Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования, 2022, № 12, стр. 3-7

ВВЕДЕНИЕ

Липоксигеназы – это класс ферментов, катализирующих реакцию диоксигенации полиненасыщенных жирных кислот. Липоксигеназы являются железосодержащими белками, в которых ион железа расположен в активном центре фермента и необходим для катализа [1]. Липоксигеназы обнаружены у животных, растений и грибов [1]. Несмотря на такую широкую распространенность, функции липоксигеназ в живой клетке и механизм липоксигеназной реакции изучены не до конца [2, 3]. Тем не менее считают, что липоксигеназы человека принимают участие в процессе ферроптоза – программируемой гибели клеток, когда происходит зависимое от железа перекисное окисление липидов [4, 5]. Также считают, что с ферроптозом ассоциирован ряд патологических состояний, например, некоторые болезни мозга, в том числе болезни Паркинсона и Альцгеймера [6–8]. Таким образом, изучение процесса ферроптоза является значимой научной задачей. Известна пространственная структура липоксигеназы человека LOX-15 [9]. Она состоит из двух доменов – малого b-домена и большого а-спирального каталитического домена. Липоксигеназа человека – это мембранно-ассоциированный белок. Предположительно, он выполняет свою роль в комплексе с белком-партнером [9]. Исследование функций такой системы экспериментальными методами представляет собой чрезвычайно сложную задачу. Однако возможно использовать для исследования свойств и функций такого комплекса методы вычислительной биологии. Например, применяя метод молекулярного докинга и молекулярной динамики, можно построить модель исследуемой системы и изучить ее структуру и динамические свойства. С помощью комбинированного метода квантовой и молекулярной механики можно промоделировать катализируемую ферментом реакцию, детально изучив таким образом механизм катализа [10]. Однако для металлсодержащих ферментов обычно требуется предварительное построение модели металлсодержащего сайта [11]. Такая модель может быть построена с использованием методов квантовой химии [11]. В настоящей работе была получена модель квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) активного сайта липоксигеназы LOX-15. Методом молекулярной динамики показано, что такая модель более стабильна и больше подходит для изучения механизма функционирования фермента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве начального анализа траекторий были рассчитаны среднеквадратичное отклонение RMSD (root-mean-square deviation), радиус гирации R_g и среднеквадратичные флуктуации RMSF (root-mean-square fluctuations) для каждой из моделируемых систем. На рис. 1 показаны графики среднеквадратичных отклонений для классической и гибридной системы. Видно, что отклонения находятся в диапазоне 0.1–0.18 нм, что с учетом их размера говорит о стабильности моделируемых систем. На рис. 2 представлены графики радиуса инерции для каждой из систем. Из рисунка видно, что компактность систем существенно не меняется в процессе моделирования. На рис. 3 показаны среднеквадратичные флуктуации для атомов C-α каждой из систем. Из рисунка видно, что в районе 80–90 остатков имеется подвижный участок.

Рис. 1.

Среднеквадратичное отклонение RMSD для классической (а) и гибридной (б) систем.

Рис. 2.

Радиус гирации R_g для классической (а) и гибридной (б) систем.

Рис. 3.

Среднеквадратичные флуктуации RMSF для классической (а) и гибридной (б) систем.

Известно, что ион железа в молекуле липоксигеназы LOX-15 координируют три остатка гистидина: His378, His373 и His553 [9] (рис. 4). Поэтому для квантово-механической оптимизации были выбрани эти три аминокислотных остатка и ион железа. Примененный подход Кона–Шэма (B3LYP) представляет собой гибридный функционал, основанный на сочетании метода Хартри–Фока и теории функционала плотности с использованием обменно-корреляционного потенциала Беке–Ли–Янга–Парра [23, 24]. Данный подход наиболее распространен при решении задач в области квантовой химии применительно к макромолекулам, он дает высокую точность расчетов и предъявляет относительно низкие требования к вычислительным мощностям [25]. В результате расчетов были получены параметры силового поля для иона железа и координирующих его остатков. Для проверки полученной модели с помощью программы Amber [19] и силового поля ff14SB [20] была промоделирована молекулярная динамика липоксигеназы LOX-15 в течение 10 нс с использованием стандартной модели металлсодержащего сайта и модели КМ/ММ. Для оценки качества описания металлсодержащего сайта анализировали динамику расстояний от иона железа до координирующих его атомов азота гистидинов (рис. 5, табл. 1). Из таблицы видна тенденция к увеличению расстояния, а также к увеличению стандартного отклонения при использовании молекулярно-механической модели. Из этого следует, что координационная связь в случае стандартной молекулярно-механической модели присутствует не всегда, а также то, что металлсодержащий сайт относительно нестабилен. Рис. 5 подтверждает эти выводы. Например, видно, что для 553-го гистидина расстояние от координирующего атома азота до атома железа достигает в некоторых случаях 0.9 нм, что однозначно говорит о разрыве координационной связи. Для 373-го гистидина расстояние между ионом железа и координирующим атомом азота стабилизируется вблизи значения 0.411 нм со стандартным отклонением 0.034. Кроме того, из графиков можно видеть, что в случае применения молекулярно-механической модели наблюдается существенное отклонение расстояния между координирующими атомами азота и ионом железа в процессе моделирования от данных рентгеноструктурного анализа, что также говорит о том, что квантово-механическая модель более пригодна для исследования динамики LOX-15.

Рис. 4.

Ион железа и координирующие его аминокислотные остатки в активном центре липоксигеназы LOX-15.

Рис. 5.

Зависимость расстояния между атомом азота NE2 553-го (а, г), 373-го (б, д) и 378-го (в, е) гистидина и железом от времени в молекулярно-механической (а–в) и квантово-механической (г–е) моделях.