1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова
  4. T. 106, № 2, 2020

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 2, стр. 224-230

Парвальбумин-содержащие энтеральные метасимпатические нейроны в постнатальном онтогенезе

А. Д. Ноздрачев 1, А. Ф. Будник 2, П. М. Маслюков 3, 4, *

1 Санкт-Петербургский государственный университет
Санкт-Петербург, Россия

2 Кабардино-Балкарский государственный университет им. Х.М. Бербекова
Нальчик, Россия

3 Ярославский государственный медицинский университет
Ярославль, Россия

4 Петрозаводский государственный университет
Петрозаводск, Россия

* E-mail: mpm@ysmu.ru

Поступила в редакцию 16.08.2019
После доработки 14.11.2019
Принята к публикации 22.11.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Кальций-связывающий белок парвальбумин селективно экспрессируется в различных популяциях нейронов центральной и периферической нервной системы. Локализация и процентный состав парвальбумин-иммунореактивных нейронов определялся в нейронах метасимпатических энтеральных узлов тонкой и толстой кишки у крыс разного возраста (1, 10, 20, 30, 60 сут и 2 года). В межмышечном сплетении парвальбумин-иммунореактивные нейроны выявляются в онтогенезе с момента рождения и до старости, при этом их процент в межмышечном сплетении тонкой кишки возрастает с 10 по 20 сутки жизни, в межмышечном сплетении толстой кишки – в первые 10 суток жизни. В подслизистом сплетении тонкой и толстой кишки у новорожденных крыс парвальбумин отсутствует и определяется с 10-х суток жизни. Процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов в послизистом сплетении увеличивается между 10-ми и 20-ми сутками жизни. При старении доля парвальбумин-иммунореактивных нейронов в межмышечном и подслизистом сплетениях достоверно не меняется. Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе происходит увеличение доли парвальбумин-иммунореактивных нейронов в интрамуральных метасимпатических узлах кишки. Вероятно, данное увеличение связано с буферной ролью парвальбумина в отношении ионов Са2+.

Ключевые слова: метасимпатическая нервная система, интрамуральные ганглии кишки, парвальбумин, кальций-связывающие белки, иммуногистохимия, онтогенез

Ионы кальция в нервной системе играют важнейшую роль в осуществлении различных физиологических процессов, в т.ч. в возрастных и стресс-индуцированных изменениях нейронов, секреции медиатора, в поддержании оптимального уровня нейропластичности [1, 2]. Ионы Са2+ могут связываться кальций-связывающими белками. При этом эти белки изменяют свою структуру и могут оказывать влияние на разнообразные процессы внутри клетки. Часть из них широко распространена, например, кальмодулин, обнаруженный почти во всех клетках животных и растений [3]. К наиболее распространенным в нервной системе относятся кальбиндин массой 28 кДа, кальретинин и парвальбумин [1, 4]. Кальбиндин и кальретинин обнаруживается в большом числе нейронов энтеральных интрамуральных метасимпатических узлов [5, 6]. Однако в отличие от кальбиндина данные по локализации парвальбумина в узлах автономной нервной системы в литературе немногочисленны [7–9].

Известно, что нейронная организация периферических узлов автономной нервной системы сопровождается возрастной перестройкой, сопровождающейся изменением морфологических и функциональных характеристик нейронов [10–12]. Установлено, что в энтеральных узлах в онтогенезе процентное содержание различных типов кальций-связывающих белков меняется. У крыс и кошек в ходе возрастного развития процент кальбиндин-имуннореактивных симпатических нейронов увеличивается с момента рождения до 10-х суток, а затем снижается до конца первого месяца жизни [4]. В тонкой кишке процент кальбиндин-имуннореактивных нейронов возрастал в первые 20 суток жизни, процент кальретинин-иммуннореактиных нейронов увеличивался в течение 2 месяцев жизни [13, 14].

