Успехи физиологических наук, 2020, T. 51, № 2, стр. 37-54

ВВЕДЕНИЕ

Ионы Са²⁺ играют важную роль в возбудимых (нейронах, скелетно-мышечных волокнах, кардиомиоцитах, гладкомышечных клетках, гормонпродуцирующих клетках) и невозбудимых (клетках крови, печени, жировой ткани, костной ткани и др.) клетках и тканях. Они поступают в цитозоль из внешней среды и внутриклеточных кальциевых депо. Основная часть внутриклеточных ионов Са²⁺ депонируется в эндоплазматическом ретикулюме (ЭР), а в мышечных клетках – саркоплазматическом ретикулюме (СР). При необходимости ионы Са²⁺ выходят из ЭР (СР) в цитозоль и используются, например, для инициации сокращения. Ионы Са²⁺ выходят из ЭР при активации Са-каналов мембраны СР, например, ИТФ₃-чувствительных каналов и/или рианодинчувствительных каналов, что приводит к истощению их запасов в депо. Са-насосы мембраны ЭР (СР) или SERCA активным транспортом вносят ионы Са²⁺ из цитозоля в полость ЭР (СР) для восстановления их содержания внутри ЭР или СР, но этого в ряде случаев оказывается недостаточным. Оказалось, что имеются специальные белки, выполняющие функцию Са-каналов, по которым ионы Са²⁺ поступают в цитозоль из внеклеточного пространства, затем с помощью SERCA вносятся в полость ЭР (СР) и восстанавливают запасы кальция до требуемого уровня. Это депоуправляемые Са-каналы, или store-operated Ca²⁺ channels [76], или store-operated Ca²⁺ channels, или SOCs [27, 55], или store-operated Ca²⁺ (SOC) channels [64, 65], или store-operated calcium channel, или SOC [42], или store-operated calcium (SOC) channel [6, 70], или store-operated channels, или SOCs [11, 81], или SOC channels [21]. В русскоязычной литературе – это депо-управляемые катионные (SOC) каналы [3]. Первоначально они назывались как Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ channels, или CRAC channel [80, 81, 89], или Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ (CRAC) channels т.е. Са²⁺-каналы, регулируемые высвобождением Са²⁺ из внутренних депо [23, 79], или store-operated Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ (CRAC) channels [60], или store-release-activated channel, или CRAC [83], или CRAC channel [6, 54, 55, 57, 64], или CRAC ion channels [17], реже как каналы емкостного входа, capacitative Ca²⁺ entry channels, или CCE1 [67].

Процесс входа ионов Са²⁺ внутрь клетки по этим каналам называется как вход по каналам, управляемым кальциевым депо, или Store-operated calcium entry, или SOCE. Употребляется также термины Ca²⁺ stores activates Ca²⁺ influx [54], store-operated Ca²⁺ influx [23, 89], SOC entry [21], Ca²⁺-store-depletion-triggered Ca²⁺ influx, или Ca²⁺-store-depletion-mediated Ca²⁺influx, SOC influx [64]. В отечественной литературе – депоуправляемый кальциевый вход, или SOCE [2]. Используюся термины как capacitative Ca²⁺ entry, или CCE, т.е. емкостный вход ионов Са²⁺ [9, 11, 45, 54, 67, 76, 82] или capacitative calcium entry, или CCE [42, 58, 61], либо Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ (CRAC) channel activation [54, 70, 84].

Кальциевые токи, обусловленнные вхождением ионов Са²⁺ по каналам, управляемым кальциевым депо, обозначили как Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ current или I_CRAC [54, 64, 70, 81], или сalcium release-activated calcium (CRAC) currents, или CRAC current [23, 57, 60, 64], или store-operated CRAC current, или I_CRAC [57, 67], или inward current calcium release activated current, или CRAC [45], или Ca²⁺-release-activated Ca²⁺ (CRAC) signaling, или CRAC-mediated Ca²⁺ signaling [81], или Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ (CRAC) channel activity [89]. Реже употребляется термин I_SOCE [2].

Функцию входа ионов Са²⁺ из среды в цитозоль выполняют три типа белка: TRP – транзиторный рецепторный потенциал (transient receptor potential), Orai и STIM. В разных клетках могут экспрессироваться разновидности TRP – TRPС1, …, TRPС7, разновидности Orai, в том числе Orai1-, Orai2- и Orai3-каналы, а также разновидности STIM – STIM1 и STIM2.

В покое эти белки-каналы неактивны, а в период опустошения ЭР (СР) они активируются, и ионы Са²⁺ поступают в цитозоль, а затем с помощью SERCA, переносятся в полость ЭР (СР). Предполагают, что в активации TRP-, Orai- и STIM-каналов участвует некий мобильный фактор из опустошенного кальциевого депо [65]. На его роль выдвигались многие факторы, способные модулировать Са-каналы: G-белки, ингибируемые коклюшным токсином, малые G-белки, cGMP, различные липиды, протеинкиназы и другие вещества [65]. Наиболее интересным представлялся фактор входа Са²⁺-CIF лимфоцитов. Этот фосфорилированный анион индуцирует вход ионов Са²⁺ в Т-лимфоцитах, макрофагах и фибробластах. Предполагали, что CIF высвобождается или образовывается во внутриклеточных пулах при их опустошении. Но в настоящее время признано, что активация TRP-каналов происходит с участием белка – STIM1. Этот белок находится в мембране ЭР (СР) как Са-сенсор. При снижении содержания ионов Са²⁺ в ЭР (СР) белок меняет свою конформацию и диффундирует вместе с мембраной ЭР (СР) к плазматической мембране, где соединяется с TRP- и/или с Orai- и/или STIM2-каналом и за счет контакта типа “белок–белок” и активирует эти белки, т.е. способствует входу ионов Са²⁺ из внеклеточной среды в цитозоль.

