Успехи современной биологии, 2021, T. 141, № 3, стр. 287-295

ВВЕДЕНИЕ

Согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации объединенных наций (ФАО), в 2018 г. производство рыбы в мире достигло пикового объема и составило 178.5 млн т, из которых на долю промышленного рыболовства пришлось 96.4 млн т. Следует отметить, что показатели добычи рыбы последние 10–15 лет держатся на относительно постоянном уровне – 89.6–96.4 млн т (ФАО, 2020). Доля отечественного промышленного рыболовства, по экспертным оценкам, находится в пределах 5.0 млн т. Мировое рыболовство подошло к черте, за которой наращивать объемы промысла крайне сложно. Единственный способ, позволяющий увеличить потребление рыбной продукции, – выращивание рыбы в искусственных условиях. Уже сейчас почти половина всей рыбопродукции, потребляемой в пищу, производится из выращенной в аквакультуре рыбы. Объем продукции аквакультуры в 2019 г. составил 82.1 млн т, и нет сомнений, что ее доля на международном рынке будет только расти (ФАО, 2020). Согласно экспертным оценкам, для удовлетворения мировой потребности в рыбе, ее производство на рыбоводных предприятиях должно увеличиться к 2050 г. до 140 млн т. При этом Россия, располагающая крупнейшими в мире водными ресурсами, производит в настоящее время порядка 0.2% мировой продукции аквакультуры.

Огромные территории нашей страны, расположенные на Севере, позволяют активно развивать холодноводное индустриальное рыбоводство, получая высококачественную деликатесную продукцию в широком ассортименте. Однако в настоящее время российские рыбоводные хозяйства северных регионов ориентированы на производство в основном двух видов лососевых рыб: радужной форели Oncorhynchus mykiss и атлантического лосося Salmo salar L., так как эти виды традиционно выращиваются на севере Европы, США и Канады. Это позволяет приобретать за рубежом посадочный материал и корма для производства товарной рыбы, но данная направленность усиливает зависимость от импорта, последствия которого при введении санкций могут быть катастрофическими для рыбоводов. Решению проблемы может способствовать введение в аквакультуру рыб, обитающих в отечественных водоемах.

С этой точки зрения, перспективные объекты аквакультуры арктической зоны России – лососевые и сиговые рыбы, среди которых род Salvelinus (гольцы) занимает особое место. Встречаются различные экологические формы этого вида, как проходные (Новая Земля, бас. Карского моря), так и крупные жилые: ладожская и онежская палия, даватчан из оз. Фролиха в Забайкалье, боганидская палия и голец Дрягина из таймырских озер, каменный голец из бас. р. Камчатка, длинноголовый и белый гольцы из оз. Кроноцкое на Камчатке и др. (Атлас…, 2002). В европейской части России вне сплошного ареала представитель этого комплекса – палия S. lepechini Gmelin – встречается в Ладожском и Онежском озерах. Везде, где обитают проходные, озерно-речные, озерные, речные и ручьевые формы (экотипы) гольцов, они являются ценным объектом местного промысла. Каждый из этих экотипов имеет особенности миграций, питания, роста и размножения, что дает возможность осуществлять поиск перспективных популяций в природных водоемах, позволяющих вести их гибридизацию между собой для достижения эффекта гетерозиса и создания быстрорастущих пород. Эволюционно адаптированный к полярным условиям арктический голец является перспективным объектом для аквакультуры Севера России, уникальным объектом селекционной работы (Лукин и др., 2016; Журавлева, 2018).

При искусственном разведении рыб, особенно лососевых, первоочередная цель – создание маточных стад производителей, весь жизненный цикл которых проходит в заводских условиях. При этом возникает целый ряд селекционных задач, направленных на повышение эффективности заводского разведения. Наиболее актуальным при формировании маточных стад является отбор лучших производителей, а важнейшим критерием их оценки – качество потомства. Нами была предпринята попытка решения этой проблемы на примере ладожской палии, содержащейся в искусственных условиях.