Целью настоящего исследование явилось определение локализации и процентного соотношения парвальбумин-иммунореактивных нейронов подслизистого и межмышечного сплетения тонкой и толстой кишки в постнатальном онтогенезе.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на новорожденных, 10-, 20-, 30-, 60-суточных, 2-х-летних крысах (по 5 в каждой возрастной группе). На проведение исследования получено разрешение Этического комитета Ярославского государственного медицинского университета. После введения летальной дозы уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно), животных перфузировали транскардиально физиологическим раствором с гепарином, а затем фиксирующей смесью 4%-ного параформальдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4). После перфузии участки двенадцатиперстной и поперечно-ободочной толстой кишки длиной 0.5 см извлекались и помещались в ту же фиксирующую смесь, в которой производили перфузию, на 1–2 ч. Продольные серии срезов кишки толщиной 12 мкм изготовляли на криостате.

С целью выявления парвальбумина применялось двойное мечение соответствующими первичными кроличьими антителами фирмы Abcam (США, ab11427), разведение 1 : 500. Срезы преинкубировались в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% сыворотки, 1% тритона X-100, 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Затем срезы инкубировались с первичными антителами в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировались с ослиными вторичными антителами против кролика, конъюгированными с индокарбоцианином (Cy3, Jackson Immunoresearch, США, 711-165-152, разведение 1 : 150), дающим красную флуоресценцию. Для расчета процента иммунопозитивных нейронов, кроме меток к парвальбумину, производилось иммуномечение всей нейронной популяции при помощи антител морской свинки к протеиновому генному продукту 9.5 (Abcam, США, ab10410, разведение 1 : 300), вторичные ослиные антитела против морской свинки были конъюгированы с флуорохромом флуоресцином изотиоционатом (FITС, Jackson Immunoresearch, США, 706-095-148, разведение 1 : 150), дающим зеленую флуоресценцию.

Негативный контроль проводили путем преабсорбции первичного антитела с рекомбинантным парвальбумином (Abcam, ab69002) или отсутствием первичного антитела.

Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus BX43 (Токио, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Для анализа размеров и процентного соотношения иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Долю иммунопозитивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов, меченных протеиновым генным продуктом 9.5, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нервные клетки, срез которых прошел через ядро. Подсчет производили в 10 случайно выбранных измеренных областях (1 микроскопическое поле составляло 0.12 мм2) при 200-кратном увеличении у каждого животного в каждой возрастной группе. Среднее определяли путем усреднения пропорций, полученных от пяти животных.

Математическая обработка данных проведена с использованием пакетов прикладных программ Sigma Plot (StatSoft, США). Все величины представлены как средняя арифметическая ± ошибка среднего (М ± m). Достоверность различий средних величин определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с коррекцией Бонферрони. Достоверными считали различия при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты показали, что парвальбумин-иммунореактивные нейроны обнаруживались в тонкой и толстой кишке у крыс всех исследованных возрастов, начиная с момента рождения до старости. Иммунофлуоресценция наблюдалась главным образом в телах нейронов (рис. 1). Преабсорбция первичных антител с рекомбинантным парвальбумином (Abcam, ab69002), а также отсутствие первичных антител приводили к исчезновению парвальбумин-иммунореактивной флуоресценци.

Рис. 1.

Микрофотографии парвальбумин (ПБ)-ИР нейронов (указаны стрелками) тонкой кишки в межмышечном сплетении (A) новорожденных, (B) 2-хлетних, и подслизистом сплетении (C) 10-суточных и (D) 30-суточных крыс. Флюоресценция Сy3 (красный, ПБ), FITC (зеленый, PGP9.5). Масштаб: 50 мкм. Fig. 1. Micrographs of parvalbumin IR neurons (indicated by arrows) of the small intestine in the myenteric plexus of (A) newborns, (B) 2-year-old, and submucous plexus of (C) 10-day-old and (D) 30-day-old rats. Fluorescence of Cy3 (red, PB), FITC (green, PGP9.5). Scale: 50 mkm.

