Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 4, стр. 521-532

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ионный канал, проницаемый для молекулы АТР, должен иметь водную пору достаточно большого диаметра. Действительно, оценки минимального диаметра поры ионного канала, формируемого канальным белком CALHM1, дали величину 14 Å [21], что соответствует характерной размерности АТР. Поскольку при такой относительно большой поре ионные потоки через этот канал можно считать независимыми, нами было получено следующее транспортное уравнение для нестационарного потока анионов АТР J_ATP(V, t) (см. приложение):

где [ATP]_in – внутриклеточная концентрация ATP, V – трансмембранный потенциал, V₀ = RT/zF, G(V, t) – суммарная проводимость ATP-проницаемых каналов (далее АТР-проводимость) в момент времени t при потенциале V, L – константа. Следует отметить, что ATP может формировать комплексы с различными соединениями, включая основные моно- и дивалентные катионы цитоплазмы. Так, в случае простейшего внутриклеточного раствора, содержащего 1 мM MgATP и 145 мM KCl, при pH 6.8 и температуре 25°C концентрации основных ATP-ионов будут: [ATP^–4] = 170 мкМ, [KATP^–3] = 270 мкM, [HATP^–3] = 90 мкM и [MgATP^–2] = 460 мкМ. Как видно из приведенных оценок, основным АТР-анионом является комплекс MgATP^–2. Для простоты дальнейшего анализа будем считать, что АТР-проницаемый канал транспортирует АТР в форме MgATP^–2 [18]. В этом случае в уравнении (1) для z = 2V₀ = = RT/zF ≈ 13 мВ при 25°C.

СТАЦИОНАРНЫЙ СЛУЧАЙ

Для установившегося потока АТР транспортное уравнение имеет вид:

В стационарном состоянии вероятность открытого состояния как функция мембранного потенциала во многих случаях подчиняется уравнению Больцмана [22]

где P_o(V) – вероятность найти канал в открытом состоянии при потенциале V, P_max – максимальная вероятность открытого состояния, W – свободная энергия канала в отсутствие электрического поля, Q – эффективный воротный заряд. Поскольку интегральная проводимость G = P_oNγ, где N – число каналов проводимости γ, то для стационарной проводимости G_s(V) как функции потенциала справедливо выражение где G₀ = P_oNγ, V_g = W/Q, V_g0 = kT/Q. Параметры V_g и V_g0 определяют положение зависимости на оси потенциалов и крутизну перехода от минимальной к максимальной проводимости в области физиологических потенциалов. Оценки для Q, полученные для различных каналов варьируют в пределах от 2 до 13 элементарных зарядов [22–24]. Поскольку kT/e = 25.7 мВ при 25°C, то V_g0 варьирует в пределах 2–13 мВ. Таким образом, для стационарного потока АТР можно записать

В этом выражении множитель, назовем его фактор Гольдмана F_G,

получен из весьма общих соображений, отражает пренебрежимо малый уровень АТР во внеклеточном растворе и характеризует транспортные свойства большой водной порой, которые фактически не зависит от молекулярной организации остальной части канала. Иными словами, F_G фактически является физическим инвариантом и зависимость J_ATP(V) от молекулярной организации АТР-проницаемого канала проявляется в вариабельности параметров второго множителя, описываемого уравнением (4). Следует отметить, что уравнение (3) является адекватным приближением для вероятности открытого состояния лишь в частном случая ионного канала с двумя состояниями. Тем не менее, производное уравнение (4) хорошо аппроксимирует экспериментальную потенциал-зависимость интегральной проводимости, формируемую самыми разнообразными ионными каналами. В частности, стационарная интегральная проводимость изолированных вкусовых клеток, определяемая в эксперименте [18] (рис. 1А, кружочки) в среднем адекватно аппроксимируется уравнением (3) при V_g = 31 мВ и V_g0 = 11 мВ (рис. 1, черная кривая). Следует отметить, что в условиях диализа внутриклеточным раствором CsCl, выходящие ПЗ токи в клетках типа II (рис. 1А) преимущественно переносятся АТР-проницаемыми каналами [18], поэтому далее будем считать, что интегральная ПЗ-проводимость является адекватным приближением для АТР-проводимости.

