Успехи современной биологии, 2023, T. 143, № 5, стр. 506-511

ВВЕДЕНИЕ

Aristolochia indica принадлежит семейству Aristolochiaceae (Kanjilal et al., 2009; Jirovetz et al., 2019). Известны другие названия: родильница, трубочник, голландская трубка. Вид широко распространен в засушливых и полузасушливых регионах Индийского субконтинента (Bhattacharjee P., Bhattacharjee D., 2013). Морфологические характеристики A. indica: многолетнее ползучее растение с древесным подвоем (Soniya, Sujitha, 2006; Siregar et al., 2021). Различные элементы и части растения используются в народной медицине: свежий сок листьев – в качестве противоядия при укусах змей, корни – при лечении кожных заболеваний, кора и листья – для облегчения симптомов диареи и лихорадки, стебли – при врачевании сибирской язвы (Abhishiktha et al., 2015). Эти же компоненты применяются и при производстве лекарственных препаратов: абортивных, седативных, анальгетических, противовоспалительных средств, миорелаксантов, антигистаминных препаратов (Lerma-Herrera et al., 2022).

Важный компонент, содержащийся в растениях рода Aristolochia, – аристолоховые кислоты (АК) (Gökmen et al., 2013). AК – нитрофенантренкарбоновые кислоты, которые представлены двумя группами: аристолоховой кислотой I (AК-I) и аристолоховой кислотой II (AК-II) (Shibutani et al., 2007; Chen et al., 2012). АК – не только нефро- и гепатотоксины, провоцирующие хронические заболевания почек и печени, но и мощные канцерогены, ассоциированные с уротелиальной карциномой верхних мочевых путей. Употребление продуктов, содержащих АК, в частности отваров трав, вызывает нефропатию аристолоховой кислоты (Han et al., 2019; Liang et al., 2022). Также на бактериях, на клетках млекопитающих, в частности мышей, установлена (Mei et al., 2006) мутагенность и AК-I, и AК-II.

Neocaridina davidi, также называемая красной креветкой, – пресноводный организм, обычно встречающийся на азиатском субконтиненте (Siregar et al., 2021). У аквариумистов N. davidi пользуется признанием благодаря своему огненно-красному цвету. Но они также обладают характеристиками, обеспечивающими их широкое использование в научных исследованиях: быстрый рост, высокая скорость размножения и выживаемость. В частности, N. davidi являются отличной моделью для токсикологических исследований, поскольку они демонстрируют последствия воздействия различных препаратов в виде изменений в их жизненном цикле, в росте и в размножении (Hu et al., 2019; Parolini, 2020). Гепатопанкреас креветок, совмещающий привычные функции печени и поджелудочной железы, играет важную роль в переваривании, абсорбции, выделении и детоксикации, что делает его органом, способствующим выживанию при различных стрессах, имеющих источником окружающую среду. Белки теплового шока, также называемые белками стресса, – HSP (heat shock proteins) – вырабатываются не только при повышении температуры, но и при наличии различных стрессирующих агентов: пестицидов, тяжелых металлов или токсичных соединений. HSP70 – представители семейства белков теплового шока (с молекулярной массой 70 кДа), именно они первыми экспрессируются в условиях стресса; HSP70 – высококонсервативные белки, обладающие способностью восстанавливаться при повреждении (Gupta et al., 2010).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор и экстракция растительного материала. Растение A. indica собрано в питомнике Нагарджуна в Тодупуже 11.08.2022 г. Растительный материал подвергали поверхностной стерилизации с использованием моющего средства и промывали в водопроводной воде в течение 10 мин с последующей окончательной промывкой в дистиллированной воде перед проведением процедуры. Готовили 2%-ный (масса/объем) настой на листьях A. indica. Брали 15 г листьев, разделяли их на части, погружали в предварительно нагретую до 95°C дистиллированную воду и полученной смеси давали настояться 15 мин при комнатной температуре, прежде чем фильтровать через аналитическую фильтровальную бумагу.

Тест на токсичность у Neocaridina davidi. N. davidi выдерживали при искусственном освещении с достаточной аэрацией в течение 48 ч. Приготовили растительные экстракты пяти концентраций – 6000, 12 000, 18 000, 24 000, 30 000 частей на миллион, или ppm. Эти пять концентраций были применены к каждому из пяти наборов экспериментальных моделей.