В межмышечном сплетении тонкой кишки у новорожденных и 10-суточных крысят процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов был небольшим. Доля парвальбумин-иммунореактивных нейронов достоверно увеличивалась между 10-ми и 20-ми сутками жизни (p < 0.001, табл. 1). В межмышечном сплетении толстой кишки процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов был низким, но значительно возрастал в первые 10 суток жизни (p < 0.001). Начиная с 10 суток жизни, процент таких нейронов в интрамуральных ганглиях межмышечного сплетения был достоверно больше в толстой кишке по сравнению с тонкой (p < 0.05).

Таблица 1.  

Процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов в интрамуральных ганглиях межмышечного сплетения тонкой и толстой кишки крыс разного возраста (n = 5 в каждой возрастной группе) Table 1.  The percentage of PB-IR neurons in the intramural ganglia of myenteric plexus in the small and large intestines of rats of different ages (n = 5 in each age group)

Возраст Age Тонкая кишка Small intestine Толстая кишка Large intestine
Новорожденный Newborn 28 ± 3.2 24 ± 3.2
10 суток 10-day-old 30 ± 4.2 71 ± 2.1*,**
20 суток 20-day-old 57 ± 2.3* 70 ± 4.2*,**
30 суток 30-day-old 54 ± 4.6* 68 ± 3.2*, **
2 месяца 2-month-old 58 ± 4.1* 69 ± 3.4*, **
2 года 2-year-old 59 ± 3.3* 69 ± 3.1*, **

* p < 0.01, различия достоверны по сравнению с новорожденными животными * p < 0.01, the differences are significant compared with newborn animals; ** p < 0.05, различия достоверны по сравнению с тонкой кишкой ** p < 0.05, differences are significant compared with the small intestine.

В подслизистом сплетении у новорожденных крысят парвальбумин не выявлялся, а определялся с 10-х суток жизни (табл. 2). В тонкой кишке процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов достоверно увеличивался между 10-ми и 20-ми сутками жизни (p = 0.03) и далее не изменялся (p > 0.05). При этом в тонкой кишке процент этих нейронов был достоверно большим по сравнению с толстой (p < 0.05) кишкой крыс разного возраста (n = 5 в каждой возрастной группе).

Таблица 2.  

Процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов в интрамуральных ганглиях подслизистого сплетения тонкой и толстой кишки крыс разного возраста (n = 5 в каждой возрастной группе) Table 2.  The percentage of parvalbumin-IR neurons in the intramural ganglia of submucous plexus of the small and large intestines of rats of different ages (n = 5 in each age group)

Возраст Age Тонкая кишка Small intestine Толстая кишка Large intestine
10 суток 10-day-old 72 ± 1.3 51 ± 2.3**
20 суток 20-day-old 82 ± 2.6* 62 ± 3.4 **
30 суток 30-day-old 82 ± 2.3* 63 ± 3.5**
2 месяца 2-month-old 84 ± 2.3* 61 ± 3.6 **
2 года 2-year-old 87 ± 5.3* 65 ± 5.3**

* р < 0.05, различия достоверны по сравнению с новорожденными животными * p < 0.05, the differences are significant compared with newborn animals; ** p < 0.05, различия достоверны по сравнению с тонкой кишкой ** p <.0.05, differences are significant compared with the small intestine.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе проведенного исследования нами впервые доказана локализация парвальбумина не только в нейронах центральной, но и автономной нервной системы, в том числе в нейронах интрамуральных узлов тонкой и толстой кишки. Предыдущие исследования не выявили парвальбумин в метасимпатических интрамуральных ганглиях органов пищеварения у разных животных: крысы, морской свинки и макаки-резус [7–9]. Вероятно, данные различия связаны с особенностями применяемых антител, различными видами животных и различными исследованными отделами пищеварительного тракта. Например, работа М. Schemann с соавт. [9] выполнена на желудке морской свинки, а структурно-функциональная организация метасимпатической энтеральной системы у разных животных, в т.ч. морской свинки с одной стороны, мыши и крысы с другой – существенно отличаются [15]. Исследование T. Endo и T. Onaya [7] проведено на крысе, но на тощей кишке, наша работа выполнена на двенадцатиперстной и поперечно-ободочной толстой кишке.

