Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 5, стр. 689-700

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Схема эксперимента. Для экспериментов использовали половозрелых самцов крыс линии Вистар в возрасте 5 мес., содержащихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму. Животные были разделены на 8 групп (в каждой n = 6). Фрагмент лептина, миристоил-Ser-Cys-Ser-D-Leu-Pro-Gln-Thr-амид (“Atagenix Laboratories”, КНР) растворяли в физиологическом растворе и вводили крысам из групп “ФЛ” и “ФЛ + ХГЧ”, “АНТ + ФЛ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ” интраназально в дозе 200 мкг/крысу в течение трех дней, ежедневно в 11:00. Антагонист рецептора GnRH, цетрореликса ацетат (Cetrorelix acetate) (Xingtai Yuanao Technology Co, КНР) растворяли в физиологическом растворе и вводили крысам из групп “АНТ”, “АНТ + ФЛ”, “АНТ + ХГЧ”, “АНТ + ФЛ + ХГЧ” подкожно в дозе 75 мг/кг в течение трех дней, ежедневно в 11:00. Крысам из групп “ФЛ + ХГЧ”, “ХГЧ”, “АНТ + ХГЧ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ” в последний день эксперимента подкожно вводили ХГЧ (“Московский эндокринный завод”, Россия) в дозе 15 МЕ/крысу в 12:30 (через 90 мин после введения ФЛ). Животные из группы “Контроль” получали физиологический раствор вместо препарата. У животных из всех групп оценивали базовый уровень тестостерона в крови, для чего у них забирали кровь из хвостовой вены в нулевой день эксперимента в 10:00, 12:00, 14:00 и 16:00 (под местным наркозом с использованием 2–4%-ного раствора лидокаина), чтобы рассчитать интегрированные значения концентрации гормона, учитывающие динамику его изменения в течение эксперимента. Эти данные использовали для равномерного распределения самцов по группам в соответствии с их андрогенным статусом. В первый день введения ФЛ у крыс из групп “ФЛ” и “ФЛ + ХГЧ” забирали кровь в 10:00 (за час до введения), в 12:00 (через 60 мин) и 14:00 (через 180 мин), чтобы оценить эффект однократного введения препарата на уровень тестостерона. На третий день введения ФЛ у крыс забирали кровь до введения ФЛ и/или цетрореликса (в 10:00), через 90 мин после введения ФЛ и/или цетрореликса, через 90 и 180 мин после введения ХГЧ. Кроме того, у всех самцов были оценены метаболические показатели до начала и в третий день эксперимента. Для определения уровня глюкозы использовали глюкометр и тест-полоски “One-Touch Select Ultra” (“LifeScan”, США). Также были получены образцы плазмы крови для определения уровня общего холестерина с помощью набора “Холестерин-1-Ольвекс (013.001)” (“Ольвекс”, Россия) и уровня триглицеридов с помощью набора “Триглицериды-1-Ольвекс (017.001)” (“Ольвекс”, Россия). Вслед за последним забором крови животные подвергались общей анестезии с помощью хлоральгидрата (400 мг/кг), после чего их декапитировали, извлекали ткани семенников и хранили их при –80°C до проведения экспериментов по оценке экспрессии генов.

Определение уровня тестостерона с помощью иммуноферментного анализа. Уровень тестостерона в образцах плазмы крови самцов крыс определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы “ИФА-Тестостерон” (“Алкор-Био”, Россия).

Оценка генной экспрессии. Для анализа экспрессии генов из тканей семенников выделяли тотальную РНК с помощью реагента “ExtractRNA” (“Евроген”, Россия), затем получали кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, используя набор “MMLV RT Kit” (“Евроген”, Россия). ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью амплификатора “Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR System” (“Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.”, США) в инкубационной смеси, содержащей кДНК, 0.4 мкМ прямого и обратного специфичных праймеров, реагент “qPCR-HS SYBR + Low ROX” (“Евроген”, Россия). Для исследований использовали последовательности комплементарных кДНК прямого и обратного праймеров для генов крысы Star, Cyp11a1, Lhr, кодирующих белки StAR, цитохром P450_scc и рецептор ЛГ, а также Actb (β-актин) в качестве референсного гена (табл. 1) [11].