Морфологические аномалии развития N. davidi. У каждой из креветок были обнаружены изменения и в глазах, и в хвостах. Одновременно выпуклые глаза и закрытые эндопод и экзопод (структуры хвоста) замечены при токсических состояниях.

Извлечение РНК и синтез кДНК. Ткань гепатопанкреаса брали у креветок и измельчали с помощью ступки и пестика, сразу помещая ее в 1000 мкл реагента Trizol (Invitrogen, USA) на 2 мин. В гомогенат добавляли 300 мкл хлороформа в соотношении 24 : 1 и хорошо перемешивали, встряхивая. Затем его центрифугировали при 12 000 g в течение 15 мин при 4°C. Водный слой экстрагировали в свежую центрифужную пробирку и добавляли 600 мкл изопропанола и перемешивали, переворачивая 2–3 раза с последующим центрифугированием при 12 000 g в течение 10 мин при 4°C. Над-осадочную жидкость отбрасывали и добавляли 75% холодного этанола для дальнейшей промывки. Снова центрифугировали при 7500 g в течение 5 мин при 4°C. Сливали надосадочную жидкость и высушивали РНК на воздухе в течение 10 мин. Наконец, ресуспендировали РНК в 20 мкл дистиллированной воды, не содержащей нуклеотидов. Общую РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК первой цепи с использованием набора для синтеза кДНК 6110А PrimeScript™ (Takara BIO, Japan) в соответствии с протоколом производителя.

Количественная ПЦР в реальном времени. Чтобы определить характер экспрессии гена hsp70 в тканях N. davidi, подвергшихся воздействию различных концентраций аристолоховой кислоты, проведена относительная количественная ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) на кДНК, полученной из общей РНК. В реакционном объеме 25 мкл использовали 12.5 мкл ПЦР-мастер-смеси SYBR Green (Thermo Fisher Scientific, USA), по 1.2 мкл прямого и обратного праймеров и 5 мкл матрицы кДНК. Количественную ПЦР проводили в циклических условиях: денатурация при 95°C в течение 10 мин, затем 45 циклов денатурации при 95°C в течение 15 с, отжиг праймеров при соответствующей температуре отжига в течение 30 с и удлинение при 72°C в течение 30 с.

Статистический анализ. Разницу между средними значениями одного гена анализировали с использованием одностороннего ANOVA, при p < 0.05 различия значимы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Смертельные случаи у N. davidi. При концентрациях 6000, 12 000 и 18 000 ppm не было выявлено смертности, и коэффициент выживаемости составил 100%. Две другие концентрации 24 000 и 30 000 ppm показали 20%-ный коэффициент смертности (табл. 1).

Морфологические аномалии у N. davidi. Проанализированные с помощью составного микроскопа Neocaridina davidi продемонстрировали изменения в глазах и в хвостах. При нормальных условиях структуры эндопода и экзопода находятся в открытом широко развернутом состоянии. В токсичных условиях в теле креветок произошли серьезные изменения, установлено закрытое состояние эндопода и экзопода (рис. 1). Даже после 72 ч воздействия у Neocaridina davidi хвост – и эндопод, и экзопод – продолжает быть закрытым, при этом отмечено, что глаза становятся выпуклыми, в то время как у особей, пребывающих в обычных условиях, хвост открыт (эндопод и экзопод), и глаза в норме.

Рис. 1.

Морфологические аномалии, наблюдаемые в глазах и в хвостах Neocaridina davidi, у которых при 6000 ppm были обнаружены нормальные глаза, а также открытые эндопод и экзопод. При 12 000, 18 000, 24 000 и 30 000 ppm отображены выступающий глаз, а также закрытые эндопод и экзопод.

Относительная количественная экспрессия. Общую РНК выделяли из гепатопанкреаса N. davidi, экспонированного 72 ч, и синтезировали кДНК для проведения количественной ПЦР в реальном времени, которая позволяет определить экспрессию гена hsp70 путем сравнения его с экспрессией гена β-актина. Анализ экспрессии показывает, что самая высокая транскрипция hsp70 наблюдается у Neocaridina davidi, подвергшихся воздействию токсина в концентрации 24 000 ppm на протяжении 72 ч. Остальные концентрации показали очень небольшую экспрессию генов, по сравнению с 24 000 ppm (рис. 2).

Рис. 2.