Результаты настоящей работы также свидетельствуют, что в раннем онтогенезе доля нейронов, экспрессирующих парвальбумин, увеличивается в подслизистом и межмышечном сплетениях тонкой и толстой кишки. Учитывая, что сходные процессы были ранее нами описаны в отношении других кальций-связывающих белков – кальбиндина и кальретинина [13, 14], можно предположить, что возрастное увеличение экспрессии нейрональных кальций-связывающих белков в раннем постнатальном онтогенезе носит более общий характер.

В отличие от кальбиндина и кальретинина, парвальбумин относится к медленным буферам [1, 16]. Одна из функций парвальбумина – участие в механизмах генерации ритма в нейронах с высокой частотой импульсации [17]. Нейроны с повышенным уровнем экспрессии парвальбумина обнаруживали большую устойчивость к гибели после неонатального повреждения аксонов [1].

В ряде работ установлена связь уровня кальбиндина и парвальбумина в нейронах и экспрессии кальциевых каналов. В нейронах гиппокампа мышей каналы Cav1.2 на ранних этапах развития экспрессируются в теле клетки, дендритах и аксоне. По мере взросления экспрессия в аксоне уменьшается и определяется только в теле клетки и дендритах [18]. В развивающихся нейронах при участии ионов кальция происходит регуляция роста нейронов и морфологической пластичности, в частности, конуса роста и развитие дендритов, что совпадает по времени с увеличением содержания кальций-связывающих белков [19]. На более поздних этапах постнатального развития нейронов интрамуральных узлов кальций-связывающие белки играют роль кальциевых сенсоров и участвуют в поддержании уровня кальция в клетках.

Согласно литературным сведениям процент кальбиндин-позитивных энтеральных нейронов был меньше у мышей, содержащихся в стерильных условиях [20, 21 ] . Т.к. заселение кишечника микрофлорой происходит после рождения, можно предположить, что микрофлора кишки оказывает влияние и на нейрохимический состав, в т.ч. на экспрессию кальций-связывающих белков, и изменения их экспрессии в онтогенезе могут быть связаны и с влиянием микробиоты.

Данные литературы свидетельствуют, что при старении процент парвальбумин-иммунореактивных нейронов в коре больших полушарий увеличивается [22 ] . Тем не менее, мы не обнаружили повышения доли парвальбумин-иммунореактивных нейронов у старых крыс.

Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе происходит увеличение доли парвальбумин-иммунореактивных нейронов в интрамуральных узлах кишки, что соответствует возрастным изменениям содержания других кальций-связывающих белков, в т.ч. кальбиндина и кальретинина в энтеральных узлах. Вероятно, данное увеличение связано с буферной ролью парвальбумина в отношении ионов Са2+. Возрастной инволюции парвальбумин-иммунореактивных нейронов кишки у старых крыс не отмечается.

Список литературы

  1. Schwaller B. The regulation of a cell’s Ca2+ signaling toolkit: the Ca (2+) homeostasome. Adv. Exp. Med. Biol. 740: 1–25. 2012.

  2. Simons M.J., Pellionisz A.J. Genomics, morphogenesis and biophysics: triangulation of Purkinje cell development. Cerebellum. 5: 27–35. 2006.

  3. Пермяков Е.А. Кальцийсвязывающие белки. М. Наука. 1993 [Permyakov E.A. Kaltsiysvyazyvayushchiye belki. [Calcium-Binding Proteins]. Moscow. Nauka. 1993 (In Russ)].

  4. Маслюков П.М., Ноздрачёв А.Д., Емануйлов А.И. Возрастные особенности экспрессии кальций-связывающих белков в нейронах ганглиев автономной нервной системы. Успехи геронтологии. 29(2): 247–253. 2016. [Masliukov P.M., Nozdrachev A.D., Emanuilov A.I. Age-related expression of calcium-binding proteins in autonomic ganglionic neurons. Adv. Gerontol. 29(2): 247–253. 2016. (In Russ)].

