Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 12, стр. 1583-1596

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все эксперименты проводились в соответствии с Правилами проведения работ с подопытными животными, утвержденными комиссией по этике Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Исследования проводили на самцах крыс линии Вистар массой 230–430 г в возрасте 3–4 мес. Части животных в дозе 30–45 мг/кг внутрибрюшинно вводили стрептозотоцин (СТЗ), растворенный в 0.1 М цитратном буфере (рН 4.6) (СТЗ-группа). Оставшиеся животные получали инъекцию эквивалентного объема цитратного буфера (контроль). Развитие СД1 подтверждали на основании измерений уровня случайной глюкозы, определяемого независимо от времени предыдущего приема пищи в последний день эксперимента. Уровень глюкозы измеряли с помощью глюкометра One Touch Select Plus Flex (LifeScan Europe, Швейцария). В данное исследование были включены только крысы СТЗ-группы с уровнем случайной глюкозы, превышающим 11 мМ.

Электрофизиологические эксперименты с использованием loose patch метода проводились на левых желудочках изолированных сердец крыс в условиях сохраненного синусового ритма при постоянной перфузии по методу Лангендорфа. Раствор для перфузии представлял собой аэрируемый карбогеном (5% CО₂ и 95% О₂) раствор Тироде, содержащий (мМ): 140 NaCl, 4.5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES, 10 глюкоза, pH 7.2–7.4. Первоначально изолированное сердце с вставленной в аорту пластиковой канюлей на 20–30 мин вывешивалось на колонку, заполненную аэрируемым стандартным раствором Тироде при комнатной температуре для промывки сердца от крови и проверки его на жизнеспособность. Далее сердце, показавшее устойчивую сократительную активность, переносилось в заземленную экспериментальную камеру, выполненную из оргстекла объемом 10 мл, и подключалось к термостатируемой перфузионной системе, заполненной раствором Тироде. Скорость перфузии составляла 5–7 мл/мин. Выведение из экспериментальной камеры избыточного раствора осуществлялось через силиконовую трубочку диаметром 1 мм, подключенную к аспиратору. Устранение сократительных ответов обеспечивалось добавлением в перфузирующий раствор блокатора миозиновой АТФазы 2,3-бутадион-моноксима (BDM, Sigma) в концентрации 20 мМ. Эксперименты проводились при температуре 38–39°С. Изготовление микроэлектродов производилось с использованием программируемого пуллера (Sutter Jnstr., Model P-1000, США). Для регистрации электрических ответов использовалась описанная ранее авторская методика микроэлектродного картирования наружной поверхности миокарда – narrow tipped pipettes loose patch [2] с использованием микроэлектродов с диаметром кончика ∼5 мкм. Перемещение микроэлектрода от одного сайта регистрации на поверхности левого желудочка сердца к другому осуществлялось при помощи микроманипулятора NMH-21 (Narishige, Япония). Регистрируемые сигналы подавались на вход усилителя АM-1500 (National Instruments, США), затем оцифровывались с помощью АЦП (частота оцифровки – 10 кГц) и сохранялись для последующей обработки на жестком диске компьютера. Для локальной доставки фармакологических агентов в зону регистрации эти агенты добавлялись в раствор Тироде, заполняющий электрод. Использовались следующие блокаторы К⁺-каналов: 4-аминопиридин (4-АР, блокатор ультрабыстрого, быстрого и медленного компонентов тока задержанного выпрямления, Kv1.5, 1.4 и 4.2/4.3 каналы; 5 мМ, Sigma, США), апамин (блокатор IK_Ca, SK-каналы; Tocris, США; 500 нM), глибенкламид (блокатор IK_ATP, Kir6.1/6.2 каналы; Tocris, США; 100 мкМ) и Ba²⁺ (в низких, 1 или менее мМ, концентрациях специфический блокатор каналов обратного выпрямления, IK1, Kir2.1/2.2; Sigma, США; 5 мкМ BaCl₂). Время непрерывной регистрации от каждого конкретного сайта составляло 1–2 мин в обычных экспериментах и примерно 30 мин в экспериментах с использованием блокаторов К⁺-каналов.