История открытия SOC-каналов. Гипотеза существования Са-каналов, управляемых кальциевым депо, впервые была выдвинута Casteels, Droogmans в 1981 г. [13]. По обменным характеристикам кальциевых депо, чувствительных к норадреналину, в гладкомышечных клетках ушной артерии кролика установлено, что норадреналин повышал тонус сегментов ушной артерии, но этот эффект не блокировался блокаторами Са-каналов, в том числе препаратом D600 и никардипином, т.е. эффект не связан с входом ионов Са²⁺ из внеклеточной среды. Однако тонус, вызванный норадреналином, блокировался ионами Mn²⁺. Косвенно это означало, что этот тонус обусловлен высвобождением кальция из кальциевого депо. Замеры выхода меченного ⁴⁵Са из кальциевого депо подтвердили это. После истощения запасов кальция в депо содержание в нем ионов Са²⁺ восстанавливалось, и чем выше была концентрация ионов Са²⁺ в среде, тем выше была скорость восстановления. Гиперкалиевый раствор (140 мМ КСl) также вызывал сокращение, но оно блокировалось блокаторами Са-каналов, в том числе препаратом D600 и никардипином, а также ионами Mn²⁺. Следовательно, этот вид сокращения обусловлен входом ионов Са²⁺ из среды. Входящие ионы Са²⁺ пополняли запасы этих ионов в кальциевом депо. При этом ионы Mn²⁺ блокировали заполнение депо ионами Са²⁺. В интактной мышце ионы Са²⁺, вошедшие в миоциты из среды, заполняли кальциевое депо, а скорость этого заполнения была тем выше, чем выше концентрация кальция в среде. Блокаторы Са-каналов (препарат D600 и никардипин) не блокировали заполнение кальциевого депо ионами Са²⁺. Скорость заполнения кальциевого депо после его истощения была гораздо выше в обычных условиях, чем в бескальциевой среде, а степень заполнения кальциевого депо зависела от концентрации ионов Са²⁺ в среде. Переход ионов Са²⁺ из среды в депо идет по особым путям, которые не блокировались классическими блокаторами Са-каналов. Авторы предположили, что в физиологических условиях наполнение кальциевого депо ионами Са²⁺ происходило путем прямой связи между кальциевым депо и внеклеточной средой, т.е. в мембране есть специализированные Са-каналы, которые позволяют ионами Са²⁺ из внеклеточной среды непосредственно переходить в СР. Так была постулирована гипотеза о наличии специальных Са-каналов, управляемых кальциевым депо, или емкостных каналов для кальциевого депо.

Putney et al. [61] предположили, что после высвобождения кальция из ЭР и других чувствительных к гормонам эндогенных Са-хранилищ, их последующее заполнение происходило не только за счет обратного транспорта кальция из цитоплазмы АТP-азами, т.е. с помощью Са-насоса, но и при прямом поступлении внеклеточного кальция. При этом образовывался физический контакт между плазматической мембраной и мембраной внутриклеточных кальциевых депо. В месте контакта образовывалась пора, через которую и пополнялись запасы кальция в этих депо. Необходимым условием активации входа ионов Са²⁺ по такому механизму являлось опустошение кальциевого депо.

Все это иницировало поиск каналов, обеспечивающих восстановление запасов ионов Са²⁺ в ЭР (СР) и в других внутриклеточных хранилищах. Первыми были открыты каналы TRP в фоторецепторных клетках Drosophila и в клетках млекопитающих, а затем – каналы Orai и STIM.

Депоуправляемые Са-каналы, т.е. семейство SOC (в том числе TRP-, STIM- и Orai-каналы) ингибировались ионами лантана (La³⁺), или лантанидами [11, 26, 30, 73], ионами гадолиния, или Gd³⁺ [10, 34, 48, 69], ионами марганца, или Mn²⁺ [13], 2-аминоэтоксифенил боратом (2-аminoethoxydiphenyl borate, 2-APB [10, 29, 44, 49, 66], 2-аминоэтилдифенил боринатом, или 2-aminoethyldiphenyl borinate, или 2-APB [34, 41], препаратом SKF-96365 [11, 25, 41, 69], препаратом Pyr3 [34, 66], метил-бета-циклодекстрином [26], препаратом MK801 как неконкурентным блокатором глутаматных NMDA-рецепторов [88], неселективным блокатором протеинкиназы С хелеритрином [27], селективным блокатором изоформы дельта протеинкиназы С роттлерином [27], препаратом ML-9 как ингибитором киназы легкой цепи миозина [29], препаратом EVP4593 как структурным аналогом хиназолина [2], наночастицами ZnO до 20 нм [81].

Блокаторы Са-каналов семейства SOC были использованы в опытах с фоторецепторами дрозофилы [30], культурой клеток яичника китайского хомячка [81], культурой клеток НЕК293, т.е. клеток почки эмбриона человека [26], культурой клеток Ehrlich Lettre Ascites, или ELA [41], культурой клеток рака ротовой полости линии OC2 [14], нейтрофилами человека [66], Т-лимфоцитами человека [88], нейронами коры мозга мышей [11] и крысы [29], нейронами гиппокампа [49], клетками нейробластомы человека линии SK-N-SH и шипиковыми нейронами стриатума мыши, или MSN [2], а также с миоцитами мочевого пузыря морской свинки [44], аорты крысы [10, 34] и быка [10], легочной артерии кролика [25], дыхательных путей крысы [27], ушной артерии кролика [13], матки небеременных [48] и беременных женщин [48, 69, 73].

TRP-каналы первоначально были обнаружены у плодовой мушки дрозофилы еще в 1969 году Cosens, Manning [30, 45, 47]. Свое название они получили от английского выражения “transient receptor potential”, т.е. транзиторный рецепторный потенциал. Так был назван ген плодовой мушки (дрозофилы), при отсутствии или при мутации которого в ее фоторецепторе в ответ на его освещение вместо постянного рецепторного потенциала, длительность которого у дикого вида соответствует длительности светового воздействия, генеруется лишь кратковременный (транзиторный) потенциал несмотря на продолжаюшщее воздействие света. При этом мутанты в Т-образном лабиринте при низкой освещенности вели себя правильно, т.е. как и дрозофилы дикого типа (“положительно”), а при высокой освещенности вели себя как слепые. Этот ген, как оказалось, контролирует синтез Са-канала, активность которого управляется кальциевым депо. Именно наличие такого канала обеспечивает генерацию постоянного рецепторого потенциала при освещении фоторецептора дрозофилы. Природа белка, синтез которого контролировался геном TRP, была установлена в 1989 году Montell, Rubin [47]. Этот белок состоит из 1275 аминокислот, имеет 8 трансмембранных доменов и является Са-каналом фоторецептора. В 1992 году Hardie, Minke [30] доказали, что белок, синтез которого контролируется геном TRP, является Са-каналом. До воздействия света этот канал находится в закрытом состоянии. При действии света в фоторецепторе с участием фосфолипазы С образуется инозитолтрифосфат (ИТФ₃), который высвобождает ионы Са²⁺ из ЭР. Это повышает уровень ионов Са²⁺ в цитозоле и вызывает начальную часть рецепторного потенциала. При продолжающемся воздействии света в результате опустошения ионов Са²⁺ в ЭР происходит активация белка TRP, т.е. активация Са-каналов, что и создает условие для поддержания рецепторного потенциала в фоторецепторе. У мутантных дрозофил фоторецептор отвечал на свет не постоянной деполярищацией, а транзиторной, т.е. быстро проходящей, так как у мутанта отсутствует этот светочувствительный Са-канал. Они же показали [30], что ионы лантана La³⁺ в опытах с фоторецепторами дикого типа дрозофилы селективно блокирует TRP-канал. В результате этого в условиях освещения постоянный ответ (постоянная деполяризация) превращалась в транзиторный ответ, т.е. в ответ, который наблюдается у TRP-мутанта.

