимеров на живые организмы [1]. Показано, что РОВ активно адсорбируется на микроводорослях [6], в количестве, близком для клеток бактерий [3]. Прокариоты связывают преимущественно высокомолекулярные фракции РОВ [25, 49] и, вероятно, это может быть справедливо и для водорослей.

Концентрация эссенциальных микроэлементов в очень разбавленных средах является величиной, по порядку близкой к концентрации исследуемого токсичного иона металла и концентрации отрицательно заряженных центров связывания ионов как в молекулах РОВ (СООН-группы), так и в клеточных стенках водоросли (те же СООН-группы). Поэтому наблюдаемые изменения в скоростях роста водоросли следует приписывать не только присутствию ионов Cd²⁺, но и возможному дефициту эссенциальных микроэлементов.

Эффект смягчения негативного действия Cd²⁺, вызванный присутствием в культуральной среде фракций РОВ_{>30 кДа} и РОВ_{<1 кДа} следует, вероятно, объяснять разными причинами. Сорбция высокомолекулярных фракций РОВ клеточными стенками водоросли тормозит перенос в клетку и ионов Cd²⁺, и ионов эссенциальных элементов. Напротив, низкомолекулярные компоненты РОВ, образуя комплексы с ионами микроэлементов, ускоряют их транспорт через клеточную стенку, улучшая снабжение клетки необходимыми элементами, смягчая таким образом негативный эффект присутствия в среде Cd²⁺.

Хорошо выраженная аддитивность действия различных фракций РОВ, полученная в описанных выше экспериментах, нарушалась с введением в раствор ионов Cd²⁺. Обращает внимание ярко выраженный отрицательный эффект присутствия в среде фракций РОВ_{10–30 кДа} и РОВ_{3–10 кДа} (рис. 4), в то время как на кривых доза-эффект какие-либо значимые эффекты для этих фракций не наблюдались (рис. 2). Возможно, причиной отклонения от простых закономерностей являлось значительное различие в константах устойчивости комплексов различных фракций РОВ с ионами металлов. Зависимость констант устойчивости РОВ с кадмием от молекулярной массы фракций, по-видимому, не линейна, например для Со [53] получен следующий ряд: k_{РОВ 5–10 кДа}$ \gg $ k_{РОВ < 5 кДа} > > k_{РОВ 30–100 кДа} > k_{РОВ 10–30 кДа} и определено, что низкомолекулярные фракции <10 кДа увеличивали выживаемость дафний в присутствии кобальта, а высокомолекулярные (30–100 и >100 кДа), напротив, подавляли их жизнедеятельность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование по влиянию Cd на рост водорослей в присутствии фракций РОВ разных молекулярных масс является первым исследованием на водорослях. Полученные данные свидетельствуют о том, что фракции РОВ могут как усиливать, так и уменьшать токсичность металла. Сложность изучения данного феномена заключается в разнообразии эффектов для РОВ и тяжелых металлов: Cd в микроконцентрациях может оказывать положительное влияние на рост водорослей, в то время как РОВ уже в концентрации 1 мкг/л – подавляет рост. Таким образом, исследования только чистых веществ и использование исключительно критерия скорости роста при оценке воздействия токсикантов на организмы, являются некорректным подходом, хотя они лежат в основе многих экотоксикологических тестов (например, OECD 201, ГОСТ 32293-2013). По-видимому, не совсем точно говорить о РОВ (или гуминовых веществах), как веществах, смягчающих стресс при рассмотрении воздействия на индивидуальную особь, и следует признать, что, находясь в естественных природных условиях, водоросли подвержены большему стрессу, нежели лабораторные культуры, в том числе под действием РОВ. На популяционном и экосистемном уровнях РОВ безусловно являются веществами, ослабляющими негативные эффекты, и при взаимодействии с металлами основным механизмом смягчения воздействия является связывание РОВ и их фракциями токсикантов в неактивные комплексы. На наш взгляд, перспективными являются работы по изучению адсорбционных явлений РОВ и прочих токсикантов на поверхности организмов. Адсорбция веществ на клетках микроорганизмов и ее изменение под действием природных факторов может являться важным фактором устойчивости природных экосистем.