Рис. 1 иллюстрирует представительные примеры регистрируемых сигналов и их классификацию, применяемую в данной работе.

Рис. 1.

Примеры и классификация типов внеклеточных потенциалов. a – примеры вПД1 и вПД1сг сигналов (АР1 и АР1_AH); b – примеры вПД2 и вПД2сг сигналов (АР2 и АР2_AH). Треки вПД и вПДсг сигналов показаны сплошной и пунктирной линиями, соответственно. Первый и второй (когда присутствует) негативные пики сигнала пронумерованы – цифры около соответствующего пика.

Если в наших более ранних работах [1–3] все регистрируемые вПД подразделялись на два типа, вне зависимости от наличия или отсутствия фазы следовой гиперполяризации (вПД1 – 1 негативный пик и вПД2 – 2 негативных пика; рис. 1a и b, соответственно), то теперь сигналы с выраженной (пиковая амплитуда более 5% от амплитуды первого негативного пика) фазой следовой гиперполяризацией были выделены в отдельные группы (вПД1сг и вПД2сг) и анализировались независимо от других типов сигналов. Для анализа временных характеристик использовался параметр Т₉₀ – время спада единственного (вПД1 и вПД1сг) или второго (вПД2 и вПД2сг) негативного пика на 90% от его абсолютной амплитуды.

Полученные в экспериментах данные были проверены на нормальность распределения (критерий Шапиро–Вилка; в выборках малого объема, не позволяющего применение этого критерия (n < 6), распределение данных предполагалось нормальным). В соответствии с результатами этой проверки, различия между значениями в контрольной и экспериментальной группах принимали как достоверные при p < 0.05, используя соответствующие параметрические или непараметрические статистические критерии. Представленные в тексте и на рисунках данные приведены в виде средних значений и их ошибок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Частота встречаемости разных типов внеклеточно регистрируемых ПД кардиомиоцитов у крыс в контроле и после 2-х, 4-х и 8-ми недель СТЗ-СД

Все описанные выше четыре категории вПД наблюдали в экспериментах в контрольных сердцах. Однако количество регистраций вПД1_СГ и вПД2_СГ было незначительным, составляя в среднем 6.8 ± 2.3% от всех зарегистрированных ПД (13 крыс, 31 из 423 сайтов регистрации). Средняя, нормализованная к амплитуде первого негативного пика ответа амплитуда СГ таких ответов была 19.4 ± 8.5%. Т₉₀ вПД1 и вПД1сг достоверно не отличались (5.2 ± 0.3 мс vs 5.9 ± 0.4 мс; p > 0.05, one-way ANOVA), тогда как вПД2_СГ характеризовались значительно укороченным по сравнению с вПД2 спадом (Т₉₀: 22.7 ± 4.0 мс vs 35.9 ± 1.7 мс, p < 0.05, one-way ANOVA).

В сердцах СТЗ-СД крыс, начиная уже с 2-недельного срока СД, наблюдались существенные изменения в отношении характеристик вПДсг сигналов. В первую очередь это касалось прогрессивного увеличения фазы СГ и очевидно связанного с этим подавления второго негативного пика и слияния его с первым негативным пиком вПД2сг. В этих условиях нашим критерием различения вПД1сг и вПД2сг потенциалов было либо, как в контрольных экспериментах, наличие второго негативного пика, либо присутствие отчетливой ступеньки на спаде первого негативного пика регистрируемого сигнала (рис. 2).

Рис. 2.

Репрезентативные примеры регистраций вПДсг в контроле и на разных сроках диабета и их разделения на классы вПД1сг (штриховые линии) и вПД2сг (сплошные линии) сигналов. Стрелки на рисунках отмечают второй негативный пик сигнала или ступеньку на спаде первого негативного пика сигналов, которые классифицировались как вПД2сг. Надписи над панелями рисунка – экспериментальная группа животных.