В 1995 г. вышли работы, где описывался белок, подобный по строению и свойствам TRP-белку дрозофилы [82, 91]. В частности, Wes [82] сообщили о клонировании гена человека, контролирующего синтез белка, похожего на белок канала TRP дрозофилы. Этому белку была происвоена абрревиатура hTRPC1. У многих позвоночных и беспозвоночных производство в клетках инозитол-1,4,5-фосфата порождало двухфазный Са-сигнал, т.е. повышение уровня ионов Са²⁺ в цитозоле. Первая фаза обусловлена выходом в цитозоль ионов Са²⁺ из внутриклеточных кальциевых депо (как правило, из ЭР), а вторая фаза возникала из-за того, что истощение запасов кальция в кальциевом депо активировало Са-каналы плазматической мембраны, через которые в цитозоль, а затем и в ЭР дополнительно входят ионы Са²⁺, т.е. происходит депоуправляемый вход ионов Са²⁺ (store-operated Ca²⁺ entry, или SOCE), или емкостной вход Са²⁺ (capacitative Ca²⁺ entry). Активация этих каналов не была связана с деполяризацией, т.е. это не потенциалуправляемые или агонист-управляемые каналы. Однако, что такое каналы, управляемые кальциевым депо (SOC), было не ясно. Используя свой опыт исследования гена и белка TRP дрозофилы группа Монтелла [47] показала, что белок hTRPС1 на 40% идентичен TRP дрозофилы, но в нем не было заряженных остатков в S4 трансмембранной области, которая во многих потенциалзависимых каналах являлась датчиком мембранного потенциала. У плодов человека экспрессия TRPC1 наиболее выражена в головном мозге, а у взрослых – в сердце, головном мозге, семенниках и яичниках. TRPC1 – представитель семейства белков TRP. Работы последующих лет, с одной стороны подтвердили выводы авторов, а с другой, указали, что не все белки семейства TRP являются кальциевыми депоуправляемыми катионными каналами. Группа исследователей [91], руководимая Бирнбаумером, в 1995 году сообщила о выделении в тканях человека гена и белка hTRP-1. Белок состоял из 793 аминокислотных остатков. На 37% он был идентичен и на 62% подобен TRP дрозофилы. Он экспрессировался во многих тканях человека, но особенно в яичниках, яичках, сердце и мозге. Авторы предположили, что этот белок выполняет функцию депоуправляемого Са-канала, т.е. принадлежал к семейству SOC. В 1996 г. Minke, Selinger [45] подтвердили результаты исследования Wes et al. [82] и Zhu et al. [91] и также предположили, что белок TRP у млекопитающих может быть одним из кальциевых каналов плазматической мембраны, который обеспечивает вход ионов Са²⁺ в ЭР и другие кальциевые депо после снижения ниже нормы ионов Са²⁺ в депо, т.е. после истощения кальциевого депо. В последующем TRP-каналы были найдены у позвоночных, в том числе у млекопитающих, где они экспрессированы во многих типах клеток и тканей [4, 5, 7, 10, 15, 18, 19, 25, 27, 28, 44, 48, 63, 69, 75, 82, 83, 91] и представлены 28 [46, 62, 87], или даже 30 разновидностями [56]. При этом каждому подсемейству присвоена аббревиатура (TRP) с добавлением как правило еще одного символа. Например, канал TRPС – это TRP-каналы кононические или классические (С-canonical или classic), т.е. transient receptor potential classic. В настоящее время наиболее изучены TRPС-каналы, представленные 7 подтипами (TRPС-1, …, TRPС-7). По мнению одних исследователей TRPС-каналы млекопитающих – это Са-каналы, управляемые кальциевым депо [2, 6, 17–19, 25–27, 37, 40, 41, 46, 48, 49, 58, 68, 76, 85, 90, 91]. Но, по мнению других авторов TRPС-каналы – это Са- или Na-каналы, управляемые агонистами [5, 10, 15, 33, 37, 40, 52, 67, 72, 75, 78, 84, 86, 89, 90]. Ряд авторов считают, что ТRPC-каналы управляются и кальциевым депо, и рецепторами. Среди них TRPC1- [6, 36, 41], TRPC4- [17, 46, 58] и TRPC5-каналы [37, 58].

Современная классификация TRP-каналов млекопитающих. TRP-каналы – это группа тетрамерамерных катионных Са- или Na-каналов плазматической мембраны многих клеток человека и животных [17].

У дрозофил известно два вида TRP фоторецепторов – собственно TRP [30, 45, 47] и TRPL [82, 91]. Оба канала участвуют в фототрансдукции, т.е. обеспечении преобразования воздействия фотонов в рецепторный потенциал. Именно TRP дрозофилы дал название подобным белкам клеток млекопитающих.

У млекопитающих известно около 20 [17], либо 28 [46, 62, 87], или даже 30 [56] TRP-каналов со структурными сходствами друг с другом. В частности, по Montell et al. [46], эти белки гомологичны на 90%, хотя свойства у них разные.

Предложено [46, 62, 87] все семейство белков TRP разделить на 6 подсемейств: 1) TRPC (canonical, канонические или классические), 2) TRPV (vanilloid, ваниллоидные), 3) TRPM (melastatin, меластатиновые), 4) TRPP (polycystin, полицистиновые), 5) TRPML (mucolipin, муколипиновые), 6) TRPA (ankyrin, анкириновые). Предложено [17, 56] добавить 7-е подсемейство – белок TRPN, или Drosophila NOMPC. По гомологии последовательностей все TRP-каналы подразделены на 3 подсемейства – TRPCx (или короткие), TRPVx (ваниллоидные или osm-9-like) и TRPMx (длинные, или меластатиновые). При этом наиболее характерные сегменты (домены) для каждого из трех подсемейств локализованы вдоль С-терминального конца, тогда как наиболее законсервированные области находятся в домене S6 – порообразующей части канала.