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных по определению уровня тестостерона в крови проводили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки для попарного сравнения. Для статистической обработки данных по оценке генной экспрессии использовали однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки для попарного сравнения. Для статистической обработки данных по определению массы тела крыс, а также уровней глюкозы, общего холестерина и триглицеридов использовали парный тест Стьюдента. Все статистические анализы проводили с использованием программы GraphPad Prism 8 (версия 8.0.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние интраназального введения ФЛ на уровень тестостерона в крови в норме, а также при обработке животных антагонистом GnRH-рецептора и хорионическим гонадотропином человека

Однократное интраназальное введение ФЛ приводило к повышению уровня тестостерона в крови крыс на 99% через 60 мин после введения препарата (рис. 1). При этом уровень гормона оставался повышенным и через 180 мин, превосходя базовый уровень на 61%. Трехдневное введение ФЛ не вызывало значимых изменений уровня тестостерона в крови в течение всего исследованного периода (60–270 мин) (рис. 2a). Однократное подкожное введение ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу приводило к повышению уровня тестостерона на 243% через 180 мин после введения. Введение ХГЧ крысам, которые в течение трех дней интраназально получали ФЛ, приводило к более выраженному повышению уровня тестостерона, чем у интактных животных. Через 90 мин после введения ХГЧ (180 мин после введения ФЛ) уровень тестостерона был выше базовых значений на 340%, через 180 мин – на 773%. Тем самым, трехдневное введение ФЛ в значительной степени потенцировало стимулирующий эффект ХГЧ на продукцию тестостерона в сравнении с интактными животными, и эффект потенцирования составил 62 и 221% через 180 и 270 мин соответственно (рис. 2a).

Рис. 1.

Уровни тестостерона в крови крыс до и после однократного интраназального введения фрагмента лептина 116–122, миристоил-Ser-Cys-Ser-D-Leu-Pro-Gln-Thr-амида. В нулевой день эксперимента образцы крови из хвостовой вены крыс забирали в 10:00, 12:00 и 14:00 час (day 0). В день эксперимента фрагмент лептина (ФЛ) вводили животным интраназально в 11:00, образцы крови забирали в 10:00 (до введения) и через 60 и 180 мин после введения ФЛ (LF). * – отличия от точки “0 min” статистически значимы при p < 0.05, M ± SEM, n = 12.

Рис. 2.

Влияние трехдневного введения фрагмента лептина 116–122 и (или) антагониста рецептора GnRH, а также однократного введения ХГЧ на уровень тестостерона в крови самцов крыс. (a) – Изменение уровня тестостерона в крови у крыс, которые в течение трех дней получали интраназально вводимый ФЛ и затем были однократно обработаны ХГЧ. ФЛ вводили интраназально в суточной дозе 200 мкг/крысу (LF и LF+hCG – группы “ФЛ” и “ФЛ + ХГЧ”), ХГЧ вводили однократно, подкожно, в дозе 15 МЕ/крысу (hCG и LF + hCG – группы “ХГЧ” и “ФЛ + ХГЧ”). (b) – Изменение уровня тестостерона у крыс, которых в течение трех дней обрабатывали цетрореликсом и ФЛ и однократно ХГЧ. Цетрореликс вводили подкожно в суточной дозе 75 мкг/кг. ФЛ вводили группам ANT + LF и ANT + LF + hCG (группы “АНТ + ФЛ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ”), как описано выше. ХГЧ вводили как описано выше (ANT + hCG и ANT + LF + hCG – группы “АНТ + ХГЧ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ”). Образцы крови для изучения уровня тестостерона были взяты из хвостовой вены крыс на третий день обработки ФЛ и (или) цетрореликсом до введения обоих препаратов (1), через 90 мин после введения ФЛ и(или) цетрореликса (2), через 180 мин после введения ФЛ и(или) цетрореликса и через 90 мин после введения ХГЧ (3), через 270 мин после введения ФЛ и(или) цетрореликса и через 180 мин после введения ХГЧ (4). * – отличия от базового уровня тестостерона (точка 1) при внутригрупповом сравнении, ** – отличия от временной точки 180 мин после обработки ФЛ и (или) цетрореликсом или через 90 мин после введения ХГЧ (точка 3) при внутригрупповом сравнении, ^# – отличия от аналогичной временной точки в группе “Контроль” статистически значимы при p < 0.05, M ± SEM, n = 6.