Ладожская палия – эндемик Ладожского оз., относящийся к ценным видам рыб, единственный представитель лососевых, сохранивший здесь промысловое значение. Численность этого вида в последние десятилетия поддерживается благодаря искусственному воспроизводству. В начале века около 60% промыслового стада составляли особи, выращенные на рыбозаводах (Китаев и др., 2005).

Цель предлагаемого исследования – ранняя диагностика выживаемости потомства лососевых рыб на основе индивидуальной оценки самок ладожской палии заводского стада с использованием показателей качества икры, выживаемости эмбрионов и личинок до их перехода на смешанное питание.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили на базе Федерального селекционно-генетического центра рыбоводства, филиал ФГБУ “Главрыбвод”. Объект исследования – впервые созревшие самки ладожской палии в возрасте 4+, которые относятся к третьему поколению рыб, содержащихся в заводских условиях.

Исходное маточное стадо заложено в 1999 г. из икры палии, отловленной в Ладожском оз. на естественных нерестилищах. Выращивание рыб проводят в закрытом помещении в проточных бассейнах с ключевым водоснабжением. Температура воды зимой – 4.5°С, летом – 6.0–14.0°С. Корм рыб – гранулированные датские корма “БиоМар”. Диагностику самок на готовность к нересту проводили один раз в неделю. Для проведения экспериментальных работ в конце октября произвольно были отобраны 20 самок, готовых к нересту. У рыб определяли массу (г) и длину тела (см) по Смитту – расстояние от вершины рыла до конца средних лучей хвостового плавника. Отбор (сцеживание) икры проводили вручную. Количество икры и абсолютную плодовитость определяли порционно-весовым методом. Вычисляли также среднюю массу икринки (мг) и рабочую плодовитость самок. При работе с производителями применяли в качестве анестетика гвоздичное масло концентрацией 0.15–0.2 мл на 1 литр воды в течение 2–3 мин.

Для оплодотворения икры использовали самцов в возрасте 4+, сперму у которых получали путем ручного отцеживания в отдельные пробирки. Подвижность сперматозоидов проверяли под микроскопом. Для осеменения оставляли только те порции, где все 100% спермиев были активными.

Икру от каждой самки осеменяли свежеприготовленной смесью спермы 3–9 самцов в избыточном объеме для того, чтобы минимизировать влияние отдельных самцов на качество оплодотворенной икры. Таким образом, было заложено 20 вариантов опыта для оценки качества икры. Каждый вариант инкубировали на отдельной рамке инкубационного аппарата в условиях постоянной проточности 10 л/мин. Площадь рамки 40×40 см². Количества икринок на каждой рамке различались и составляли от 1300 до 3800 шт. При инкубации икры и выдерживании личинок температура воды была постоянной: 6 ± 0.3°С.

Погибшие икринки, после того как они утрачивали прозрачность и становились белыми вследствие коагуляции желточного белка, отбирали каждые 2–3 дня, что впоследствии учитывалось при обработке данных по жизнеспособности потомства на разных стадиях их развития. Репродуктивный потенциал самок оценивали по уровню оплодотворяемости икры и выживаемости эмбрионов и личинок.

Оценку проводили на разных этапах эмбриогенеза.

Первый этап проведен на 15-е сутки инкубации – на стадии обрастания желтка бластодермой зародыша (эпиболии). Пробы из 35 икринок от каждой самки помещали в раствор спиртово-уксусной смеси (1 : 3) для просветления оболочки и визуально определяли количества развивающихся зародышей и неоплодотворенной икры. По соотношению этих показателей в пробе вычисляли оплодотворяемость икры (%).

Второй этап проводили на 19-е сутки развития – на стадии завершения эпиболии: количество живых икринок относительно исходного количества инкубируемой икры – показатель выживаемости эмбрионов на стадии эпиболии (%).