Подсемейство TRPV-каналов содержит 6 членов (TRPV1, …, TRPV6). Они выявлены в нейронах и в ГМК висцеральных органов (TRPV1). Каналы TRPV1–TRPV4 являются неселективными кальциевыми каналами, активируемыми температурой и другими внешними стимулами [46, 62, 87].

Подсемейство TRPM-каналов. Меластатин (melastatin) – ген, экспрессируемый в меланоцитах и участвующий в развитии немеланоцитов. Подсемейство TRPM-каналов содержит 8 членов, они содержат серин-треониновые протеинкиназы. Каналы экспрессированы в нейронах и других клетках. При этом TRPM3, TRPM6 и TRPM7 являются высокопроницаемыми как для ионов Са²⁺ и для ионов Mg²⁺, в то время как TRPM4- и TRPM5-каналы непроницаемы для ионов Са²⁺. Подсемейство каналов TRPM разделяют на 4 группы по их гомологии: TRPM1/3, TRPM2/8, TRPM4/5, TRPM6 [46, 62, 87].

Подсемейство TRPP-каналов содержит 8 изоформ, из которых каналами являются лишь TRPP2, TRPP3 и TRPP5. TRPP2-каналы важны для правильного расположения органов в эмбриогенезе. TRPP3-канал вовлечен во вкусовую рецепцию. TRPP5 играет роль в гомеостазе кальция [46, 62, 87].

Подсемейство TRPL-каналов содержит 3 изоформы, они способны модулировать клеточную выживаемость и аутофагию [82, 91].

Подсемейство TRPA-каналов. TRPA1-канал является единственным членом подсемейства. TRPA1-канал экспрессируется в волосковых клетках, в ноцицепторах малого диаметра, в ряде нейронов мозга. TRPA1 активируется сильным холодом и другими веществами, включая аллилизотиоцианат, аллицин и никотин. TRPA1-каналы играют важную роль в передаче боли, вызванной холодом или химическими веществами. Они также причастны к формированию и поддержанию воспаления [46, 62, 87].

Подсемейство TRPN-каналов. В качестве механорецепторов TRPN-канал реагируют на быстрое изменение механической силы. Не исключено, что они имеют отношение к проприорецепции и к восприятию звуков [17, 56].

Подробнее остановимся на характеристике TRPC-каналов.

Подсемейство TRPC (классических) каналов состоит из 7 белков – TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6 и TRPC7 [7, 58, 63, 67, 72, 86]. По характеру аминокислотной последовательности) все TRPC-каналы разделены [17, 46] на 4 группы – TRPC1 (группа 1), TRPC2 (группа 2), TRPC3/6/,7 (группа 3) и TRPC4/5 (группа 4). При этом считается, что рецептор-опосредованная стимуляция фосфолипазы С – это ключевое событие активации, характерное для всех изоформ TRPC. Кроме того, TRPC3, TRPC6 и TRPC7 активируются диацилглицеролом (DAG) [40, 78, 89], а TRPC4 и TRPC5 активируются кальциевым депо, т.е. являются Са-депоуправляемыми каналами [58].

Подсемейства TRPV, TRPM, TRPP, TRPML, TRPA, TRPН (NOMPC). Полагают [7, 46, 56, 62, 87, 89], что все эти белки-каналы находятся в плазматической мембране и функционируют как ионные (катионные) каналы, проницаемые для ионов Са²⁺, а также для натрия и/или магния. Они активируются различными стимулами, но среди них, как правило, нет каналов, которые бы активировались кальциевым депо. TRP модулируются фосфорилированием/дефосфорилированием или за счет других клеточных сигнальных механизмов, например, с участием кальмодулина, при этом каждый тип каналов обладает своими свойствами и функциями [62]. Эти каналы выполняют роль специфических рецепторов различных ощущений, так как с их участием происходит восприятие запахов, вкуса, тепла, холода, боли, осмотически активных веществ, степени растяжения клетки, вибрации. Белки TRP млекопитающих играют важную роль в сенсорной физиологии, физиологии сосудов, мужской фертильности [46]. Вероятно, такая специализация и привела к наличию 6 подсемейств TRP-каналов и отдельных групп в каждом из них. Возможно, что при отсутствии тех или иных каналов при генетических мутациях развивается патология, например, муколипидоз типа IV или поликистоз почек [12].

Общие представления о TRPC-каналах (функции и механизм активации). Считают [76], что все TRPC-каналы обеспечивают емкостный вход ионов Ca²⁺ (сapacitative Ca²⁺ entry, CCE, или Са-депозависимый вход ионов Са²⁺, или SOCE) приактивном истощении кальциевого депо (под влиянием агонистов, вызывающих образование инозитол 1,4,5-трифосфата (ИТФ₃), что повышает выход ионов Са²⁺ из кальциевого депо или при пассивном истощении этих запасов из-за блокады работы Са-насоса ЭР тапсигаргином. Например, активация TRРС2-каналов мышей, судя по появлению Са-тока (I_CRAC), происходит не только при повышении уровня ИТФ₃ в цитозоле, но и при истощении кальция в ЭР тапсигаргином [76].