Как проиллюстрировано на рис. 1А, фактор F_G (синяя кривая) уменьшается, а стационарная АТР-проводимость G_s увеличивается с ростом потенциала V. При значениях параметров V_g = 31 мВ и V_g0 = 11 произведение F_G и G_s дает колоколообразную зависимость, представленную черной кривой на рис.1Б. Следует отметить, что активность рекомбинантного АТР-проницаемого канала CALHM1 сильно зависит от экстраклеточного Са²⁺, так что в терминах уравнения (4) параметры интегральной проводимости, детерминируемой CALHM1, варьируют от V_g = –76 мВ и V_g0 = 40 мВ в отсутствие Са²⁺ до V_g = 82 и V_g0 = 16 мВ в присутствии 5 мМ Са²⁺ [25]. Поскольку в условиях плотно упакованной популяции клеток вкусовой почки электрическая активность клеток может приводить к заметным изменениям концентрации экстраклеточных ионов, включая Са²⁺, то потенциал-зависимость АТР-проводимости в клетках типа II может заметно варьировать. Мы проиллюстрировали эту возможность, используя транспортную модель в форме уравнения (5) и внося относительно небольшие “Са²⁺-индуцируемые” отклонения параметров уравнения (4). Так, при V_g = 25 мВ и V_g0 = 14 мВ, а также V_g = 40 мВ и V_g0 = 9 мВ, уравнение (4) дает зависимости, отображенные красной и зеленой кривыми соответственно (рис. 1А). Для этих параметров уравнение (5) дает для потока АТР-зависимости, представленные на рис.1Б красной и зеленой кривыми. Эти зависимости показывают, что, относительно небольшие девиации потенциал-зависимости проводимости за счет крутой зависимости фактора F_G от потенциала конвертируются в существенные изменения потенциал-зависимости потока АТР. В частности, для зависимости, иллюстрируемой зеленой кривой, невозможен выброс АТР в области физиологических потенциалов, а значит регуляция секреции этого нейротрансмиттера градуальным рецепторным потенциалом. Эти вычислительные эксперименты показывают, что квази-стационарный поток АТР через АТР-проницаемый канал вряд ли может быть надежным носителем сенсорной информации.

НЕСТАЦИОНАРНЫЙ СЛУЧАЙ

Поскольку в реальности выброс нейротрансмиттера АТР в клетках типа II регулируется стимул-зависимой серией ПД, ниже в рамках транспортного уравнения (1) мы рассмотрим нестационарный поток через АТР-проницаемый канал и проанализируем связь его кинетических параметров и параметров импульсной стимуляции с количеством секретируемого АТР.

Характерной особенностью АТР-проницаемых каналов является их медленная активация в ответ на деполяризацию и медленная деактивация при реполяризации мембраны [18, 25]. Поскольку во вкусовых клетках типа II преимущественно эти каналы ответственны за ПЗ выходящие токи [18, 19], мы на основе экспериментов, проводившихся ранее [18], анализировали аналитически кинетические характеристики АТР-проницаемых каналов, ответственных за выходящие ПЗ токи в клетках типа II в условиях диализа внутриклеточным раствором CsCl (рис. 2). Деполяризация этих клеток, поддерживаемых при –70 мВ, вызывала быстро инактивирующиеся входящие ПЗ Na⁺ токи и медленно активирующиеся выходящие токи [18] (рис. 2А). Последние удовлетворительно аппроксимировались уравнением (рис. 2A, кружечки):

где I_l и I_s – ток утечки и стационарный выходящий ПЗ ток соответственно; G_l, и V_l – проводимость утечки и потенциал реверсии тока утечки; G_s, и V_VG – стационарная ПЗ проводимость и потенциал реверсии ПЗ тока. Как было оценено [18], V_VG = 4.2 ± ± 1.5 мВ (n = 9) и G₀ = 55 ± 7 нСм (n = 9) для стационарной проводимости в уравнении Больцмана (4) для G_s.

Деактивация ПЗ тока в ответ на реполяризацию была практически моноэкспоненциальной, и хвостовые токи (рис. 2А) хорошо аппроксимировалась уравнением:

где ${{I}_{{{\text{tp}}}}}\left( V \right) = {{G}_{{\text{s}}}}\left( V \right)\left( {{{V}_{{\text{h}}}} - {{V}_{{{\text{VG}}}}}} \right).$

Полагая физиологически целесообразным отсутствие секреции АТР при потенциале покоя, из уравнений (7) и (8) следует, что при импульсной стимуляции эволюцию АТР-проницаемости во времени можно описать следующим образом:

Отметим, что характерные времена активации τ_a и деактивации τ_d ПЗ выходящего тока зависели от потенциала, и для дальнейшего анализа мы аппроксимировали экспериментальные данные аналитическими зависимостями. Экспериментальная зависимость τ_a (рис. 2B, треугольники) аппроксимировалась выражением (рис. 2B), толстая линия):

где ${{\tau }_{{{\text{a0}}}}}$ = 10 мс, ${{\tau }_{{{\text{a1}}}}}$ = 15 мс, V_a0 = 12.7 мВ, V_a = 15 мВ. Аналогичная аналитическая зависимость (Fig. 2B, тонкая линия) использовалась для аппроксимации экспериментальных значений τ_d (Fig. 2B, квадраты): при ${{\tau }_{{{\text{d0}}}}}$ = 5.4 мс, ${{\tau }_{{{\text{d1}}}}}$ = 4.0 мс, V_d0 = 12.7 mV, V_d = 32 mV.