С учетом этой модификации классификационного подхода полученные данные демонстрируют статистически значимое (в сердцах СД животных по сравнению с контролем) увеличение относительной частоты регистрации вПД1, вПД1_СГ и вПД2_СГ и снижение частоты встречаемости вПД2 (рис. 3a, p < 0.05, one-way ANOVA). Более того, дальнейший анализ этих данных выявил наличие существенной взаимосвязи между встречаемостью вПД2 и вПДсг (вПД1сг и вПД2сг) в контроле и на разных сроках СД (рис. 3b).

Рис. 3.

Частота встречаемости разных типов внеклеточных ПД, регистрируемых в левом желудочке изолированного сердца в контроле и на разных сроках СД. a – частота встречаемости вПД1, вПД2, вПД1_СГ и вПД2_СГ (AP1, AP2, AP1_AH, AP2_AH) в контроле (13 крыс, 423 сайтов) и на разных сроках СТЗ-СД (2 недели – 8 крыс, 212 сайтов регистрации, 4 нед. – 6 крыс, 204 сайта регистрации и 8 недель – 8 крыс, 224 сайта регистрации). b – взаимосвязь между частотами встречаемости вПД2 и вПДсг (AP2 и AP_AH – объединенная выборка вПД1сг и вПД2сг сигналов) в контроле и на разных сроках СД (срок диабета в неделях указан цифрой около соответствующего символа).

Прогрессивное возрастание амплитуды следовой гиперполяризации с увеличением срока СД было сходно для вПД1_СГ и вПД2_СГ сигналов (рис. 4a). Однако соответствующие изменения длительности этих классов ПД носили диаметрально противоположный характер: вПД1сг замедлялись, тогда как длительность (Т₉₀) вПД2 была снижена в СТЗ крысах по сравнению с контролем (рис. 4b). На 4-й и 8-й неделях СД вПД1сг и вПД2сг статистически не различались ни по одному из измеренных параметров (амплитуда следовой гиперполяризации или Т₉₀).

Рис. 4.

Изменение характеристик вПД1_СГ и вПД2_СГ (открытые и закрытые символы соответственно) в контроле (ноль оси абсцисс) и на разных сроках СТЗ-СД. а – средние (6–13 крыс, 23–54 сайта регистрации на точку) значения амплитуды следовой гиперполяризации (AH amplitude) вПД1 _СГ и вПД2 _СГ. b – Т₉₀ этих же сигналов (AP T₉₀) в контроле и на сроках 2-х, 4-х и 8-ми недель СТЗ-СД.

Влияние локальной доставки блокаторов К⁺- каналов на профили вПД_сг

Поскольку в левых желудочках сердец контрольных крыс встречаемость вПДсг сравнительно низка (рис. 3a), все эксперименты с применением блокаторов К⁺-каналов были проведены на сердцах животных с 2–4-недельным СД. Для локальной доставки к месту регистрации выбранный блокатор загружался в регистрирующую пипетку и эффективность его действия оценивалась из сравнения пиковых амплитуд следовой гиперполяризации вПД, измеренных немедленно после установления контакта пипетки с мышечным волокном и через 30 мин непрерывной регистрации вПДсг от данного сайта. В контрольных экспериментах (электрод заполнен стандартным внеклеточным раствором) и в экспериментах с локальной перфузией сайта регистрации глибенкламидом или ВаCl₂, 30-минутная непрерывная регистрация вПД не сопровождалась изменениями амплитуды следовой гиперполяризации регистрируемого сигнала (рис. 5). Локальная аппликация 4-АР приводила к достоверному увеличению СГ от 12.8 ± 3.4% до 26.2 ± 2.4% к 30-й минуте регистрации (рис. 5; p < 0.05).

Рис. 5.

Амплитуда следовой гиперполяризации вПДсг в начале и через 30 мин (открытые и затемненные столбцы, соответственно) непрерывной регистрации от данного сайта при заполнении регистрирующей пипетки нормальным физиологическим раствором (контроль) или раствором с добавлением выбранного блокатора К⁺-каналов. Приведены средние значения (± стандартная ошибка) для исследованных сайтов в контрольных условиях и при локальной перфузии 4-АР (5 мМ), глибенкламида (100 мкМ) или BaCl₂ (5 microM). Количество исследованных сайтов/крыс указано цифрами над соответствующими столбцами гистограммы.