Имеется две точки зрения на природу TRPC-каналов. Согласно одной из них, ТRPC-каналы относятся к смейству Са-депоуправляемых каналов [2, 6, 17–19, 25–27, 37, 40, 41, 46, 48, 49, 58, 68, 76, 85, 90, 91]. В частности, эта точка зрения касается TRPC1- [2, 6, 18, 19, 25–27, 41, 48, 49, 68, 85, 91], TRPC2- [76], TRPC3- [18, 19, 25, 85], TRPC4- [17–19, 46, 58, 85] TRPC5- [37, 40, 58, 90], TRPC6- [18, 19, 25, 26] и TRPC7-каналов [18, 19]. Непосредственным активатором TRPC-каналов при истощении ионов Са²⁺ в депо являлся белок STIM1 [2, 6, 26, 41]. Согласно второй точке зрения, ТRPC – это каналы, регулируемые рецепторами, ассоциированными с G-белком, в том числе с Gq-белком, а также непосредственнно активируемые ИТФ₃ и/или ДАГ [4, 5, 10, 15, 33, 37, 40, 52, 67, 72, 75, 78, 83, 86, 89, 90]. Активация TRPC-каналов происходит при взаимодействии ИТФ₃ (накопившегося при активации фосфолипазы С) с сайтом TRPC-белков, выполняющего роль ИТФ₃-рецептора. В обычных условиях этому взаимодействию препятствует кальмодулин, который, находясь на домене, содержащим ИТФ₃-рецептор, снижает сродство этого рецептора к ИТФ₃. Блокада кальмодулина, например, кальмидазолиумом (calmidazolium), или повышение уровня ИТФ₃, например, за счет активации фосфолипазы С при действии агониста, создают условия для взаимодействия ИТФ₃ с ИТФ₃-рецепторами, а тем самым – к активации TRPC-каналов. Различная чувствительность разных видов TRPC-белков к ИТФ₃ как их активатору зависит от аффиннности TRPC к кальмодулину, которая варьирует от 10 нМ у TRPС2 до 290 мМ у TRPС6. Вопрос об участии в активации TRPС-каналов продуктов гидролиза липидов под влиянием фосфолитпазы С, ИТФ₃ или ДАГ также активно обсуждается. Представление о TRPC-каналах как рецептор-управляемых каналах распространяется на все их семь разновидностей, в том числе на TRPC1- [5, 40, 67, 78, 89], TRPC2- [40, 78, 89], TRPC3- [5, 40, 67, 72, 78, 83, 89], TRPC4- [5, 10, 40, 67, 77, 75, 78, 89 ], TRPC5- [37, 40, 52, 78, 86, 89, 90], TRPC6- [5, 10, 15, 33, 40, 67, 72, 78, 89] и TRPC7-каналы [5].

Данные о вкладе ИТФ₃ и ДАГ в активацию каналов семейства TRPC неоднозначны. По одним авторам, решающую роль в активации TRPС1-каналов играет ИТФ₃ [6], по другим – ДАГ [5], в отношении активации TRPС2-каналов преимущественно говорят об участии ИТФ₃ [40, 78, 89], в отношении активапции TRPС3-каналы – речь идет о ИТФ₃ [40, 72], или о ДАГ [5, 67]. Полагают, что TRPС4-каналы активируют ИТФ₃ [67, 72, 75], TRPС5-каналы активируют ИТФ₃ [35, 52], а ДАГ, наоборот, препятствует эффекту ИТФ₃ [35], TRPС6-каналы активируют ИТФ₃ [72], либо, что более вероятно, ДАГ [5, 15, 33, 40, 67, 78, 89], TRPС7-каналы активируют ДАГ [5].

Существуети третья точка зрения, согласно которой ТRPC-каналы могут одновременно управляться и Са-депо, и рецепторами [6, 17, 37, 46, 58, 65]. Это относится к TRPC1- [6, 36, 41], TRPC4- [17, 46, 58] и TRPC5-каналам [37, 58].

Особенность механизма активации различных каналов семейства TRPC обусловлена их разной аминокислотной последовательностью [6, 17, 46]. На основании этого критерия, как отмечалось выше, все семь каналов семейства TRPC млекопитающих разделены на четыре группы – группа 1 (TRPC1), группа 2 (TRPC2), группа 3 (TRPC3, TRPC6, TRPC7) и группа 4 (TRPC4 и TRPC5) [17, 46]. Авторы указывают, что каналы группы 3 (TRPC3, TRPC6 и TRPC7) – рецептор-управляемые каналы, а каналы группы 4 (TRPC4 и TRPC5) и группы 1 (TRPC4) – Са-депоуправляемые каналы.

После формирования представления о Са-депоуправляемых каналах (SOC) и открытия каналов семейства TRPC у млекопитающих было высказано предположение о том, что именно TRPC-каналы выполняют функцию депо-управляемых каналов, но этот вопрос пока активно обсуждается. Так, Ambudkar et al. [6] указали, что все известные TRPC-белки активируются при агонист-стимулированном гидролизе фосфатидилинозитол-4,5, бисфосфата (PIP₂) до ИТФ₃ и ДАГ, и только некоторые из них (вероятнее, TRPC1) активируются при истощении ионов Са²⁺ в кальциевом депо ЭР и поэтому рассматриваются как представители SOC-каналов. Аналогично, Salido et al. [65] в обзорной работе отметили, что, несмотря на 20-летнее развитие представлений о SOC (депоуправляемых каналах), вопрос о роли TRPC-каналов в этом процессе остается открытым. По мнению этих авторов, лишь некоторые TRPC-каналы управляются кальциевым депо, судя по повышению Са-токов при истощении кальциевого депо (например, тапсигаргином) клеток с экспрессией соответствующего канала.