  5. Mitsui R. Immunohistochemical analysis of substance P-containing neurons in rat small intestine. Cell Tissue Res. 343(2): 331–341. 2011.

  6. Qu Z.D., Thacker M., Castelucci P., Bagyánszki M., Epstein M.L., Furness J.B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334(2): 147–161. 2008.

  7. Endo T., Onaya T. Immunohistochemical localization of parvalbumin in rat and monkey autonomic ganglia. J. Neurocytol. 17(1): 73–77. 1988.

  8. Celio M.R. Calbindin D-28k and parvalbumin in the rat nervous system. Neuroscience. 35(2): 375–475. 1990.

  9. Schemann M., Schaaf C., Mäder M. Neurochemical coding of enteric neurons in the guinea pig stomach. J. Comp. Neurol. 353(2): 161–178. 1995.

  10. Ноздрачев А.Д., Маслюков П.М. Возрастное развитие нейронов автономных ганглиев. СПб. Информ-Навигатор. 2014. [Nozdrachev A.D., Maslyukov P.M. Vozrastnoye razvitiye neyronov avtonomnykh gangliyev [Age development of autonomic ganglionic neurons]. SPb. Inform-Navigator. 2014 (In Russ)].

  11. Masliukov P.M. Sympathetic neurons of the cat stellate ganglion in postnatal ontogenesis: morphometric analysis. Auton. Neurosci. 89(1–2): 48–53. 2001.

  12. Маслюков П.М., Ноздрачев А.Д., Timmermans J.P. Возрастные особенности нейротрансмиттерного состава нейронов звездчатого узла. Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 92(2): 214–221. 2006. [Masliukov P.M., Nozdrachev A.D., Timmermans J.P. The age specifics of the neurotransmitter composition of the stellate ganglion neurons. Russ J. Physiol. 92(2): 214–221. 2006. (In Russ].

  13. Маслюков П.М., Будник А.Ф., Ноздрачев А.Д. Нейрохимические особенности узлов метасимпатической системы в онтогенезе. Успехи геронтологии. 30(3): 347–355 2017. [Masliukov P.M., Budnik A.F., Nozdrachev A.D. Developmental changes of neurotransmitter properties in sympathetic neurons. Adv. Gerontol. 30(3): 347–355. 2017. (In Russ)].

  14. Masliukov P.M., Moiseev K., Budnik A.F., Nozdrachev A.D., Timmermans J.-P. Development of calbindin- and calretinin-immunopositive neurons in the enteric ganglia of rats. Cell Mol. Neurobiol. 37(7): 1257–1267. 2017.

  15. Furness J.B. The enteric nervous system. Oxford. Blackwell Publishing, 2006.

  16. Permyakov E.A., Uversky V.N., Permyakov S.E. Parvalbumin as a Pleomorphic Protein. Curr. Protein Pept. Sci. 18(8): 780–794. 2017.

  17. Orduz D., Bischop D.P., Schwaller B., Schiffmann S.N., Gall D. Parvalbumin tunes spike-timing and efferent short-term plasticity in striatal fast spiking interneurons. J. Physiol. 591(Pt 13): 3215–3232. 2013.

  18. Obermair G.J., Szabo Z., Bourinet E., Flucher B.E. Differential targeting of the L-type Ca2+ channel alpha 1C (CaV1.2) to synaptic and extrasynaptic compartments in hippocampal neurons. Eur. J. Neurosci. 8: 2109–2122. 2004.

  19. Gasperini R.J., Pavez M., Thompson A.C., Mitchell C.B., Hardy H., Young K.M., Chilton J.K., Foa L. How does calcium interact with the cytoskeleton to regulate growth cone motility during axon pathfinding? Mol. Cell Neurosci. 84: 29–35. 2017.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал