Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 7, стр. 921-932

ВВЕДЕНИЕ

Распространенность ожирения является серьезной проблемой общественного здравоохранения. По последним данным ВОЗ, в Европейском регионе 59% взрослых людей и 28% детей страдают от избыточной массы тела и ожирения [1]. Неблагоприятные последствия ожирения выражаются в повышенном риске развития сахарного диабета 2-го типа, сердечно-сосудистой патологии, заболеваний репродуктивной системы и др. Вместе с тем существуют данные о негативном влиянии ожирения на скелетные мышцы у людей разного возраста [2]. Связанная с возрастом потеря массы и функции скелетных мышц была названа “саркопенией”. Поскольку ожирение усугубляет функциональные ограничения, увеличивая трудности при выполнении физических действий, требующих мышечной силы, было введено определение “саркопеническое ожирение” [2]. Известно, что жировая ткань действует как эндокринный орган, секретируя многочисленные гормоны и провоспалительные цитокины. У лиц, страдающих ожирением, формируется повышенный уровень циркулирующих провоспалительных цитокинов [3, 4], при этом хронически высокие уровни фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) инициируют деградацию белка и снижение его синтеза, конечным результатом чего может быть прогрессирующая атрофия скелетных мышц. Снижение синтеза белка также может быть обусловлено и другими причинами: уменьшением уровня анаболических гормонов, которые способствуют нарастанию мышечной массы, силы и регенерации скелетных мышц [5–7], а также нарастанием окислительного стресса, связанного с митохондриальной дисфункцией [8]. Таким образом, современные данные литературы свидетельствуют о том, что одним из последствий ожирения может являться саркопения, затрагивающая не только массу мышечной ткани, но и функциональные характеристики мышц у людей. Однако механизмы этих неблагоприятных влияний на сегодняшний день недостаточно изучены, что требует дополнительных исследований. По мнению Gupta и Kumar, саркопения является проявлением широко распространенной эндокринной недостаточности, и в частности связана со снижением уровня тестостерона, обеспечивающего антикатаболическую функцию, синтез белков, регенерацию нервов и противовоспалительное действие [9]. В экспериментах на крысах установлено, что в мышечной ткани может протекать локальный синтез тестостерона и эстрадиола, который обеспечивает увеличение пула гормонов в ходе физических упражнений [10], однако нет сведений об изменениях внутримышечного синтеза андрогенов и эстрогенов при ожирении. Особую значимость имеет вопрос об эффективности оздоровительных вариантов коррекции ожирения, включающих физические нагрузки, поскольку они непосредственно могут влиять на состояние мышечной ткани.

Цель исследования – изучить влияние диет-индуцированного ожирения и оздоровительных вариантов его коррекции на масс-метрические и метаболические показатели тканей трехглавых мышц голени у крыс-самцов линии Вистар.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на половозрелых крысах-самцах линии Вистар (n = 80). Животные были введены в эксперимент в возрасте 2 месяцев. На I этапе крысы были случайным образом разделены на две основные группы, которые содержались либо на стандартной диете вивария (“СтД” – контроль, n = 26), либо получали высококалорийную диету (“ВКД”, n = 54) в течение 8 нед. На II этапе животные были дополнительно разделены на подгруппы, включающие физические нагрузки и переход от ВКД на СтД в течение следующих 8 нед. Контрольная группа была разделена на две подгруппы: 1) “СтД” (контроль), n = 13; и 2) “СтД + бег”, n = 13. Группа “ВКД” была разделена на четыре подгруппы: 3) “ВКД”, n = 14; 4) “ВКД + бег”, n = 13; 5) “ВКД/СтД”, n = 14; 6) “ВКД/СтД + бег”, n = 13.

Животные находились в режиме 12/12-часового цикла день/ночь, температуре 22 ± 2°С и влажности воздуха 60–65%. Выведение животных из эксперимента осуществлялось путем декапитации под наркозом с использованием тиопентала натрия. В соответствии с критериями комитета по биоэтике Института физиологии НАН Беларуси исключение животного из эксперимента проводится в случае его заболевания либо гибели. В ходе эксперимента был отмечен 1 случай заболевания (отит) у животного из группы “ВКД/СтД”, численность группы соответственно уменьшилась – из 14 крыс осталось 13 в данной группе. Общая численность животных на выходе из эксперимента составила 79 крыс.