Используя уравнения 1, 7–11 при указанных параметрах, можно вычислить количество АТР, высвобождаемое клеткой через АТР-проницаемые каналы в ответ на импульсную стимуляцию длительностью T, деполяризующую мембрану от поддерживаемого потенциала V_h до потенциала V. Следует отметить, что в период активации канала в ответ на деполяризацию поток АТР детерминируется потенциалом V. Последний определяет как кинетику активации АТР-проводимости, так и движущую силу для АТР потока, который за время T переносит количество АТР Q_a. В период деактивации канала, вызванной реполяризацией мембраны к поддерживаемому потенциалу (рис. 2A), соответствующий поток АТР происходит при постоянном потенциале V_h, высвобождая количество АТР Q_d. В результате импульсной стимуляции общее количество выброшенного АТР Q_ATP = Q_a + Q_d, где

Комбинируя уравнения 7–12, можно получить следующие соотношения:

где факторы времени стимуляции ${{K}_{{\text{a}}}}\left( T \right)$ и ${{K}_{{\text{d}}}}\left( T \right)$ определяются как:

Поскольку уравнение (13) с точностью до множителя K_a(T) совпадает с уравнением (5), Q_a(T, V) является колоколообразной функцией потенциала V (рис. 3А, B, красные кривые) при любой длительности стимуляции T. В то же время, в выражении для Q_a(T, V) переменным по V является лишь множитель, описывающий стационарную АТР-проводимость, и в целом Q_d(T, V) является монотонной функцией с насыщением типа изотермы Ленгмюра (рис. 3А, B, синие кривые). Отношение

показывает, что относительный вклад потоков АТР в процессе активации АТР-проводимости и ее деактивации является функцией потенциала и длительности стимуляции. При относительно продолжительной стимуляции (T $ \gg $ τ_a > ${{\tau }_{{\text{d}}}}$, Q_a(T, V) доминирует при физиологических потенциалах, и общее количество высвободившегося АТР Q_ATP = Q_a + Q_d является колоколообразной функцией (рис. 3А). При относительно кратковременной стимуляции (T < τ_a) модель предсказывает доминантный вклад Q_d(T, V), и общее Q_ATP является монотонной функцией потенциала (рис. 3B). Следует отметить, что оба предсказания модели подтверждаются в экспериментах (рис. 3C, D), в которых потенциал-зависимость секреции АТР вкусовыми клетками типа II исследовалась методом биосенсора [18].

Теперь рассмотрим физиологические последствия потенциал-зависимости секреции АТР при разных стимуляциях. Следует отметить, что потенциал покоя вкусовых клеток оценивался в нескольких работах и полученные величины лежат в диапазоне –65…–45 мВ [26, 27]. Учитывая электрическую возбудимость вкусовых клеток типа II, физиологически целесообразно поддерживать потенциал покоя V_r не выше –50 мВ, чтобы обеспечить достаточно большую фракцию не инактивированных потенциал-зависимых (ПЗ) Na⁺ каналов. Это также целесообразно, чтобы минимизировать утечку АТР из покоящихся клеток. Поэтому в качестве достаточно правдоподобной оценки примем V_r = –55 мВ. Как следует из анализа выброса АТР в ответ на 2-секундную деполяризацию (рис. 4 А), имитирующей действие рецепторного потенциала, градуальная регуляция секреции АТР создает ряд проблем для афферентной синаптической передачи. Во-первых, рецепторный потенциал во вкусовых клетках типа II генерируется при участии катионных каналов TRPM5, примерно в равной степени проницаемых для ионов Na⁺ и K⁺ и поэтому потенциал реверсии генераторного тока близок к нулю [28]. В силу этого рецепторный потенциал может деполяризовать вкусовую клетку не более чем до 0 мВ (рис. 4 А), Потенциал-зависимость секреции АТР такова, что в области градуальных потенциалов –55…–30 мМ она пренебрежимо мала, это означает, что рецепторные потенциалы, вызванные малыми и средними по интенсивности вкусовыми стимулами фактически не могли бы инициировать афферентную передачу сенсорной информации. Кроме того, как уже обсуждалось выше, поток АТР, регулируемый градуальным потенциалом, должен быть весьма вариабельным при незначительных сдвигах активационной кривой АТР-проницаемого канала, вызванных изменениями в микроокружении (рис. 1).

Более целесообразной выглядит стратегия кодирования вкусовой информации посредством импульсной секреции АТР при участии ПД. Действительно, порог генерации ПД во вкусовых клетках лежит в области –45 мВ [18] и поэтому пороговому вкусовому стимулу достаточно сдвинуть мембранный потенциал на величину порядка 10 мВ. Важной особенностью ПД-регулируемой секреции является то, что потенциал-зависимость выброса АТР описывается кривой с насыщением (рис. 4B ), с плато в области характерных величин ПД [18]. Для такой зависимости небольшие сдвиги активационной кривой АТР-проницаемого канала практически не скажутся на секреции АТР. Кроме того, в силу своей кратковременности и универсальности формы, каждый ПД должен инициировать выброс лишь незначительного, но одинакового количества АТР, детерминируя квантовый характер секреции нейротрансмиттера, как это имеет место в классических химических синапсах. В этом случае сенсорная информация кодируется количеством ПД, генерируемых пропорционально интенсивности вкусового стимула.

Таким образом, рассмотренные выше закономерности секреции АТР через АТР-проницаемый ионный канал позволяют прийти к заключению, что по сравнению с регуляцией выброса АТР градуальным рецепторным потенциалом, электрическая возбудимость вкусовых клеток обеспечивает более надежную синаптическую передачу и более широкий динамический диапазон воспринимаемых вкусовых стимулов.