Трехдневное введение антагониста рецептора GnRH цетрореликса приводило к значительному снижению уровня тестостерона. На третий день эксперимента через 180 и 270 мин после введения цетрореликса уровень гормона составил 36 и 25% от его базовых значений (рис. 2b). В условиях обработки животных интраназально вводимым ФЛ ингибирующие эффекты цетрореликса сохранялись, на что указывало снижение уровня тестостерона до 48 и 32% от его базовых значений через 180 и 270 мин после введения препаратов. На третий день эксперимента уровень тестостерона в группах “АНТ + ХГЧ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ” был снижен через 90 мин и нормализовался через 180 мин после введения ХГЧ (270 мин после введения цетролерикса и ФЛ соответственно) (рис. 2b). Введение ФЛ не приводило к ослаблению ингибирующего эффекта цетрореликса на стероидогенез и существенно не влияло на стероидогенный эффект ХГЧ (рис. 2b).

Влияние трехдневного введения фрагмента лептина на экспрессию генов стероидогенеза в семенниках в норме и в условиях обработки антагонистом рецептора GnRH и ХГЧ

Исследовали экспрессию тестикулярных генов, кодирующих рецептор лютеинизирующего гормона (Lhr), белок StaR (Star) опосредующий скорость-лимитирующую стадию стероидогенеза (транспорт холестерина в митохондрии), и фермент цитохром P450_scc (Cyp11a1), катализирующий первую реакцию превращения холестерина в тестостерон. Изучение генной экспрессии в тканях семенников показало, что на третий день через 270 мин после введения ФЛ экспрессия генов Lhr, Star и Cyp11a1 существенно не менялась. В группе “ХГЧ” через 180 мин после однократной инъекции гонадотропина повышение экспрессии генов Lhr, Star и Cyp11a1 было значимым в сравнении с контрольной группой и составило 172, 168 и 74% соответственно. Для генов Star и Cyp11a1 значимыми были различия и с группой “ФЛ”. Трехдневное введение ФЛ не приводило к усилению стимулирующего эффекта ХГЧ на экспрессию генов Lhr, Star и Cyp11a1 (рис. 3a).

Рис. 3.

Изменение экспрессии генов Lhr, Star и Cyp11a1 в ткани семенников крыс после введения фрагмента лептина 116–122, антагониста рецептора GnRH или ХГЧ. Ткани семенников были взяты на третий день эксперимента через 270 мин после введения ФЛ и(или) цетрореликса и через 180 мин после введения ХГЧ. (a) – Изменение генной экспрессии в семенниках крыс в условиях трехдневного интраназального введения ФЛ, а также однократной стимуляции ХГЧ. ФЛ вводили интраназально в течение трех дней в суточной дозе 200 мкг/крысу (LF и LF + hCG – группы “ФЛ” и “ФЛ + ХГЧ”), ХГЧ вводили однократно, подкожно, в дозе 15 МЕ/крысу (hCG и LF + hCG – группы “ХГЧ” и “ФЛ + ХГЧ”). Сравнение проводили с группой “Контроль” (Control), получавшей только физиологический раствор. (b) – Изменение генной экспрессии в семенниках крыс, которых в течение трех дней обрабатывали антагонистом рецептора GnRH цетрореликсом и ФЛ, а также однократно вводили ХГЧ. Цетрореликс вводили подкожно в суточной дозе 75 мкг/кг, ФЛ (ANT + LF и ANT + LF + hCG – группы “АНТ + ФЛ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ”) и ХГЧ (ANT + hCG и ANT + LF + hCG – группы “АНТ + ХГЧ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ”) вводили, как описано выше. * – отличия от группы “Контроль” (Control), ^# – отличия от группы “ФЛ” (LF), ** – отличия от группы “АНТ + ХГЧ” (ANT + hCG) статистически значимы при p < 0.05, M ± SEM, n = 6.