ВКД состояла из дополнительного включения жиров животного происхождения (свиное сало) в стандартный рацион из расчета 45% от суточной калорийности корма и замещения воды на 10%-ный раствор фруктозы в свободном доступе (ad libitum) [11]. Умеренные физические нагрузки осуществлялись в виде бега на тредмиле 5 дней в неделю в течение 20 мин со скоростью 15 м/мин в утреннее время с 9:00 до 12:00 натощак [12]. Общая продолжительность тренировок составляла 8 нед. Выбор модели определялся тем, что физические нагрузки на моторной беговой дорожке с низкой и средней интенсивностью оказывают наиболее благоприятное нетравмирующее влияние на мускулатуру и суставной аппарат животных и поэтому могут использоваться в составе оздоровительных мероприятий [12].

Массу тела крыс еженедельно определяли на весах SATURN (Китай). После выведения животных из эксперимента проводили забор крови и тканей, взвешивание висцеральной жировой ткани и трехглавой мышцы голени на лабораторных весах (Scout Pro, Китай). Массовые коэффициенты (МК) висцерального жира и трехглавой мышцы голени рассчитывали по формуле: МК = (масса органа/масса тела) × 100%.

Для приготовления гомогенатов навески мышечной ткани измельчали на льду ручным гомогенизатором IKA T 10 basic (IKA-WERKE, Германия) с использованием 0.2-молярного Na-фосфатного буфера (рН 7.4). Определение в гомогенатах мышц общего белка, общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), глюкозы, лактата, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и креатинкиназы (КК) проводили на автоматическом анализаторе BS-200 (Mindray, Китай) с программным обеспечением BS-330. Использовали коммерческие наборы фирмы “Диасенс” (Беларусь) и набор “ЛАКТАТ-ВИТАЛ” (Россия), контроль качества осуществляли с применением контрольных сывороток Randox (Великобритания). Определение тестостерона, эстрадиола, кортизола и кортикостерона в сыворотке крови и гомогенатах мышечной ткани проводили с использованием ИФА-наборов фирмы ХЕМА (Россия). Малоновый диальдегид (МДА) определяли спектрофотометрическим методом [13].

Статистический анализ осуществляли с помощью ППП Statistica 10.0. Учитывая характер распределения значений по W-критерию Шапиро–Уилка, применяли параметрические, либо непараметрические методы статистики. Результаты выражали в виде средней величины и стандартного отклонения (М ± SD), либо в виде медианы и процентилей (Me [25; 75]) соответственно. Статистическую значимость межгрупповых отличий оценивали с помощью дисперсионного анализа ANOVA с последующим post-hoc анализом по F-критерию Фишера, если распределение носило нормальный характер, либо по H-критерию Краскела–Уоллиса с последующими апостериорными сравнениями при ненормальном распределении. Корреляционный анализ проводили c использованием коэффициента корреляции Спирмена. Отличия считали достоверными при уровне значимости р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как видно из рис. 1, в ходе эксперимента наблюдалась возрастная динамика нарастания массы тела у крыс всех групп. По окончании 16-недельного эксперимента средние значения массы тела крыс-самцов не имели достоверных отличий за исключением значимого снижения на 13% (р = 0.024) в группе “ВКД/СтД + бег” по сравнению с группой “ВКД”.

Рис. 1.

Масса тела экспериментальных животных в динамике эксперимента (М ± SD): 1 – “СтД”; 2 – “ВКД”; 3 – “ВКД/СтД”; 4 – “СтД + бег”; 5 – “ВКД + бег”; 6 – “ВКД/СтД + бег”. Статистическая значимость отличий при р < 0.05: $ \bullet $ – от группы “ВКД”

Масса висцеральной жировой ткани при стандартной диете была сопоставимой у крыс, ведущих “сидячий” и физически активный образ жизни (“СтД” и “СтД + бег”), а в группах “ВКД” и “ВКД + бег” – нарастала в 3 раза (р = 3.56 × 10^–7, р = 7.99 × 10^–8 соответственно) по сравнению с группой “СтД”. Массовый коэффициент (МК) висцеральной жировой ткани повышался в этих группах соответственно в 2.5 (р = = 1.13 × 10^–9) и 2.9 раза (р = 1.96 × 10^–12) по сравнению с контролем. При высококалорийном питании у самцов было выявлено достоверное снижение мышечной массы на 11% (р = 0.041) по сравнению с контролем, причем эта тенденция была еще более выраженной при ВКД в сочетании с бегом. У крыс группы “ВКД + бег” снижение мышечной массы по отношению к группам “СтД” и “СтД + бег” достигало 20% (р = 6.56 × 10^–4) и 22% (р = 1.44 × 10^–4) соответственно. При переходе к сбалансированному питанию независимо от физических нагрузок отмечалась нормализация массы трехглавой мышцы голени. Аналогичные сдвиги претерпевал и МК трехглавой мышцы голени у самцов – достоверное снижение в группе “ВКД” на 16% (р = 1.47 × 10^–5) по отношению к контролю и в группе “ВКД + бег” на 23% (р = 1.06 × 10^–7) и 24% (р = 8.51 × 10^–9) по сравнению с группами “СтД” и “СтД + бег” соответственно. При переходе к сбалансированному питанию независимо от физических нагрузок отмечалась нормализация показателя (табл. 1).