Третий этап оценки – стадия пигментации глаз у зародышей. Общую потерю икры определяли по сумме икринок, погибших в период инкубации, и неоплодотворенной икры, сохранившей живую структуру до наступления стадии пигментации глаз у развивающихся зародышей. В это время можно было визуально различить икру с живыми эмбрионами, заметными через оболочку, и неоплодотворенные икринки, которые удаляли из опыта. Отношение численности живых эмбрионов к исходному количеству икры – показатель выживаемости эмбрионов на стадии пигментации глаз (%).

Четвертый этап проводился на 73-е сутки после завершения эмбрионального развития – на начальной стадии личиночного развития. В это время по количеству вылупившихся зародышей относительно исходного количества икры была получена оценка выживаемости эмбрионов на стадии вылупления (%).

После вылупления личинок наблюдения проводили только в период их эндогенного питания. Учитывали погибших личинок, а также уродливых особей, которые были потенциально нежизнеспособны (двухголовые, срощенные телами на одном желточном мешке), или особей с аномалиями, препятствующими нормальному росту и развитию (сильные искривления позвоночника и др.). Выживаемость личинок (%) оценивали, сравнивая количество нормальных личинок в период перехода их на активное питание с исходным количеством вылупившихся личинок.

Кроме того, критериями для оценки качества икры являлись:

– степень развития эмбриона на стадии эпиболии;

– сроки сохранения живой структуры у неоплодотворенной икры в период инкубации.

Степень развития эмбрионов определяли на 15-е сутки эмбриогенеза в пробе из 35 икринок, взятых от каждой самки. После просветления оболочки икры в спиртово-уксусном растворе (в соотношении 1 : 3) становились отчетливо видны ярко-желтая поверхность желтка и степень его обрастания светлой непрозрачной бластодермой зародыша. Площадь, занимаемая бластодермой зародыша, относительно всей поверхности желтка (%), отражала уровень эпиболии, или степень развития эмбриона в данный момент. Оценку проводили визуально с привлечением двух операторов, чтобы снизить субъективность.

Для изучения свойств неосемененной икры от каждой самки брали порцию овулировавших икринок (250–350 шт.) и помещали на инкубацию в отдельные ячейки инкубационной рамки. По количеству погибших икринок и по времени их гибели от начала инкубации определяли статистический показатель срока (сутки) массовой гибели икринок для каждого варианта проверки.

Статистический анализ проводили по стандартным методикам (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТАТЫ

Исследованные самки существенно различались по размерным и репродуктивным показателям (табл. 1). Крупные особи превосходили мелких по массе тела в 2.5 раза, а по длине в 1.2 раза. Различия между крайними показателями плодовитости достигали 3.5 раз. Плодовитость положительно коррелировала с массой и длиной тела: r = 0.71 и 0.58 (р < 0.01) соответственно. Средняя масса икринок не была связана ни с массой, ни с длиной тела, ни с плодовитостью самок.

ОБСУЖДЕНИЕ

Самки палии, выращенные в заводских условиях, характеризовались большим разнообразием по размерно-весовым признакам, что также наблюдается в природных популяциях арктического гольца (Королева и др., 2020; Lukin, 2013). Это связано с тем, что интенсивность обменных процессов у каждой особи различается, и, как следствие, отличаются темпы роста.

В наших исследованиях плодовитость рыб коррелировала с массой и длиной тела самок на высоком уровне: r = 0.71 и 0.58 соответственно (р < 0.01). В то же время средняя масса икринок не была связана ни с величиной самок, ни с их плодовитостью.

Выживаемость эмбрионов и личинок не зависела ни от размерно-весовых, ни от репродуктивных характеристик самок. Отрицательная взаимосвязь была обнаружена между процентом оплодотворения и средней массой икринок, то есть наблюдалась тенденция к снижению оплодотворяемости более крупной икры.

