Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 3, стр. 275-282

МЕТОДИКА

Объекты исследования. Объектами исследования служили природные изоляты дрожжей, выделенные в сезоны виноделия 2016 и 2018 гг. из 101 пробы винограда, произрастающего в виноградо-винодельческих хозяйствах шести климатических зон Республики Крым [10] и Ростовской области (Россия). Количество отобранных штаммов дрожжей зависело от количества исследованных виноградных участков климатической зоны и сортового состава винограда. Контролем служил селекционный штамм I-329 из коллекции микроорганизмов виноделия “Магарач” (КМВ “Магарач”, Россия), применяемый в производстве вин типа Херес.

Выделение природных штаммов дрожжей. Здоровые неповрежденные ягоды винограда отделяли от гребней, дробили и оставляли на 4 ч. Полученную мезгу отжимали, сусло разливали в склянки, закрытые ватно-марлевой пробкой. Через 48 ч после начала брожения пробы сусла высевали на агаризованное виноградное сусло и инкубировали при 26 ± 0.5°С. Характерные для дрожжей-сахаромицетов колонии переносили в пробирки с виноградным суслом и культивировали при температуре 26 ± ± 0.5°С до появления признаков брожения.

Среда и условия культивирования. Среда и условия культивирования описанные ранее [7] соответствовали требованиям и рекомендациям по приготовлению вин типа херес [11]. Дрожжи культивировали при 18 ± 0.5°С в пастеризованном виноградном сусле из винограда сорта Алиготе с массовой концентрацией сахаров 210 г/л, титруемых кислот 7.0 г/л и рН 3.2. Для инокуляции использовали 2-суточную дрожжевую разводку в физиологически активном состоянии, содержащую 60–80 млн кл/мл, количество почкующихся клеток не менее 30% и мертвых клеток не более 2% [1].

Морфологию и физиологическое состояние клеток описывали при микроскопировании на стадии активного роста (2–3-суточная культура), осадок – визуально на стадии осветления выбродившего сусла. Размеры клеток определяли по цифровым изображениям, используя световой микроскоп XY-B2 (“Ningbo Sunny Instruments”, Китай) и компьютерную программу “Image Scope M”.

Бродильная способность штаммов. Бродильную способность оценивали при культивировании на пастеризованном виноградном сусле в колбах объемом 100 мл. В сусло вносили дрожжевую разводку из расчета 2 × 10⁶ кл/мл, закрывали бродильными затворами и инкубировали при 18 ± 0.5°С, ежедневно взвешивая. По окончании процесса брожения (отсутствие изменения массы) в виноматериалах определяли концентрацию сахаров, спирта, летучих кислот и альдегидов.

Способность штаммов образовывать сероводород. Способность к выделению сероводорода изучали на плотной питательной среде BIGGY (“Merck”, Германия) [12]. Посевы культивировали в течение 24 ч при температуре 30°С. Присутствие H₂S в среде оценивали визуально, используя следующую шкалу: белый цвет – сероводород не образуется; светло-коричневый цвет – низкое образование сероводорода; темно-коричневый цвет – среднее образование сероводорода; черный цвет – высокое образование сероводорода.

Способность штаммов к пленкообразованию. Способность штаммов к пленкообразованию определяли по росту пленки на поверхности сброженного сусла. В лабораторных условиях пастеризованное виноградное сусло сбраживали в склянках объемом 100 мл, в условиях микровиноделия использовали свежеотжатое сусло, которое сбраживали в 3-литровых баллонах. Образцы закрывали ватно-марлевыми пробками и инкубировали при 18 ± 0.5°С. Разводку дрожжей вносили в количестве 2%. Рост пленки на поверхности фиксировали ежедневно после окончания брожения: начало роста – при наличии первых островков, окончание – при зарастании всей поверхности. Состояние пленки оценивали визуально [7].

Энологические свойства. При проведении исследований были использованы подходы и методы, общепринятые в микробиологии виноделия. Дрожжи оценивали по показателям, принятым при проведении селекции промышленных штаммов дрожжей для производства виноградных вин [11].