Полученные данные демонстрируют отсутствие каких-либо эффектов, связанных с длительной непрерывной регистрацией от одного и того же сайта (например, с повреждением мембраны кардиомиоцитов в зоне регистрации), а также предполагают, что формирование фазы следовой гиперполяризации вПД не может быть приписано активации 4-аминопиридин-, глибенкламид- или Ва²⁺-чувствительных К⁺-каналов плазматической мембраны кардиомиоцита.

Результаты экспериментов с локальной доставкой к сайту регистрации блокатора SK-каналов апамина (500 нМ) резко контрастировали с вышеизложенным. В этих экспериментах не наблюдалось изменения профилей стандартных вПД 1-го и 2-го типа миоцитов левого желудочка сердца крыс. Однако, уже начиная с 10-й мин после формирования контакта микропипетки, содержащей апамин, с поверхностью миоцита наблюдалось подавление фазы следовой гиперполяризации у вПДсг с постепенной трансформацией профилей как вПД1сг, так и вПД2сг в сигналы, соответствующие по форме “классическим” вПД2 сигналам (рис. 6).

Рис. 6.

Примеры изменений разных типов внеклеточных ПД в экспериментах с локальной доставкой апамина к сайту регистрации. Сплошными и пунктирными линиями показаны треки сигнала, полученного в начале и под конец 30-минутной непрерывной регистрации с пипеткой, заполненной апамин-содержащим раствором (500 нМ). Верхние панели – примеры регистрации вПД1 и вПД2 сигналов; нижние панели – вПД1сг и вПД2сг сигналы.

Прогрессивное подавление фазы следовой гиперполяризации вПДсг в этих экспериментах ассоциировалось и с прогрессивным затягиванием спада этих сигналов (рис. 7).

Рис. 7.

Изменения временных параметров вПД в экспериментах с локальной доставкой апамина к сайту регистрации вПД1 и вПД1сг (a) и вПД2 и вПД2сг (b). Представлены средние значения (± стандартная ошибка), рассчитанные для выборок вПД1, вПД1сг, вПД2 и вПД2сг, зарегистрированных в разных сайтах сердец СТЗ-СД крыс (4, 5, 3, и 5 сайтов, и 3, 4, 2 и 3 крысы, соответственно).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Скорость реполяризации кардиомиоцитов является одним из критических для поддержания нормальной сердечной активности параметров. Как замедление, так и ускорение реполяризации кардиомиоцитов может вести к нарушениям регулярности в сердечном ритме. Более того, аномальное замедление ПД кардиомиоцитов сопровождается нарушением диастолического расслабления сердечной мышцы – ведущим фактором развития кардиомиопатии и сердечной недостаточности, в частности у больных СД [8, 11]. В связи с последним, результаты нашего исследования, проведенного на модели стрептозотоцинового СД1 (СТЗ-СД1) у крыс, представляют особый интерес.

