Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2019, T. 105, № 9, стр. 1163-1170

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было проведено на 36 нелинейных крысах-самках массой 200–250 г. Животные содержались в виварии, оборудованном согласно требованиям “Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)” № 1045-73. Исследования осуществляли в соответствии с “Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях” от 18 марта 1986 г., Приказу Минздрава России № 119н от 01.04.2016 “Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики” и рекомендациям Комиссии по биоэтике ННГУ.

Для моделирования артериальной гипертензии животным на протяжении 30 дней вводили внутрибрюшинно преднизолон в дозировке 6 мг/кг с одновременным принудительным выпаиванием 5 мл солевого раствора (NaCl 2.3%, KCl 7.7%) [11]. Мониторинг артериального давления осуществляли 1 раз в неделю с помощью системы неинвазивного измерения кровяного давления грызунов “Систола” (Россия). В качестве антигипертензивного средства использовали фентиаприл, который вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг. Контролем служили интактные животные (1 группа) и животные с гипертензией без использования препарата (2 группа).

Забор крови проводили из подъязычной вены через 30, 60 мин и 24 ч после введения препарата. Исследовали динамику изменения электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ), их агрегационной способности, концентрации АТФ и 2,3ДФГ в эритроцитах, активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию малонового диальдегида (МДА), количество эритроцитов и гемоглобина, объем эритроцитов, содержание гемоглобина в одном эритроците, гематокрит.

Определение ЭФПЭ проводили микроэлектрофорезом с использованием цитометра в нашей модификации [12]. Суспензию эритроцитов (0.1%) помещали в трис-НСl буфер (рН 7.4) и фиксировали перемещение клеток при силе тока 8 мА. Величину ЭФПЭ определяли по формуле: U = S/TH, где S – расстояние, на которое перемещались клетки, Т – время перемещения клеток на расстояние S, Н – градиент потенциала. Агрегацию эритроцитов изучали методом оптической микроскопии путем подсчета одиночных эритроцитов и их агрегатов [13]. Содержание 2,3-ДФГ и АТФ в суспензии отмытых эритроцитов исследовали неэнзиматическим методом, определяя неорганический фосфор в гидролизатах эритроцитов фотоэлектроколориметрически [14]. Активность ПОЛ оценивали по концентрации МДА. Концентрацию МДА определяли по образованию окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 530 нм при реакции с тиобарбитуровой кислотой. Для расчета концентрации МДА использовали коэффициент молярной экстинции E = 1.56 × 10^–5 М^–1 см^–1 [15]. С использованием гематологического анализатора Abacus Junior 30 (Австрия) определяли количество эритроцитов, объем эритроцитов, абсолютное содержание гемоглобина, содержание гемоглобина в одном эритроците, гематокрит.

Полученные данные были обработаны с помощью пакетов прикладных программ BIOSTAT и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики. Результаты представлены в виде М ± m, где М – среднее арифметическое, m – стандартная ошибка среднего. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований было показано, что в контрольной группе животных при моделировании АГ наблюдалось усиление агрегационной способности эритроцитов на 33.7% и снижение ЭФПЭ на 30% (р ≤ 0.05) относительно значений интактных животных (табл. 1). Использование фентиаприла приводило к статистически значимому постепенному повышению доли неагрегированных эритроцитов на протяжении всего исследования, которое при этом не достигало значений интактной группы. Увеличение ЭФПЭ регистрировалось с 30 мин до 1 ч, с последующим его понижением к 1 суткам исследования. Следует отметить, что к 1 ч увеличение ЭФПЭ было выше значений интактной группы на 18%.

Исследование метаболических характеристик эритроцитов показало, что при моделировании АГ у крыс был выявлен рост содержания 2,3-ДФГ на 33.1%, тогда как концентрация АТФ в эритроцитах статистически значимо снижалась (табл. 1). Введение фентиаприла приводило к увеличению концентрации АТФ и 2,3-ДФГ выше значений группы 1 и 2 уже через 30 мин, эффект сохранялся к 1 суткам применения препарата. Исследование уровня содержания концентрации МДА в эритроцитах выявило, что в группе животных с АГ содержание данного показателя было выше значений интактной группы. При применении фентиаприла концентрация МДА на протяжении всего времени исследования была статистически значимо выше показателей групп 1 и 2.

Агрегация эритроцитов является одним из наиболее важных факторов, определяющим нарушение реологических свойств крови, возрастание общего периферического сопротивления и повышение артериального давления. Синдром повышенной вязкости крови и патологическую агрегацию эритроцитов можно рассматривать как типовой патологический процесс, в частности, патологическая агрегация эритроцитов выявлена в случае самых разных заболеваний, в том числе, и при АГ [16].

Существенное влияние на агрегационные свойства эритроцитов оказывает поверхностный отрицательный заряд эритроцитов, в основном определяющийся карбоксильными группами ацетилированных производных нейраминовых кислот (сиаловых кислот) [17]. Экспериментально измеряемой характеристикой поверхностного заряда является их ЭФПЭ. Введение фентиаприла для коррекции АГ восстанавливало показатель ЭФПЭ через 1 ч до относительной нормы, но выявленный эффект не сохранялся к 1 суткам наблюдения, что характеризовалось снижением показателя до уровня значений животных с АГ.

В свою очередь, на состояние эритроцитарной мембраны большую роль оказывают метаболические процессы в клетках и содержание таких органических фосфатов, как АТФ и 2,3-ДФГ [18]. Повышение содержания АТФ в эритроците ведет к фосфорилированию спектрина, анкирина и белка полосы 4.1, ослабляя белок-белковые взаимодействия [19]. Контролирует спектрин-мембранное соединение АТФ-зависимое фософорилирование белка полосы 4.1, катализируемое протеинкиназой С [20]. Активация протеинкиназ и фосфорилирование белков цитоскелета уменьшает общую стабильность мембраны [21]. Рост 2,3-ДФГ сопровождается диссоциацией спектрина, увеличением интегральной подвижности белков мембраны эритроцитов, увеличением площади клеток [22]. Увеличение органических фосфатов в эритроцитах при действии фентиаприла, вероятно, определяет повышение лабильности мембранных белков, что косвенно отражается на процессах агрегации клеток.

При этом следует отметить, что фентиаприл приводил к росту концентрации МДА в эритроцитах. Исследованиями доказано, что интенсификация процессов ПОЛ может влиять на структуру и барьерные свойства клеточных мембран, ответственных за транспорт Са²⁺, вызывая нарушение их нормального функционирования. В возникновении подобного рода повреждений существенную роль играют не только первичные, но и вторичные продукты свободнорадикального окисления, прежде всего соединения альдегидной природы – МДА и диеновые коньюгаты (ДК) [23, 24]. Модифицирующий эффект вторичных продуктов ПОЛ реализуется вазоконстрикцией артериол и повышением общего периферического сопротивления. В этом заключаются конкретные пути участия ПОЛ в патогенезе и прогрессировании АГ [25].

Известно, что в регуляции артериального давления, за счет своих вазодилятационных свойств, большое значение имеет монооксид азота (NO), который образуется клетками стенок кровеносных сосудов, фагоцитами, нервными клетками и др. Но в присутствии соединений, содержащих SH-группы (каптоприл, фентиаприл), из NO образуется радикал – NO•. Следует отметить, что NO• может участвовать в нефентоновском механизме образования гидроксильного радикала (ОН•), который обладает наиболее мощным цитотоксическим и деструктивным потенциалом. Один из путей естественного удаления избытка NO• – его связывание гемоглобином, когда образуется нитрозилгемоглобин с последующим окислением [26].

Данная направленность событий может отразиться на устойчивости эритроцитов и содержании гемоглобина. При исследовании морфологических показателей эритроцитов при моделировании АГ нами было выявлено, что количество эритроцитов и гематокрит увеличивались на 9% и 11.4% соответственно относительно значений интактной группы (табл. 2). Введение фентиаприла на фоне АГ вызывало снижение количества эритроцитов, гемоглобина, среднего содержания гемоглобина в эритроците и гематокрита относительно значений контрольной группы к 1 ч–1 суткам регистрации до значений интактной группы, тогда как средний объем эритроцита увеличивался.

Полученные результаты свидетельствуют, что использование фентиаприла снижало количество эритроцитов, возможно, за счет роста окислительных процессов в клетках, которые вызывают деструкцию клеточных мембран и нарушение работы клеточных насосов, что приводит к увеличению проницаемости мембран с последующим увеличением объема клеток.

При этом анализ АД животных выявил, что применение фентиаприла определило восстановление повышенного при АГ давления до значений интактной группы к 30 мин регистрации с последующим снижением к 1 ч (табл. 3). К 1 суткам АД, напротив, увеличивалось и превосходило значения интактной группы.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует, что действие фентиаприла в изменении АД может реализовываться через модификацию состояния эритроцитов. При этом наблюдается уменьшение агрегации и повышение отрицательного заряда эритроцитов, что способствует улучшению реологии крови и ее текучести. На фоне снижения агрегационных показателей эритроцитов происходит рост АТФ и 2,3ДФГ – органических фосфатов, определяющих фосфорилирование мембранных белков и увеличивающих их подвижность. При этом следует отметить, что рост концентрации МДА свидетельствует об усилении липопероксидации и снижении микровязкости липидного бислоя, что приводит к снижению устойчивости клеток и уменьшению их количества. Возможно, данный механизм также можно рассматривать в качестве компенсаторного фактора, который направлен на уменьшение содержания эритроцитов в кровотоке и соответственно снижение вязкости крови. В тоже время, из-за высоких концентраций переносимого кислорода и постоянных процессов оксигенизации–деоксигенизации гемоглобина в эритроцитах повышение образующихся активных форм кислорода может привести к негативным последствиям и из фактора адаптации перерасти в дизадаптацию. Так, повреждение белок-липидной структуры приводит к снижению элетроотрицательности мембран при действии фентиаприла к 1 суткам исследования до показателей животных с АГ, что сочетается с ростом АД. Учитывая отмеченное, важным, на наш взгляд, является подбор оптимальных концентраций препарата для достижения динамического равновесия в метаболическом статусе эритроцитов для достижения антигипотензивного действия.