Аналитические исследования. Массовую ко-нцентрацию летучих кислот определяли по ГОСТ 32001-2012, массовую концентрацию альдегидов по ГОСТ 12280-75. Содержание остаточных сахаров и этилового спирта определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Supelcogel C610H на хроматографе LC Prominence (“Shimadzu”, Япония).

Таксономическая идентификация природных штаммов и их генотипирование по ITS маркерам. Предварительную идентификацию изолятов на принадлежность к роду Saccharomyces проводили классическими методами по стандартным характеристикам: морфология клеток, способ вегетативного размножения, способность к спорообразованию, морфология аскоспор [13]. Выделение препаратов ДНК из клеток дрожжей осуществляли по методике, описанной ранее [7]. Для молекулярно-генетической идентификации и отнесения к “винным” или “хересным” штаммам дрожжей использовали метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ПЦР-фрагментов участков повтора рДНК, включающих два “внутренних транскрибируемых спейсера” (ITS1 и ITS2) и ген 5.8 рРНК [14]. Для ПЦР использовали праймеры Its1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') и Its4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Полученные фрагменты обрабатывали рестриктазой HaeIII и после анализа электрофореграмм относили штаммы к “винным” или к “хересным”. Для “винных” штаммов дрожжей S. cerevisae характерно образование фрагментов размером 311, 230, 172 и 128 п.н., а для “хересных” – 311, 230, 148 и 129 п.н. Для отнесения “хересных” штаммов дрожжей S. cerevisae к “французскому” или “испанскому” типу проводили обработку ПЦР-фрагментов рестриктазой HhaI. Для “испанских” аллелей характерно образование фрагментов размером 342, 340 и 133 п. н., для “французских” – 364, 336 и 132 п. н. [14]. Если полученные в результате ПДРФ анализа фрагменты по длинам не были характерны для дрожжей вида S. cerevisae, то эти ПЦР-фрагменты секвенировали по методу Сенгера на ABI 3730 (“Applied Biosystems”, США) и проводили таксономическую идентификацию штамма на основе анализа полученных последовательностей.

Анализ полиморфизма промотора гена FLO11. Штаммы, несущие “полноразмерный” и “укороченный” (делеция размером 111 п. н.) варианты промотора гена FLO11, выявляли методом ПЦР-анализа с праймерами Flo11D.REV (5'-TTTGGGCGACATTTTCTTGT-3') и Flo11D.FOR (5'-CCACGGGTGAGATTTGTTCT-3'). Регистрировали образование фрагментов размером около 400 или 300 п. н., характерных для этих двух аллелей гена FLO11, “хересного” и “винного” соответственно [15].

Анализ полиморфизма гена YDR379C-A. Для выявления штаммов с винными и хересными аллельными вариантами данного гена использовали ПДРФ-анализ ПЦР-фрагментов, полученных с праймерами F_sdh6 (5'-TCGCGTCAACTTGTTTTGAG-3') и R_sdh6 (5'-ATTCGTCAGTTCAGGGTG TGA-3'). Фрагменты, имевшие длину 885 п. н., обрабатывали рестриктазой AflIII [16]. Для “хересных” аллелей наблюдали образование фрагментов 500 и 385 п. н. У “винных” аллелей размер фрагмента оставался неизменным.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация природных изолятов дрожжей и формирование рабочей коллекции штаммов рода Saccharomyces. Из 101 пробы винограда выделено и проанализировано 626 изолятов дрожжей. По результатам оценки их морфолого-культуральных свойств на принадлежность к роду Saccharomyces отобрали 102 штамма дрожжей (табл. 1), для которых отмечена морфологическая однородность и спорообразование. Клетки дрожжей округлой, яйцевидной и овальной формы, средних и крупных размеров, округлые – (5.35 ± 0.34) мкм; яйцевидные – (4.05 ± 0.85) × (5.65 ± 0.5) мкм и овальные – (7.15 ± 0.66) × (3.54 ± 0.58) мкм; размножение почкованием, споры округлые гладкие, от 1 до 4 в аске. Необходимо отметить, что многие природные штаммы дрожжей отличаются дефектами споруляции, а в асках часто содержится менее 4 спор [17].

Генотипирование отобранных штаммов дрожжей. Генотипирование на основании анализа участка межгенного спейсера рДНК подтвердило принадлежность 96 из 102 отобранных штаммов к виду S. cerevisiae. По данным секвенирования ITS последовательностей остальные 6 штаммов были отнесены к видам Starmerella bacillaris (1 штамм), Lachancea thermotolerans (3 штамма) и Torulaspora delbrueckii (2 штамма). Эти виды часто встречаются в природе на поверхности ягод винограда [18]. Таким образом, была сформирована рабочая коллекция из 96 штаммов дрожжей S. cerevisiae.

По данным анализа ITS локуса 82 штамма имели последовательность, характерную для “винных” штаммов и 14 – для “французских хересных” [14], а “испанских хересных” аллелей у анализируемых штаммов обнаружено не было (табл. 2).

Для многих “хересных” штаммов характерна делеция размером 111 п. н. в положении от [–1313] до [–1203] промотора гена адгезина FLO11, приводящая к усилению его экспрессии [15]. Такая делеция присутствовала у 4 штаммов, а еще 7 штаммов были гетерозиготными (табл. 2). По-видимому, штаммы с гетерозиготными аллелями были диплоидами или полиплоидами, что достаточно широко распространено среди природных и промышленных штаммов [19].

Также для генотипирования использовали ПДРФ маркер локуса YDR379C-A, разработанный на основании сравнения геномов хересных и винных штаммов. Данный локус, кодирующий SDH6-субъединицу митохондриальной сукцинатдегидрогеназы, содержит полиморфизмы, характерные для хересных штаммов дрожжей [16]. Один из SNP приводит к образованию у хересных штаммов сайта AflII, что позволяет отличать “хересные” аллели от “винных” методом ПДРФ. Специфические для хересных дрожжей аллели гена YDR379C-A были выявлены у 17 штаммов, при этом 3 штамма были гетерозиготными (табл. 2).

Пять штаммов (№ 3, 23, 109, 111, 113) оказались “хересными” по всем трем маркерам и могли оказаться перспективными для дальнейшей селекционной работы.

Энологическая характеристика выделенных штаммов дрожжей на стадии сбраживания виноградного сусла. Паспортизация промышленно-ценных культур винных дрожжей, наряду с общепринятыми микробиологическими подходами, предполагает исследование их свойств, соответствующих технологии получения вин определенного типа. При рекомендации штаммов для виноделия, прежде всего, исследуют их бродильную способность и образование ими летучих кислот. Низкая бродильная активность штаммов, связанная с неполным выбраживанием сахаров виноградного сусла, может быть одним из факторов, отрицательно влияющим на формирование пленки [20]. Активность гена адгезина FLO11, играющего ключевую роль в формировании дрожжевой пленки, подавляется, когда в среде присутствует глюкоза [21].

Энологические характеристики определяли для 28 штаммов, имевших “хересный” аллель хотя бы в одном из трех локусов, по которым проводили генотипирование (табл. 2). Исследование их бродильной способности показало, что штаммы в оптимальные для виноделия сроки полностью сбраживали сахар с образованием спирта в диапазоне 12.1–13.1 об. %. Отмечены существенные отличия штаммов по синтезу летучих кислот, количество которых в виноматериалах варьировало от 0.21 до 0.90 г/л (табл. 3).

Одним из основных критериев при выборе штамма дрожжей для первичного виноделия является его способность при брожении образовывать сероводород. Образование сероводорода при брожении виноградного сусла во многом зависит от штамма дрожжей и относится к наследственным признакам [23]. Однако присутствие сероводорода в вине в количествах, превышающих порог вкусовой чувствительности, может привести к появлению посторонних тонов [22]. Способность к образованию сероводорода при брожении виноградного сусла во многом зависит от штамма дрожжей и является наследственным признаком [23]. Исследование способности выделенных штаммов к образованию H₂S (по его наличию в питательной среде) показало, что 13 изолятов не проявляли заметной способности к его синтезу, 7 изолятов являлись слабыми продуцентами, а 8 изолятов характеризовались как среднеактивные продуценты.