Учитывая связь между анаболическими гормонами и характеристиками мышечной массы и силы, представляло интерес обратиться к особенностям гормонального фона при ожирении и его коррекции (табл. 2). Очевидно, что у самцов в норме преобладающим половым гормоном является тестостерон, причем его содержание примерно на порядок превосходит содержание эстрадиола. При диет-индуцированном висцеральном ожирении уровень тестостерона в сыворотке крови снижался почти в 3 раза (р = 0.047) по отношению к контролю. Одновременно регистрировалось достоверное (р = 0.041) снижение массы трехглавой мышцы голени. Однако восстановление концентрации гормона у крыс группы “ВКД + бег” не приводило к коррекции мышечной массы. Пятикратное (р = 0.032) нарастание уровня тестостерона в группе “ВКД/СтД + бег” по сравнению с группой “ВКД” сопровождалось нормализацией мышечной массы. Что касается эстрадиола, то его концентрация в сыворотке крови самцов не претерпевала существенных изменений.

В отношении гормонов коры надпочечников у крыс известно, что преобладающим является кортикостерон, а кортизол рассматривается как минорный стероидный компонент коры надпочечников и, чаще всего, не учитывается в качестве показателя стресс-реакции. Как видно из табл. 2, содержание кортикостерона в сыворотке крови крыс контрольной группы было примерно в 10 раз выше, чем кортизола. Однако характер изменений обоих стероидных гормонов в эксперименте носил однотипный характер. Достоверное повышение уровней кортикостерона и кортизола было отмечено только в группе “ВКД + бег” по сравнению с “СтД + бег” (р = 0.011, р = 0.003 соответственно), что свидетельствует о наличии стресс-реакции при подключении физических нагрузок на фоне висцерального ожирения. Минимальные срединные значения этих гормонов были отмечены при сочетанной коррекции ожирения (“ВКД/СтД + бег”), и эти значения были значимо ниже, чем в группе “ВКД + бег” (р = 0.008, р = 0.002 соответственно). Во всех экспериментальных группах сохранялись достоверные (р < 0.05) корреляции между уровнями кортикостерона и кортизола (коэффициент корреляции в пределах 0.81–0.96).

Учитывая современные представления о синтезе тестостерона и эстрадиола во внегонадных тканях, и в частности в мышцах [10, 14], было проведено определение концентраций тестостерона и эстрадиола в гомогенатах мышечной ткани в расчете на г ткани. Как видно из данных табл. 3, содержание этих гормонов в мышечной ткани превосходило их концентрации в кровяном русле. Уровень тестостерона в мышечной ткани у самцов крыс в группе контроля был примерно в 1.5 раза выше, чем эстрадиола, хотя соотношения циркулирующих в крови гормонов отличались десятикратным преобладанием тестостерона. Интересно, что диет-индуцированное висцеральное ожирение и снижение мышечной массы не сопровождались резкими сдвигами содержания тестостерона и эстрадиола в мышечной ткани. Через сутки после окончания 8-недельного тренировочного периода также не было выявлено существенных сдвигов концентраций изучаемых гормонов. Повышение содержания эстрадиола на 21% (р = 0.045) было отмечено в группе крыс “ВКД + бег” по сравнению с группой “ВКД/СтД”.

Биохимические показатели мышечной ткани представлены в табл. 4. У крыс группы “СтД + бег” характеристики метаболизма не отличались от контроля. У крыс группы “ВКД” на фоне снижения мышечной массы было зарегистрировано достоверное повышение концентрации глюкозы на 35% (р = 0.021), лактата на 28% (р = 0.038) и тенденция к повышению активности ЛДГ на 31% (р = 0.061) по отношению к контролю, а также повышение в мышечной ткани концентрации лактата на 30% (р = 0.037) и активности ЛДГ на 40% (р = 0.006) по сравнению с группой “СтД + бег”. Подключение физических нагрузок на фоне ВКД и переход к сбалансированному питанию независимо от физических нагрузок служили адекватными подходами для нормализации метаболических сдвигов в мышечной ткани.