Трехдневное введение цетрореликса значимо снижало экспрессию гена Star в группах “АНТ” и “АНТ + ФЛ” до 62 и 65% от соответствующих значений в контрольной группе (рис. 3b). Введение ХГЧ восстанавливало экспрессию гена Star до контрольных значений в группах “АНТ + ХГЧ” и “АНТ + ФЛ + ХГЧ”. При этом трехдневная обработка ФЛ не оказывала значимого влияния на эффекты цетрореликса и ХГЧ на экспрессию гена Star. В группах “АНТ”, “АНТ + ФЛ” и “АНТ + ХГЧ” отмечали повышение экспрессии гена Lhr на 138, 83 и 183% соответственно. При этом в группе “АНТ + ФЛ + ХГЧ” экспрессия Lhr была на 64% снижена относительно группы “АНТ + ХГЧ”. В группах, обработанных цетрореликсом, не было обнаружено существенных изменений экспрессии гена Cyp11a1, но наблюдалась тенденция к ее усилению (рис. 3b).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Взаимосвязь энергетического метаболизма и функциональной активности репродуктивной системы в последние годы активно изучается. Одним из важных регуляторов гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси является адипокин лептин, действующий на клетки-мишени через рецепторы ObRb. Будучи анорексигенным фактором, лептин снижает потребление пищи организмом, влияя на энергетический гомеостаз и опосредованно регулируя широкий спектр физиологических и биохимических процессов в организме [3].

Несмотря на доказанный терапевтический эффект полноразмерного лептина, в том числе при его дефиците в условиях липодистрофии, применение этого адипокина в клинике крайне ограничено, что обусловлено быстрой деградацией лептина в кровотоке и тканях, а также тем, что длительное его использование приводит к развитию лептиновой резистентности, что снижает фармакологическую эффективность лептиновой терапии. Альтернативой являются укороченные аналоги лептина, наиболее перспективным из которых является фрагмент 116–122 MA-[D-Leu4]-OB3. Продемонстрированы его анорексигенные эффекты у ob/ob- и db/db-мышей с нарушенным лептиновым сигналингом, а также у мышей с диета-индуцированным ожирением [9, 10]. По данным литературы, исследованный нами ФЛ способен ослаблять потребление пищи, нормализовать толерантность к глюкозе и снижать массу тела при ожирении [8]. В данном исследовании нами были использованы самцы крыс без метаболических нарушений (табл. 2). Трехдневное интраназальное введение ФЛ не влияло на основные метаболические показатели у крыс, такие как масса тела, уровни глюкозы, общего холестерина и триглицеридов в крови, что, по всей видимости, связано с нормальным метаболическим статусом животных, а также с краткосрочностью их обработки ФЛ. В описанных выше работах объектами исследования были мыши с признаками явных метаболических расстройств (ожирение, дислипидемия, нарушенная толерантность к глюкозе). Наряду с этим продолжительность лечения составила 14 дней при использовании суточной дозы 20–100 мг/кг (п/ор), в то время как в нашем эксперименте крысы получали ФЛ в суточной дозе 200 мкг/крысу в течение всего трех дней.