Относительная количественная экспрессия гена hsp70 у Neocaridina davidi при обработке различными концентрациями аристолоховой кислоты. Образцы: 1 – 6000, 2 – 12 000, 3 – 18 000, 4 – 24 000, 5 – 30 000 ppm.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании N. davidi рассматривается как идеальный модельный организм для токсикологических исследований (Hu et al., 2019). Этот вид обладает потенциалом быстрого распространения в пресноводной экосистеме. Длина тела взрослой особи может достигать максимального размера 2.85 см, что помогает в отслеживании в экспериментальных целях. Кроме того, исследования токсичности на тканевом уровне могут быть проведены либо на молекулярном, либо на биохимическом уровне (Siregar et al., 2021).

В этом исследовании N. davidi представляет собой идеальную нецелевую модель для изучения токсичности АК в отношении беспозвоночных. Исследования токсичности АК проводились на различных животных, в частности на рыбках Данио, но исследовательские работы, которые фокусировались бы на организмах, не являющихся мишенями, немногочисленны (Yang et al., 2012; Tian et al., 2021; Xu et al., 2021). В ряде исследований указывается на нефротоксическое действие АК на рыбок Данио, а также упоминается, что чрезмерное воздействие АК приводит к повреждениям почек и у других животных (Wang et al., 2020; Xu et al., 2021).

В нашем исследовании воздействие различных концентраций АК на красных креветок не привело к каким-либо поведенческим изменениям или уменьшению подвижности. Но в других токсикологических исследованиях отмечены всевозможные изменения двигательной активности (Al-Badran et al., 2019; Siregar et al., 2021). Коэффициент смертности креветок, подвергшихся воздействию наиболее высоких концентраций АК в нашем исследовании аналогичен коэффициенту, полученному в других недавно проведенных работах (Siregar et al., 2021).

В условиях экстремальной токсичности АК во внешнем виде креветок произошли серьезные изменения: отмечено закрытое состояние эндопода и экзопода. Аналогичные результаты наблюдались в предыдущих токсикологических исследованиях креветок в растворе токсина (Venkateswara Rao et al., 2007): эндопод и экзопод в закрытом состоянии через 48–72 ч после начала воздействия. Также наблюдалась выпученность глаз. При этом отмечено, что закрытое состояние не мешает передвижению креветок даже через 72 ч.

Гены белка теплового шока в основном принимают участие в ответе на стресс, спровоцированный окружающей средой, и влияют на акклиматизацию, а также физиологию, иммунологию, эндокринологию, развитие и старение морских организмов. В настоящем исследовании ставилась цель проанализировать количественную экспрессию гена hsp70 при экстремальном воздействии АК. Повышенная регуляция была отмечена при воздействии 24 000 ppm AК (при 72-часовой обработке), но уже при воздействии 30 000 ppm AК регуляция понижена. Такого рода колебания в паттерне экспрессии констатированы в предыдущих работах (Rungrassamee et al., 2010; Das et al., 2015). Главным образом это связано с тем, что экспрессия гена hsp70 колеблется под влиянием различных условий окружающей среды (Mahmood et al., 2014).

В настоящей работе установлено, что экстремальное воздействие АК вызывает морфологические деформации и влияет на стадии развития организмов, не являющихся мишенями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время аристолоховая кислота идентифицируется как группа токсинов, которые не только могут вызывать терминальную стадию почечной недостаточности, но также несут в себе высокую вероятность онкологических изменений в организме человека.

Мы успешно продемонстрировали неблагоприятное воздействие аристолоховой кислоты на нецелевой организм. Neocaridina davidi, подвергавшаяся воздействию различных концентраций аристолоховой кислоты, демонстрировала морфологические аномалии развития. Повышение концентрации приводит к летальному исходу.

Наши результаты также показали сверхэкспрессию гена hsp70 в образцах, обработанных высокими концентрациями аристолоховой кислоты.

Предыдущие исследования демонстрировали токсичность аристолоховой кислоты для целевых организмов. Наше исследование доказало вред данного токсина на примере нецелевых организмов – красных креветок.

Таким образом, наши результаты еще раз подтверждают необходимость особого внимания со стороны ВОЗ к отказу от использования аристолохии в медицинских целях.

При этом наши результаты открывают новые возможности для проведения трансляционных исследований, полезных для промысла креветок в частности, и для аквакультуры в целом.