Функциональная роль TRPC-каналов. Многие медиаторы, гормоны и биологические активные вещества через эти каналы влияют на клетки-мишени при взаимодействии с рецепторами, ассоциированными с G-белками, в том числе c Gq-белками. Сторонники представления о TRPC-каналах как каналов, управляемых рецепторами, считают, что многочисленные агонисты, повышая активность фосфолипазы С, приводят к накоплению ИТФ₃ и ДАГ, это повышает Са-проницаемость TRPC-каналов [4, 5, 10, 15, 33, 36, 37, 40, 52, 67, 72, 75, 78, 83, 86, 87, 90]. Сторонники представления о TRPC-каналах, как управляемых кальциевым депо, считают, что агонисты, воздействуя на рецепторы, ассоциированные с G-белками, в том числе c Gq-белками, повышают активность фосфолипазы С, что приводит к накоплению ИТФ₃ и ДАГ. При этом ИТФ₃ за счет взаимодействия с ИТФ₃-рецепторами ЭР вызывет выход ионов Са²⁺ из ЭР и приводит к истощению запасов ионов Са²⁺ в ЭР. Это вызывает активацию белка STIM1, который вторично активирует TRPC, включая его в комплекс Са-каналов, обеспечивая поступление ионов Са²⁺ в цитозоль и в ЭР [2, 4, 6, 17–19, 25–27, 37, 40, 41, 46, 48, 49, 58, 68, 76, 85, 90, 91]. Таким образом, независимо от механизма активации, каналы семейства TRPC помогают медиаторам, гормонам и биологически активным веществам управлять клетками организма. Так, вероятно, происходит при активации TRPC1 под влиянием глутамата на культуре нейронов гиппокампа [49], при воздействии окситоцина на миометрий беременных женщин [5, 48], при действии интерлейкина IL-13 на миоциты бронхов крыс [27], при повышении активности TRPC4 окситоцином, ПГФ2альфа и АТФ в миометрии беременных женщин [75], при повышении активности TRPC5 агонистами М-холинорецепторов (ацетилхолином, карбахолом) на экспрессированных в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus TRPC5-каналов нейронов мыши [35, 37], при активации TRPC5-каналов на нейронах гиппокампа [37], в том числе при действии эпидермального фактора роста [35, 52] и гистамина [52], при активации этого канала антигеном на тучных клетках крысы [40], а также при повышении (под влиянием агонистов альфа1-адренорецепторов) активности мышиного TRPС6-канала, экспресссированного в клетках эмбриональной почки человека (HEK293) [33]. При этом показано, что активация TRPC1- [18, 19, 48, 75], TRPC4- [18, 19, 75] и TRPC7- каналов [19] повышает сократительную активность миометрия беременных и рожающих женщин или лабораторных животных. Полагают, что TRPC1-каналы важны для функционирования гладких мышц и других органов [7], участвуют в регуляции фаз клеточного цикла и объема клетки [41]. Активация TRPC5-каналов эпидермальным фактором роста обеспечивает рост и развитие нейронов (рост конусов, формирование синапсов) головного мозга, в том числе нейронов гиппокампа [37]. Кроме того, активация TRPC5 способствует пролиферации клеток [86], сократительной деятельности гладких мышц различных висцеральных органов [7], повышает иммунные свойства тучных клеток при воздействии антигена, в частности, дегрануляции [40]. TRPC6-каналы реализуют эффект активации альфа1-адренорецепторов [33] и, вероятно, другие клеточные эффекты.

Orai-каналы как разновидность Са-каналов, управляемых кальциевыми депо. Общепризнано существование Orai-каналов как разновидностей Са-каналов, управляемых кальциевым депо. При этом в семейство белков Оrai входят Orai1-каналы, Orai2-каналы и Orai3-каналы.

Белок Оrai открыт в 2006 г. независимо друг от друга тремя группами исследователей: Feske et al. [23], Vig et al. [79] и Zhang et al. [89]. В частности, Feske et al. [23] в опытах с Т-лимфоцитами человека обнаружили ген, контролирующий синтез белка Са-канала, управляемого кальциевым депо. Авторы назвали этот ген и белок Orai, т.е. ген дрозофилы. Показано, что отсутствие этого гена вызывает синдром наследственного тяжелого комбинированного иммунного дефицита (SCID), а его экспрессия в Т-лимфоцитах пациентов с данным синдром восстанавливает способность Т-лимфоцитов отвечать на антигенную активацию. Vig et al. [79] из нейронов дрозофилы выделили белок, усиливавший Са-ток, вызываемый истощением ионов Са²⁺ в ЭР тапсиграгином (CRAC). Этот белок был назван модулятором CRAC, т.е. CRACM1. Аналогичный белок был выделен из Т-лимфоцитов человека. Синтез этого белка контролировался геном FLJ14466. При его нокдауне клетки переставали генерировать CRAC – Са-ток, вызываемый истощением ионов Са²⁺ в ЭР. Следовательно, CRACM1 являлся одним из каналов семейства SOС, активность которого повышалась белком STIM. Zhang et al. [89] в клетках S2 дрозофилы идентифицировали ген olf186-F, ответственный за синтез белка, которой образовывал Са-канал, управляемый кальциевым депо. При его нокдауне в ответ на истощение ЭР тапсигаргином не происходил рост SOCE или CRAC (т.е. не возрастал Са-ток), а при его экспрессии эти процессы возрастали. Этот канал, которому авторы не дали специального названия, активировался белком STIM. Установлено, что ген olf186-F является членом высококонсервативного семейства четырех генов синтеза трансмембранных белков круглых червей Caenorhabditis elegans и всех представителей животного мира вплоть до человека. Wang et al. [81] на Т-лимфоцитах человека также обнаружили наличие Са-каналов, управляемых кальциевым депо, которые отличались от известных к тому времени Са-каналов. В последующих публикациях этот канал вслед за Feske et al. [23] называли то как CRACM1, то как Оrai, или как синонимы. Так, Peinelt et al. [57] свою статью, в которой они доказали способность белка STIM1 активировать CRACM1-канал, назвали “Amplification of CRAC current by STIM1 and CRACM1 (Orai1)". Soboloff et al. [70], назвали статью, где показана способность STIM1 активировать Orai1 в клетках линии NEK 293 (клетки почки эмбриона человека), как “Orai1 and STIM reconstitute store-operated calcium channel function”. Аналогично, Prakriya et al. [60] статью, в которой доказана роль Orai1 как важного компонента Са-каналов семейства SOC в клетках дрозофилы и в клетках млекопитающих, а также роль STIM1 как сенсора ионов Са²⁺ и активатора Orai1, назвали “Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel”. В последующих публикациях авторы использовали обозначение этого канала как Orai1.

В настоящее время известно, что Orai1-каналы имеются в Т-лимфоцитах [6, 23, 55, 61], а в плазматической мембране миоцитов сосудов, мочевого пузыря и бронхов имеются Orai1- [10, 25, 27], Orai2- [10, 25] и Orai3-каналы [10]. В миоцитах матки экспрессированы Orai1-каналы [48, 50] и Orai3-каналы [48], в кардиомиоцитах – Orai1-каналы [80, 83], в нейронах ЦНС человека и животных – Orai1-каналы [29, 42], в эндотелии легочных сосудов человека – Orai1-каналы [16]. Показана возможность искусственной экспрессия Orai1-каналов в клетках почек эмбриона человека, в клетках линии HEK293 [26], в клетках гибридом линии MEG01 [39] и в клетках рака предстательной железы человека [77].

Строение Orai-каналов. Сообщают [61], что Т-лимфоциты человека и других млекопитающих экспрессируют Orai1-, Orai2- и Orai3-каналы. Каждый из них имеет 4 трансмембранных домена и формирует тетрамеры. При изучении кристаллической структуры Orai дрозофилы (Drosophila melanogaster) с разрешением в 3.35 ангстрем, установлено [32], что этот канал находится в плазматической мембране и обеспечивает постоянный вход ионов Са²⁺ при истощении их запасов в ЭР. Он образован гексаметрическим ансамблем из Orai-субъедниц, окружающих пору. Пора проходит через мембрану и входит в цитозоль. Кольцо из остатков глутамата образует селективный фильтр. Закрытое состояние канала обеспечивается присоединением анионов к каналу недалеко от внутриклеточной стороны. Архитектура канала существенно отличается от устройства других ионных каналов. Авторы предположили, что этот канал обеспечивает селективный вход ионов Са²⁺. По данным Feske et al. [23], белок Orai1 содержал четыре трансмембранных домена.