В наших исследованиях было показано существенное по сравнению с контролем увеличение вПДсг фракции вПД эпикардиальных миоцитов левых желудочков сердец СТЗ-СД1 крыс. Частота встречаемости таких сигналов значимо увеличена уже после двух недель экспериментального диабета и остается высокой на протяжении как минимум еще 6-ти недель СД (рис. 3). Ранее было показано, что на тех же сроках СТЗ-СД (1–8 нед.) внутриклеточно-регистрируемые ПД желудочковых кардиомиоцитов крыс замедлены из-за подавления К⁺-токов реполяризационного резерва. А именно, были приведены свидетельства сниженной в кардиомиоцитах СТЗ-СД1 крыс активности/экспрессии трех типов К⁺-каналов: каналов 4-АР чувствительного transient-outward (Ito) тока, каналов сверхмедленного (quasi-steady-state, Iss) тока и каналов тока обратного выпрямления (IK1) [5–9]. Наши результаты предполагают, что патогенез СТЗ-СД1 в отношении изменений ионных проводимостей желудочковых кардиомиоцитов более сложен, и наряду с подавлением существует также и активация, возможно компенсаторная, какого-то тока реполяризационного резерва, обеспечивающего появление/усиление фазы следовой гиперполяризации и увеличение фракции вПДсг регистрируемых в сердцах СТЗ-СД1 крыс. При рассмотрении вопроса о природе этого тока следует учесть, что эта фаза следовой гиперполяризации завершает вПД, когда в кардиомиоцитах желудочков сердца крысы активны К⁺-каналы сверхмедленного (Iss) тока и тока обратного выпрямления (IK1) [5–9], а также, потенциально, могут активироваться такие токи реполяризационного резерва, как глибенкламид-чувствительные, АТФ-зависимые К⁺-каналы (IKATP, Kir6.2 каналы) [12], апамин-чувствительные, Са²⁺-зависимые К⁺-каналы низкой проводимости (IKCa, SK-каналы) [13] и Kir3.x (IKACh, ацетилхолин-зависимого тока входящего выпрямления) [14]. Однако участие Iss и IK1 токов в формировании фазы следовой гиперполяризации маловероятно, поскольку эти токи подавлены в сердцах СТЗ-СД1 крыс (см. ссылки выше). Более того, роль активации каналов IK1 тока может быть исключена также и на основании отсутствия изменений в форме вПДсг при их регистрации с помощью электродов, заполненных Ва²⁺-содержащим раствором (рис. 5). Из трех других, использованных нами в экспериментах с локальной доставкой к месту регистрации блокаторов калиевых каналов, только локальная доставка апамина (блокатор Са²⁺-зависимых К⁺-каналов низкой проводимости; SK [13]) вела к подавлению фазы следовой гиперполяризации вПДсг (рис. 6). Глибенкламид (блокатор IK_ATP) не влиял, а 4-АР (блокатор I_to) увеличивал амплитуду следовой гиперполяризации (рис. 5). Таким образом, на основании полученных данных именно активность SK-каналов представляется ответственной за формирование вПДсг. При этом следует отметить, что мы не наблюдали изменения формы регистрируемых вПД в контрольных экспериментах с локальной доставкой апамина к сайтам регистрации в которых регистрировались “классические” вПД1 или вПД2, не имеющие выраженной фазы следовой гиперполяризации (рис. 6). Наиболее простое объяснение этого феномена заключается в отсутствие мишени для апамина (SK-каналов) в зоне регистрации вПД в этих случаях. Наконец, предположение о ведущей роли активности SK-каналов в генерации следовой гиперполяризации подтверждается и, казалось бы, неожиданным, увеличением амплитуды следовой гиперполяризации в экспериментах с локальной доставкой к месту регистрации вПДсг 4-аминопиридина. 4-АР в сердечных кардиомиоцитах подавляет I_to, калиевый ток, ответственный за раннюю реполяризацию и, соответственно, существенно ограничивающий активацию Са²⁺- каналов и вход Са²⁺ в клетку. Снятие этого ограничения при блокаде ранней реполяризации 4-АР, вне сомнения, должно сопровождаться активацией всех Са²⁺-зависимых механизмов, включая увеличение тока через SK-каналы и увеличение амплитуды следовой гиперполяризации.