Для оценки влияния ФЛ на компоненты ГГТ оси нами был выбран интраназальный способ введения. При подобном способе введения ФЛ быстро проникает через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в гипоталамическую область, что позволяет ему действовать непосредственно на гипоталамические компоненты лептиновой сигнальной системы [12]. По данным литературы ФЛ хорошо проникает через ГЭБ, при этом концентрация препарата в плазме крови имеет два пика: через 10 и 60 мин. Исследователи предполагают, что первый пик связан с быстрым всасыванием миристинилированного пептида через слизистую оболочку носа, в то время как второй – с более медленным проникновением в кровь в ротоглотке [7]. Считается, что биодоступность препарата при интраназальном введении выше, чем при пероральном и разных способах парентерального введения [7]. Основываясь на этих данных и наших предварительных результатах, нами была разработана стратегия изучения эффективности влияния ФЛ на уровень тестостерона в крови и стероидогенез в семенниках самцов крыс.

Нами впервые показано, что при однократном интраназальном введении ФЛ стимулирует продукцию тестостерона, и максимальный эффект наблюдается уже через 60 мин после его введения (рис. 1). Этот максимум по времени хорошо совпадает со скоростью проникновения ФЛ через ГЭБ в гипоталамус [7]. При этом трехдневное введение препарата не приводило к изменениям уровня тестостерона в крови, что может быть связано с затуханием краткосрочных стероидогенных эффектов ФЛ на тестикулярный стероидогенез при многократном введении. Из данных литературы хорошо известно, что лептин может реализовать свои эффекты через опосредованную стимуляцию гипоталамических GnRH-продуцирующих нейронов и, тем самым, регулировать и модулировать стероидогенез в семенниках [3]. Использование ХГЧ, стимулятора тестикулярного стероидогенеза, позволяет изучить мишени и механизмы регуляторных эффектов ФЛ на активность ГГТ оси.

Ранее нами было показано, что метформин, широко известный антидиабетический препарат, способен усиливать эффекты однократно вводимого ХГЧ, взятого в относительно низкой дозе [11, 13, 14]. В рамках настоящего исследования мы изучили способность обработки крыс интраназально вводимым ФЛ потенцировать стероидогенные эффекты ХГЧ, также взятого в относительно низкой дозе – 15 МЕ/крысу. Мы показали, что трехдневная обработка крыс с помощью ФЛ вызывает значительное усиление эффекта ХГЧ через 90 и 180 мин после введения гонадотропина в сравнении с группой, получавшей только ХГЧ (рис. 2a). Регуляция синтеза тестостерона в клетках Лейдига семенников осуществляется через активацию эндогенными гонадотропинами рецептора ЛГ, что ведет к стимуляции активности белка StAR, транспортирующего холестерин из цитоплазмы в митохондрии к месту начала синтеза тестостерона, и цитохрома P450_scc, который катализирует превращение холестерина в прегненолон. Синтезированный в этой реакции прегненолон затем диффундирует в эндоплазматическую сеть и в серии последовательных реакций превращается в тестостерон [15]. Тем самым гены, кодирующие рецептор ЛГ (Lhr), белок StAR (Star) и цитохром P450_scc (Cyp11a1), являются ключевыми компонентами системы стероидогенеза. Нами показано, что обработка самцов крыс с помощью ХГЧ приводит к повышению экспрессии генов Lhr и Cyp11a1 в семенниках (рис. 3a). В то же время необходимо отметить, что значимых различий в уровне мРНК для генов Lhr и Cyp11a1 между группами “ХГЧ” и “ФЛ + ХГЧ” выявлено не было, что говорит об отсутствии заметных эффектов ФЛ на их экспрессию.