Функция Orai1-каналов. Общепризнано, что Orai1 обеспечивает вход ионов Са²⁺ в цитозоль и в ЭР при снижении концентрации ионов Са²⁺ в ЭР и при выполнении специфических функций клетками, в том числе Т-лимфоцитами [6, 23, 55, 61, 88], миоцитами сосудов [10, 25], матки рожающих женщин [48, 50], кардиомиоцитами [80, 83], нейронами ЦНС [29, 42], эндотелием легочных сосудов человека [16]. Отсутствие гена Orai1 в Т-лимфоцитах не позволяет им активироваться антигенами, что формирует синдром наследственного тяжелого комбинированного иммунодефицита, или SCID [23]. Антигенная стимуляция Т-лимфоцитов запускает вход ионов Са²⁺ через Са-каналы семейства SOC, в том числе Orai1-каналы, повышает концентрацию ионов Са²⁺ в цитозоле, что активирует ядерный транскрипционный фактор NF-AT и деятельность Т-лимфоцитов [23]. Искусственная экспрессия Orai1 в Т-лимфоцитах таких пациентов восстанавливаеть вход ионов Са²⁺ из среды при истощении ионов Са²⁺ в ЭР и их иммунологическую активность [23]. Предполагают [27], что избыточная экспрессия Са-каналов семейства SOC, в том числе STIM1 и Orai1 – предпосылка развития аллергической реакции гладких мышц на воздействие аллергена или их посредника интерлейкина IL-13.

Механизм активации Orai1-каналов. При стабильном содержании ионов Са²⁺ в ЭР Са-канал Orai1 находился в неактивном состоянии, т.е. не пропускает ионы Са²⁺ в цитозоль и в ЭР. Однако его активация происходит под влиянием белка STIM1 – сенсора концентрации ионов Са²⁺ в просвете ЭР. Когда содержание ионов Са²⁺ в ЭР снижается ниже “нормы”, в частности, при активном выходе ионов Са²⁺ из ЭР в цитозоль через ИТФ₃-чувствительные Са-каналы при действии агонистов, или при пассивном снижении уровня кальция в ЭР, например, за счет торможении работы Са-насоса тапсигаргином, то в этом случае белок STIM1 передвигается к плазматической мембране, взаимодействует с находящимся в ней белком Orai1 и активирует его. Процесс активации Orai1 происходил за счет прямого белок-белкового взаимодействия с белком STIM1 [21, 55]. При активации Orai1 важную роль играет образование в плазматической мембране и мембране ЭР комплексов белков [6, 22, 83].

В целом, результаты исследований многих авторов указывают на существование особенного класса белков Orai – Са-каналов, управляемых кальциевым депо.

STIM1 и STIM2-каналы. Общепризнана еще одна разновидность Са-каналов, управляемых кальциевым депо. Это STIM-каналы, в том числе STIM1- и STIM2-каналы. Они были открыты в 2000 г. Manji et al. [43], которые описали новый белок мембраны ЭР с молекулярной массой 90 кДа, назвав его STIM1 (stromal interacting molecule, т.е. молекула стромального взаимодействия). Этот белок не секретировался клетками и не подвергался воздействию протеолитическими ферментами, но мог на посттрансляционном уровне модифицироваться, в том числе подвергаться фосфорилированию (главным образом по серину) и N-гликозилированию. Этот белок экспрессировался во многих клетках, в том числе в опухолевых – его гиперэкспрессия выявлена при G401 рабдоидной (палочковидной) опухоли, при рабдомиосаркоме грызунов, в клетках линии миобластов. Этот белок, ген которого находится в хромосоме человека 11p15.5, играет роль супрессора злокачественного опухолевого роста. Однако лишь в 2005 году Roos et al. [64], анализируя 170 различных генов в клетках S2 дрозофилы, обнаружили, что белок STIM1 играет важную роль в генерации Са-тока в различных клетках при воздействии тапсигаргина, т.е. при истощении запасов ионов Са²⁺ в ЭР. Это показано методикой пэтч-клампа на клетках S2 дрозофилы, на Jurkat Т-клетках человека, на клетках линии HEK293 (клетках почки эмбриона человека) и на клетках линии SH-SY5Y – во всех этих случаях нокдаун гена STIM1, т.е. снижение синтеза этого белка, уменьшало почти на 90% интенсивность Са-тока, вызываемого опустошением кальциевого депо тапсигаргином, т.е. CRAC или SOCE. В то же время суперэкспрессия этого гена в клетках HEK293 лишь незначительно повышала этот ток. В целом, было показано, что STIM1-канал, который экспрессирован у многих представителей животного мира (от дрозофилы до млекопитающих), играет существенную роль в генерации Са-тока, обусловленного истощением ионов Са²⁺ в кальциевом депо, т.е. являлся каналом, причастным к формированию CRAC или SOCE.

Распространенность STIM1 и STIM1. В плазматической мембране миоцитов сосудов, мочевого пузыря и бронхов экспрессирован STIM1 [10, 25, 27] и STIM2 [25], в миоцитах матки – STIM1 [48, 50], в кардиомиоцитах – STIM1 [80, 83], в Т-лимфоцитах – STIM1 [6, 55, 61], в нейронах ЦНС человека и животных STIM1 [2, 9, 29, 42] и STIM2 [9, 29], в клетках рака предстательной железы человека – STIM1 [77]. Удалось искусственно экспресссировать STIM1 в клетки линии HEK293, т.е. в клеткх почек эмбриона человека [26], в клетках гибридом линии MEG01 [39].