SK-каналы широко распространены в тканях млекопитающих, включая сердце грызунов. Известны SK1, SK2 и SK3 изоформы каналов, кодируемые соответственно KCNN1, KCNN2 и KCNN3 генами [13]. Вне зависимости от изоформы все эти каналы характеризуются небольшой проводимостью (10–20 ps) для калия и активируются не напряжением, а внутриклеточным свободным Са²⁺ в субмикромолярных концентрациях [13]. В сердце грызунов, SK1 и SK2 изоформы наиболее представлены в предсердиях, тогда как SK3 изоформа демонстрирует сходные уровни экспрессии как в предсердиях, так и в желудочках [15, 16]. Нормальная активность предсердных SK-каналов является важным механизмом контроля длительности потенциалов действия кардиомиоцитов, а нарушения в этой активности – одним из патогенетических механизмов фибрилляции предсердий при инфаркте миокарда, сердечной недостаточности, предсердной и желудочковой аритмии [17, 18]. Тем не менее, в целом, вопрос о роли SK-каналов в норме и при сердечной патологии остается открытым. В частности, насколько нам известно, роль SK-каналов при развитии диабетической кардиомиопатии была исследована только в одной работе на СТЗ-модели Т1СД мыши [19] и в двух работах, использующих крысиные модели Т2СД [11, 20]. Все эти исследования были ограничены анализом экспрессии и функции предсердных SK и сходны в демонстрации подавляющего SK-токи в предсердных кардиомиоцитах эффекта СД. Полученные нами данные предполагают, что эффект СД на активность/экспрессию SK-каналов желудочковых кардиомиоцитов может быть диаметрально противоположен описанному ранее для предсердий, приводя к существенному (по сравнению с контролем) увеличению фракции вПДсг в экспериментах на желудочках сердец 2–8-недельных СТЗ-СД1 крыс. Подтверждение предполагаемого феномена, уточнение его природы и функционального значения требует дальнейших исследований, в частности, поскольку увеличение активности SK-каналов в кардиомиоцитах эпикарда желудочков сердца было идентифицировано как одна из причин развития желудочковой аритмии сердца [21].

Отдельного обсуждения заслуживает обновленная в данной работе классификация форм вПД (вПДсг выделены в отдельные категории сигналов) и наблюдения того, что при действии апамина вПД1сг трансформируются в вПД2 (рис. 6, левая нижняя панель), а в сердцах СТЗ-крыс увеличиваются по сравнению с контролем встречаемости вПД1 (однопиковых вПД без следовой гиперполяризации), вПД1сг и вПД2сг, но не вПД2 (двух-пиковые вПД без фазы следовой гиперполяризации (рис. 3a). Более того, фракция вПДсг возрастает пропорционально убыванию фракции вПД2 (рис. 3b). Ранее нами было обосновано, что с большой долей вероятности первый и второй негативные пики вПД волны формируются в результате активации, соответственно, входящих натриевого и кальциевого токов кардиомиоцита в зоне внеклеточной регистрации. Далее были также предоставлены аргументы в пользу того, что вПД1 регистрируется в тех случаях, когда кончик регистрирующего микроэлектрода (при условии его малого размера) оказался помещенным в зону клетки, свободную от выходов t-трубочек, характеризующуюся низкой плотностью кальциевых каналов. В то же время наличие под электродом выходов t-трубочек и доступа к Т-системе кардиомиоцита, мембрана которой насыщена Са²⁺-каналами, является условием регистрации вПД2 [22]. В рамках этой трактовки наши новые наблюдения предполагают, что вПД1сг – это в действительности вПД2 сигналы, в которых входящий Са²⁺-ток полностью маскируется выходящим К⁺-током SK-каналов (что объясняет трансформацию вПД1сг в вПД2 при в экспериментах с локальной доставкой апамина к месту регистрации). Второе, как было показано и ранее с использованием конфокальной микроскопии [3, 4], СТЗ-СД1 ассоциирован с дезорганизацией Т-системы кардиомиоцитов и уменьшением плотности устьев t-трубочек на поверхности мембраны (что объясняет увеличение фракции вПД1 в экспериментах в СТЗ-СД1 модели крысы). Наконец, в-третьих, предполагаемое увеличение активности SK-каналов в кардиомиоцитах диабетических животных происходит за счет увеличения экспрессии этих каналов в Т-системе кардиомиоцитов (объясняя обратную пропорциональность изменений во фракции вПДсг и вПД2 форм сигналов, регистрируемых в контроле, и на 2-й и более поздних неделях СТЗ-СД1).

В заключение, представленные здесь данные позволяют предположить, что СТЗ-СД1 ассоциируется с увеличением активности/экспрессии SK-каналов в кардиомиоцитах левого желудочка сердца крысы. Подтверждение этого предположения, а также изучение механизмов и выявление функционального значения предполагаемых изменений требует дальнейших исследований.