Полученные результаты важны для селекционной работы. Между тем, вопрос о влиянии размеров икры на жизнестойкость потомства до сих пор остается предметом дискуссии, поскольку результаты исследований носят противоречивый характер. Об этом свидетельствуют литературные данные, полученные для разных видов лососевых рыб (Pitman, 1979; Springate, Bromage, 1985; Estey et al., 1994; Barnes et al., 2003). Так, например, в исследованиях шведских специалистов, посвященных этому вопросу, не обнаружено зависимости выживаемости эмбрионов от величины икринок у арктического гольца (Jónsson, Svavarsson, 2000). Однако позже у этого же вида была выявлена положительная корреляция между средней массой икринок и выживаемостью личинок при температуре инкубации 2°С, а при 7°С взаимосвязь отсутствовала (Janhunen et al., 2010).

При оценке оплодотворяемости икры палии по количеству развивающихся зародышей в период эпиболии следует учитывать тот факт, что у палии в природных популяциях встречались оплодотворенные икринки, в которых развитие прекращалось на стадии гаструляции, и их сложно визуально отличить от неоплодотворенной икры. Эти икринки погибали в период завершения эпиболии у нормально развивающихся эмбрионов. Количество таких икринок на природных нерестилищах составляло всего 3–4% (Павлов и др., 1993). Учитывая редкость появления такой икры, можно полагать, что процент развития эмбрионов, полученный в нашем эксперименте, с большой точностью отражал достаточно высокий уровень оплодотворения икры. Наши данные согласуются с результатами ранее проведенных работ, когда при искусственном осеменении икры палии процент оплодотворения составлял 75–80% (Арендаренко, 1964). Такой же процент оплодотворения был отмечен у рыб на естественных нерестовых участках: 23% собранных икринок были неоплодотворенными (Павлов и др., 1993).

Для нормального развития икры ладожской палии были установлены оптимальные температурные пределы от 3.0 до 9.0°С (Павлов и др., 1993). В наших экспериментах инкубация проходила при температуре воды 6°С. Несмотря на благоприятные условия инкубации и высокий процент развития, выживаемость эмбрионов была низкой (в среднем 52%) и сильно варьировала в потомстве разных самок: от 2 до 92% (табл. 2). Мы полагаем, что различия были обусловлены индивидуальными особенностями самок и отражали значительную степень влияния материнского эффекта на характеристики потомства в ранний период развития. Наши данные согласуются с результатами исследований, проведенных на разных видах лососевых рыб: радужной форели (Craik, Harvey, 1984; Springate, Bromage, 1985; Patton et al., 2007), озерной формы кумжи (Lahnsteiner et al., 1999), чавычи (Barnes et al., 2003; Wipf, Barnes, 2012), где также отмечался высокий уровень разнообразия по выживаемости раннего потомства, определяемой индивидуальными особенностями самок. При этом не было обнаружено заметного влияния самцов на выживаемость эмбрионов и личинок (Nagler et al., 2000; Patton et al., 2007; Wipf, Barnes, 2012).

Различия по жизнестойкости потомства, проявившиеся на ранних стадиях эмбриогенеза, в значительной степени сохранялись при дальнейшем развитии зародышей и личинок. Об этом свидетельствовал высокий уровень корреляций между показателями выживаемости на всех этапах оценки. Ранее у самок радужной форели также была установлена взаимосвязь выживаемости икры на разных этапах эмбриогенеза и личиночного развития, начиная со стадии формирования зародышевого щитка и заканчивая подъемом личинок в толщу воды (Nagler et al., 2000).