Состояние перекисного окисления липидов оценивали по уровню МДА в тканях трехглавых мышц голени. Как видно из рис. 2, у крыс группы “ВКД” было зарегистрировано достоверное повышение концентрации МДА на 52% (р = 0.007) в мышечной ткани по сравнению с группой “СтД + бег”. Отмечена тенденция к нарастанию концентрации МДА в группе “ВКД + бег” по сравнению с “СТД + бег” на 31% (р = 0.065). При переходе к стандартной диете значение показателя возвращалось к норме.

Рис. 2.

Уровень МДА в тканях трехглавых мышц голени у крыс-самцов в зависимости от типа диеты и физических нагрузок (Me [25; 75]): 1 – “СтД”; 2 – “ВКД”; 3 – “ВКД/СтД”; 4 – “СтД + бег”; 5 – “ВКД + бег”; 6 – “ВКД/СтД + бег”. Статистическая значимость отличий при р < 0.05: # – от группы “СтД + бег”.

Рассматривая влияние гормонального фона и перекисного окисления липидов на массу трехглавой мышцы голени у самцов крыс, представляло интерес оценить выявленные корреляции. В группе “СтД” мышечная масса имела достоверную обратную корреляцию с концентрацией эстрадиола, как в крови (r = –0.56, р = = 0.045), так и в мышечной ткани (r = –0.64, р = 0.035). В группе “СтД + бег” была выявлена положительная корреляция мышечной массы с уровнем МДА в мышечной ткани (r = 0.70, р = 0.007), что, возможно, указывает на физиологическую роль активных форм кислорода при сбалансированном питании и умеренных физических нагрузках в условиях, когда содержание МДА не выходит за пределы нормы [15]. В группе “ВКД” на фоне резкого снижения тестостерона в сыворотке крови сохранялась отрицательная корреляция между мышечной массой и содержанием эстрадиола в крови (r = –0.55, р = 0.045), и появилась значимая положительная корреляция с тестостероном крови (r = 0.61, р = 0.022), при этом мышечный МК давал высокую степень корреляции с тестостероном мышечной ткани (r = 0.93, р = = 4.07 × 10^–5). Противоположные взаимосвязи были выявлены в группе сочетанной коррекции ожирения “ВКД/СтД + бег”: на фоне супрафизиологического повышения содержания тестостерона в крови появлялась отрицательная корреляция между мышечным МК и тестостероном сыворотки крови (r = –0.55, р = 0.049).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенные исследования были направлены на выяснение патогенетических факторов, играющих роль в снижении мышечной массы при ожирении у самцов крыс. Предположительно, к таким факторам можно отнести неблагоприятные сдвиги в состоянии гормонального статуса и нарастание продукции активных форм кислорода.

Классические представления о регуляции репродуктивного статуса связаны с осью гипоталамус–гипофиз–гонады. Известно, что при избыточном питании лептин подавляет экспрессию кисспептина/GPR54 в гипоталамусе, что вызывает снижение секреции гонадолиберина и соответственно снижение уровня тестостерона, циркулирующего в крови, у мужчин с ожирением [16]. Однако современные исследования значительно изменили классические представления о том, что синтез половых гормонов происходит исключительно в гонадах. Показано, что андрогены и эстрогены синтезируются в различных органах и тканях, таких как мозг, кожа, печень, почки, кости и т.д. [17]. Авторы [16, 17] убедительно доказали, что экспрессия мРНК и белков, связанных со стероидогенезом: 3β-гидроксистероиддегидрогеназа (3β-ГСДГ), 17β-ГСДГ, 5α-редуктаза и ароматаза цитохрома Р-450, обнаруживается в скелетных мышцах. Благодаря этому тестостерон, эстрадиол и 5α-дигидротестостерон (ДГТ) могут локально синтезироваться в скелетных мышцах из дегидроэпиандростерона (ДГЭА) [18], который циркулирует в крови в избыточном количестве. Полученные нами данные согласуются с вышеприведенными работами [10, 17, 18] и позволяют предположить, что локальный синтез тестостерона обеспечивает относительно высокий и стабильный уровень гормона в мышцах и, по-видимому, в какой-то степени защищает мышечный метаболизм от резких перепадов анаболических влияний, обусловленных вариациями функциональной активности гонад.