Способность лептина и его фрагмента влиять на тестикулярный стероидогенез и уровень тестостерона в крови обусловлена присутствием рецепторов лептина и нижележащих компонентов лептинового сигналинга (трансдукторные IRS-белки, нерецепторная тирозинкиназа JAK2, Akt-киназа, транскрипционные факторы STAT3/5) как в гипоталамических нейронах, так и в гонадотропах гипофиза и клетках Лейдига семенников [3]. Общепринято, что определяющую роль в регуляции ГГТ оси играют гипоталамические эффекты лептина [1, 3]. Однако данные о механизмах и мишенях влияния ФЛ на эту ось, в том числе информация о вовлечении в это влияние гипоталамических механизмов отсутствует. Для доказательства гипоталамических механизмов действия ФЛ нами было исследовано влияние антагониста GnRH-рецептора цетрореликса на стероидогенные эффекты ФЛ. При этом цетрореликс вводили в течение трех дней как отдельно, так и совместно с ФЛ и ХГЧ. Сам цетрореликс ожидаемо снижал уровень тестостерона в крови (рис. 2b) и экспрессию гена Star, играющего ключевую роль в регуляции тестикулярного стероидогенеза (рис. 3b). При этом мы наблюдали компенсаторное повышение экспрессии гена Lhr в семенниках, что может быть связано с необходимостью повысить плотность рецепторов ЛГ на плазматической мембране клеток Лейдига в условиях дефицита ЛГ, вызванного введением цетрореликса [16]. Далее самцам крыс, получавшим в течение трех дней цетрореликс, и животным, которые, помимо этого, интраназально получали ФЛ, на третий день однократно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу. В ответ на ХГЧ, через 180 мин после введения гормона было продемонстрировано восстановление до контрольных значений уровня тестостерона, сниженного при обработке цетрореликсом (рис. 2b), но потенцирования стероидогенного эффекта ХГЧ в группе с обработкой ФЛ (“АНТ + ФЛ + ХГЧ”) в этом случае выявлено не было. В группе “АНТ + ФЛ + ХГЧ” не было выявлено заметного эффекта ФЛ на стимуляцию гонадотропином экспрессии гена Star (рис. 3b). Таким образом, сделан вывод, что на фоне ингибирования ГГТ оси цетрореликсом ФЛ утрачивает способность усиливать стероидогенные эффекты ХГЧ, и это может указывать на то, что основной мишенью ФЛ, как и в случае полноразмерного лептина, являются компоненты лептиновой системы в гипоталамусе.

Таким образом, нами впервые показано, что ФЛ при однократном (но не трехдневном) интраназальном введении самцам крыс повышает у них уровень тестостерона в крови. При этом трехдневное введение ФЛ потенцирует эффекты ХГЧ, агониста рецептора ЛГ, на уровень тестостерона, хотя стимулирующие эффекты гонадотропина на экспрессию генов Star и Lhr, играющих ключевую роль в регуляции тестикулярного стероидогенеза, в присутствии ФЛ не меняются. Подавление стимулирующих эффектов GnRH на секреторную активность гонадотрофов гипофиза с помощью цетрореликса, антагониста GnRH-рецепторов, приводило к снижению уровня тестостерона в крови, а также к снижению экспрессии гена Star и компенсаторному повышению экспрессии гена Lhr в семенниках крыс. В условиях подавления ГГТ оси цетрореликсом, ФЛ не оказывал существенного влияния на стероидогенные эффекты ХГЧ, и это может свидетельствовать в пользу того, что мишенью действия ФЛ являются гипоталамические нейроны. В этой связи важно отметить высокую доступность гипоталамических структур при интраназальном способе введения ФЛ. Дальнейшие исследования фармакологической активности и механизмов действия ФЛ 116–122, миристоил-Ser-Cys-Ser-D-Leu-Pro-Gln-Thr-амида, как на мужскую, так и на женскую репродуктивную систему необходимы как для более глубокого понимания функций лептиновой сигнальной системы в контроле репродукции, так и для создания новых лекарственных средств для стимуляции репродуктивных функций и лечения бесплодия.