Полученные нами данные позволяют проводить раннюю диагностику качества икры уже на стадии эпиболии и могут иметь практическую значимость при заводском разведении рыб, так как создают предпосылки для ранней оценки самок и возможности проведения отбора лучшей икры, полученной от этих самок для дальнейшего выращивания. Известно, что при одновременном осеменении икры вылупление личинок происходит в течение нескольких суток, что является отражением индивидуальных различий эмбрионов по скорости развития. В экспериментах, проведенных на радужной форели и ладожской палии с использованием полиаллельных скрещиваний, было показано, что сроки массового вылупления личинок в значительной степени определялись воздействием материнского организма (Шиндавина, 1987; Павлисов, 2017). Такой же вывод был сделан при оценке самок арктического гольца (Leblanc et al., 2016).

Согласно полученным нами данным, как в потомстве отдельных самок, так и между самками были выявлены значимые различия зародышей по среднему уровню обрастания желтка и по величине коэффициента вариации этого признака. Эти особенности развития зародышей были связаны с их жизнеспособностью. Чем выше был уровень эпиболии и чем меньше было разнообразие по этому признаку в потомстве отдельных самок, тем более высокой была жизнестойкость эмбрионов и личинок (табл. 6). Вместе с тем взаимосвязь между показателями степени обрастания желтка и его изменчивостью не достигала достоверного уровня, то есть отставание в развитии зародышей не всегда сопровождалось асинхронностью развития. Тем не менее, асинхронность развития является определяющим фактором жизнеспособности зародышей, так как именно с этим признаком была связана гибель зародышей на самом раннем этапе оценки выживаемости эмбрионов на стадии эпиболии.

Таким образом, стадия эпиболии является важным этапом, в значительной степени определяющим последующее развитие и жизнеспособность зародышей и личинок. Скорость и синхронность развития зародышей могут служить диагностическими признаками для оценки самок по качеству икры.

Результаты оценки неосемененной икры показали, что ранние сроки ее гибели свидетельствовали о более низком качестве яйцеклеток. При осеменении икры этих самок наблюдали повышенную гибель эмбрионов и личинок. Взаимосвязь сроков массовой гибели неосемененной икры с выживаемостью зародышей и личинок позволяет сделать вывод о том, что качество яйцеклеток еще до осеменения в значительной степени предопределяет жизнеспособность потомства. Это еще раз подтверждает, что материнский эффект является доминирующим в период раннего развития потомства.

Нам пока не ясно, связаны ли ранние сроки гибели неоплодотворенной икры с биологией палии, или они проявились в условиях заводского разведения. Результаты изучения палии Онежского оз. показали, что неоплодотворенные икринки могут сохранять живую структуру длительное время и погибают в основной массе, когда в нормальной икре завершается развитие эмбриона (Павлов и др., 1993). Этот процесс имеет большое значение при выживании кладки икры в природных условиях, так как препятствует развитию гнилостных процессов и сохраняет кладку икры до выхода личинок.

В наших исследованиях было показано, что исходная характеристика неоплодотворенных яйцеклеток по срокам сохранения их живой структуры и уровень развития эмбрионов в период эпиболии в осемененной икре не были достоверно взаимосвязаны между собой, несмотря на то, что оба эти показателя коррелировали с выживаемостью эмбрионов и личинок. Возможно, это объясняется тем, что качество неоплодотворенных яйцеклеток находится под воздействием генома самки, а при развитии зародышей вступают механизмы, контролируемые совместно геномами отцовского и материнского организмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования показали, что оценку качества икры можно проводить на самых ранних стадиях эмбриогенеза в период эпиболии.

Критериями оценки являются относительное количество развивающихся зародышей, которое характеризует оплодотворяемость икры, а также степень развития эмбрионов и синхронность их развития на стадии эпиболии. Эти три признака дополняют друг друга. При этом следует помнить, что процент оплодотворения и, следовательно, количество развивающихся эмбрионов зависят от взаимодействия трех факторов: готовности яйцеклеток к оплодотворению, оплодотворяющей способности сперматозоидов и биотехники осеменения. Жизнеспособность развивающихся зародышей и личинок зависит от качества яйцеклеток, которое формируется в ходе оогенеза, то есть зависит главным образом от индивидуальных особенностей материнского организма.