Что касается показателей оценки стресс-реакции у крыс, то, как правило, проводится определение содержания кортикостерона в сыворотке крови, поскольку именно этот гормон является преобладающим стероидным гормоном коры надпочечников у грызунов [19], что было подтверждено также и в нашей работе. Однако, как показали полученные нами данные, динамика стрессорной реакции была однотипно отражена также и сдвигами концентрации кортизола в крови. Исходя из этого, кортизол, наряду с кортикостероном, тоже может использоваться при изучении реакции коры надпочечников на стрессирующие воздействия у крыс.

Оценка показателей метаболизма в мышечной ткани при диет-индуцированном ожирении у крыс выявило повышение содержания глюкозы, лактата и активности ЛДГ, что может отражать усиленное поступление энергетических субстратов из кровяного русла в мышечную ткань, а также активацию метаболизма глюкозы при высококалорийном питании. Однако современные литературные данные обращают внимание на признаки нарушения метаболической гибкости в скелетных мышцах при ожирении [20]. Показано, что на фоне избытка энергетических субстратов в мышечной ткани развивается неспособность адаптироваться к возникающим метаболическим проблемам, что проявляется в виде снижения окисления липидов и углеводов и накоплении токсичных недоокисленных продуктов [20]. Биохимические отклонения, выявленные в наших экспериментах, были сформированы за 8 недель высококалорийной диеты и носили обратимый характер, возвращаясь к норме за последующие 8 недель физических нагрузок даже на фоне избыточного питания, а также при нормализации диеты независимо от физической активности крыс-самцов линии Вистар.

Достоверное нарастание уровня МДА в мышечной ткани крыс при высококалорийном питании позволяет рассматривать перекисное окисление липидов как один из повреждающих факторов, сопутствующих снижению мышечной массы, что согласуется с литературными данными [8].

Полученные нами результаты в целом подтверждают представления о том, что избыточное питание и ожирение оказывают неблагоприятное воздействие на мышечную ткань и могут служить причинами саркопении [2, 3]. Анализ гормональных влияний приводит к выводу о том, что среди рассматриваемых стероидных гормонов именно тестостерон играет критичную роль для сохранения оптимальной мышечной массы у самцов крыс, что также согласуется с данными литературы [5, 6]. Корреляционные связи указывают на существенную зависимость мышечной массы от анаболического влияния тестостерона, однако эта связь значимо проявляется только при сниженном уровне гормона у крыс группы “ВКД”. Концентрация тестостерона в крови, двукратно превышающая норму (“ВКД/СтД + бег”), сопровождается извращением корреляционной зависимости между МК и тестостероном (положительная взаимосвязь меняется на отрицательную). По-видимому, для поддержания нормального объема скелетной мускулатуры необходимо сбалансированное в рамках физиологической нормы влияние андрогенов, что согласуется с литературными данными [5–7]. Можно предположить, что относительная стабилизация анаболических влияний на состояние мышечной ткани достигается за счет локального синтеза тестостерона и эстрадиола [10, 17, 18].

ВЫВОДЫ:

1. Длительная высококалорийная диета приводит к развитию висцерального ожирения и снижению массы трехглавой мышцы голени у крыс-самцов линии Вистар.

2. На фоне снижения мышечной массы при ожирении в скелетных мышцах регистрируются метаболические сдвиги – нарастание содержания глюкозы, лактата и активности ЛДГ, а также нарастание перекисного окисления липидов.

3. Висцеральное ожирение сопровождается снижением содержания тестостерона в сыворотке крови, но при этом в мышечной ткани сохраняются относительно стабильные концентрации тестостерона и эстрадиола.

4. Корреляционный анализ указывает на положительную связь мышечной массы с содержанием тестостерона в условиях его дефицита.

5. Применение регулярных умеренных физических нагрузок при высококалорийной диете не приводит к снижению массы висцерального жира, не предупреждает потерю мышечной массы, но способствует нормализации биохимических сдвигов в мышечной ткани крыс и вызывает нормализацию уровня тестостерона в сыворотке крови.

6. Наиболее адекватная коррекция висцерального ожирения, массы мышц и биохимических отклонений в мышечной ткани у крыс-самцов достигается при переходе от высококалорийной к сбалансированной диете независимо от физических нагрузок.