Важной отличительной особенностью хересных дрожжей является их способность к поверхностному росту на виноматериале. Исследование этой способности у 28 отобранных штаммов показало, что 21 штамм из них образовывал пленку на поверхности сброженного сусла (табл. 3).

Для хересных виноматериалов основным технологическим показателем является концентрация альдегидов, количество которых при удалении виноматериала из-под пленки должно составлять не менее 350 мг/дм³. Штаммы хересных дрожжей могут значительно отличаться по образованию альдегидов и способствовать накоплению в виноматериале альдегидов, содержание которых может достигать 900 мг/дм³ [7]. Исследуемые штаммы обладали различной способностью к синтезу альдегидов. Так, в сброженном сусле содержание альдегидов составляло от 27.8 (№ 52) до 283.4 мг/л (№ 109). При последующей двухмесячной выдержке образцов наблюдали увеличение количества альдегидов у 17 штаммов дрожжей, проявивших способность к поверхностному росту (табл. 3). Максимальный прирост альдегидов в образцах (около 700 мг/л) был отмечен для дрожжей с высокой пленкообразующей способностью, а отсутствие заметных изменений – дрожжей, не образовавших пленку.

Отбор перспективных штаммов S. cerevisiae для производства вин типа Херес. Для выбора перспективных для производства хересных вин штаммов дрожжей-сахаромицетов были проанализированы результаты молекулярно-генетических исследований (табл. 2) и энологические характеристики (табл. 3) 28 штаммов, имеющих “хересные” аллели.

Исследование энологических свойств образцов виноматериалов показало, что все они соответствовали требованиям, предъявляемым к виноматериалам для получения вин типа Херес.

Из 11 штаммов, имеющих хересные аллели (в гомо- или гетерозиготном состоянии) по гену FLO11, 10 проявляли способность к образованию пленки на поверхности виноматериала. Из 20 штаммов, имеющих хересные аллели по маркеру YDR379C-A, 16 – также обладали способностью образовывать пленку. При выдержке под пленкой штаммы проявляли различную способность к накоплению альдегидов.

По результатам генетических исследований и оценки энологических свойств из 28 генетически “хересных” штаммов было отобрано 5 (№ 3, 23, 109, 111 и 113), характеризующихся наличием хересных аллелей для трех локусов, способностью к поверхностному росту на сброженном виноградном сусле и образованию альдегидов в процессе выдержки.

Апробация штаммов дрожжей в условиях микровиноделия. Отобранные в лабораторных условиях штаммы № 3, 23, 109, 111 и 113 были испытаны в условиях микровиноделия. Проводили контроль выбраживания сахаров, начала роста пленки и момента полного покрытия ею поверхности сброженного сусла. На данном этапе штамм № 109 был снят с эксперимента из-за появления при брожении сусла посторонних тонов. Показатели скорости поверхностного роста у штаммов оказались близкими (табл. 4). Так, начало поверхностного роста дрожжей с момента окончания брожения составило в среднем 10 сут, а полное зарастание поверхности сброженного сусла – 10–13 сут. По пленкообразующей способности опытные штаммы были близки к контрольному, за исключением штамма № 113, сформировавшего пленку на 7 сут позднее. По химическому составу и органолептической оценке виноматериалы, выдержанные под пленкой, отвечали требованиям, предъявляемым к биологически выдержанным виноматериалам (табл. 5).

В дальнейшем пленки с поверхности сброженного виноградного сусла были использованы в качестве посевного материала на поверхность виноматериала, сброженного винными дрожжами. Такой способ инокуляции предусматривается технологией производства вина типа Херес пленочным способом. У всех 4 штаммов подтвердилась способность к пленкообразованию и в таких условиях (табл. 4).

С учетом энологических исследований в условиях микровиноделия сезона 2019 г. из 5 штаммов два (№ 3 и 23) были отнесены к наиболее перспективным для дальнейшей производственной селекции. Таким образом, подход, основанный на первичном отборе штаммов, имеющих генетические маркеры “хересных” дрожжей, с последующим изучением их энологических свойств, можно предложить в качестве перспективного при селекции новых штаммов хересных дрожжей для совершенствовании технологии производства вин типа Херес.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 16-16-00109).