Строение STIM1 и STIM2. Установлено [21], что белок STIM1, экспрессированный повсеместно, – это одиночно пронизывающий мембрану белок с уникальным сочетанием структурных мотивов и их полипептидных последовательностей. Внеклеточные области содержат N-концевые непарные EF-руки, т.е. Ca-связывающие мотивы, прилегающие к нетрадиционному гликозилированному домену SAM. Цитоплазматическая область содержит альфа-биспиральные домены, гомологичные ERM-доменам, прилегающим к трансмембранным регионам. Эти домены аналогичны доменам, лежащим вблизи С-конца, и богаты фосфорилированными остатками пролина. При этом различие между STIM1-, STIM2-каналами и белка STIM дрозофилы (D-STIM) состояло в структуре их C-концевого участка, а также биспирального домена и домена ERM. С точки зрения биохимии доменов, белок STIM может связывать ионы Са²⁺ и одновремено образовывать связи с другими белками, например, типа STIM1-STIM1 и STIM1-STIM2.

Функции STIM1. Функциональное значение STIM1 как ключевого белка клетки выяснено недавно – этот белок является сенсором концетрации ионов Са²⁺ в ЭР и одновременнно он является активиром Orai1-канала и/или TRP-каналов плазматической мембраны [21]. Это установлено для Т-лимфоцитов [6, 23, 38, 55, 61, 88], миомцитов сосудов [10, 25], миоцитов матки рожающих женщин [48, 50], кардиомиоцитов [80, 83], нейронов ЦНС [2, 29, 42, 79], эндотелия легочных сосудов человека [16], для клеток S2 дрозофилы [60, 89], а также для клеток линии HEK293, т.е. клеток почек эмбриона человека [26, 70], клеток гибридом линии MEG 01 [39] и клеток рака предстательной железы человека [77]. Каким образом STIM1 активирует Orai-каналы или TRP-каналы? Наиболее популярно мнение, что первоначально белок STIM1 в мембране ЭР при снижении концентрации ионов Са²⁺ в ЭР передвигается для встречи с белками Orai и/или TRP плазматической мембраны. С одной стороны, такое перемещение сближает плазматическую мембрану и мембрану ЭР, с другой – активирует Orai и/или TRP и инициирует образование ансамбля белков (STIM1, Orai и/или TRP, а также SERCA, т.е. Са-насос мембраны ЭР), благодаря чему ионы Са²⁺ переходят из среды в цитозоль, а затем перекачиваются в люмен ЭР.

Функции STIM2-каналов. STIM2 отличается от STIM1 по функциям [9, 29]. Так, полагают [9], что в нейронах белок STIM1 функционирует как кальциевый сенсор и активатор Orai, TPRC и STIM1, а белок STIM2 выполнял функцию Са-канала, т.е. подобно Orai и TPRC обеспечивает вход ионов Са²⁺ в цитозоль ЭР. Именно STIM2 обеспечивал емкостной вход ионов Са²⁺ в нейроны, что в условиях гипоксии приводит к гибели нейрона [29]. Поэтому у мышей выбивание гена белка STIM2 повышало вероятность выживания нейронов при гипоксии [29].

Са-КАНАЛЫ, УПРАВЛЯЕМЫЕ Са-ДЕПО, ИЛИ SOC-КАНАЛЫ, В КЛЕТКАХ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ

SOC-каналы в гладких мышцах сосудов. Работы последних лет подтвердили наличие Са-каналов системы SOC в плазматической мембране миоцитов сосудов различной локализации, в том числе миоцитов аорты быка [10], аорты крысы [10, 34], легочной артерии кролика [25], малой мезентериальной артерии крысы [89], а также миоцитов мочевого пузыря морской свинки [44] и миоцитов бронхов крыс [27]. Таким образом, в плазматической мембране гладкомышечных клетков сосудов, мочевого пузыря и бронхов имеются Са-каналы семейства SOC, в том числе STIM1, STIM2, Оrai1, Orai2, Orai3, TRPC1, TRPC4, TRPC6, а также TRPV1, TRPV2, TRPV3. Эти каналы, наряду с потенциалчувстительными Са-каналами плазматической мембраны L- и Т-типа и Са-каналами ЭР, в том числе активируемыми через инозитолтрифосфат-рецепторы (ИТФ₃-R), обеспечивают агонист-вызванное сокращение, а также служат для пополнения ионами Са²⁺ ЭР при его активном истощении агонистами или пассивном истощении тапсигаргином, циклопиозоновой кислотой и другими ингибиторами Са-АТФазы ЭР (SARCA). Однако до настоящего времени остается неясным вклад каждого из этих семейств Са-каналов. Наличие в миоцитах Са-каналов семейства SOC открывает новые пути создания лекарственных препаратов, регулирующих уровень артериального давления пациентов с гипертонической болезнью или с гипотоническим синдромом.

SOC-каналы в миометрии. Миоциты матки наряду с потенциалчувствительными Са-каналами и ДАГ-активируемыми Са-каналами плазматической мембраны, а также ИТФ₃-активируемыми каналами мембраны СР, содержат Са-каналы семейства SOC [5, 15, 18, 19, 48, 50, 69, 73–75]. Это показано для миоцитов матки небеременных крыс [50] и небеременных женщин [5, 15, 19, 48, 50], а также миоцитов матки беременных женщин [5, 15, 48, 50, 69, 74, 75] и женщин накауне родов [18, 19, 50, 74] или в родах [19, 74].

Установлено, что в миоцитах матки могут находиться такие Са-каналы как TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, TRPC5, TRPC6, TRP7, а также STIM1, Orai1 и Orai2. В частности показано, что в миоцитах экспрессированы мРНК TRPC1-рецепторов [5, 18, 48, 50, 69, 75], TRPC2- [5, 69, 75], TRPC3- [5, 18, 69, 75], TRPC4- [5, 18, 50, 69, 75], TRPC5-, TRPC6- [5, 18, 50, 69, 75], TRP7- [5, 18, 69, 75], STIM1- [48, 50], Orai1- и Orai2- [48, 50]. Показано, что Са-каналы семейства SOC в миоцитах матки блокируются теми же блокаторами, что и в других тканях. Среди них – ионы лантана (La³⁺) [73], ионы гадолиния (Gd³⁺) [48, 69], препарат SKF-96365 [69].

Экспрессия Са-каналов семейства SOC зависит от этапа репродуктивного процесса [18, 19, 73, 74]. Было предположено [18, 74], что в родах роль Са-каналов семейства SOC в регуляции сократительной деятельности матки возрастает. Действительно, на первичной культуре миоцитов беременных женщин (перед родами) показано [73], что интерлейкин 1-бета (10 нг/мл), как один из возможных индукторов родов, при 24-часовом воздействии на миоциты повышает экспрессию Са-насосов СР и увеличивает возбудимость миоцитов, что объясняется авторами повышением активности Са-каналов семейства SOC и рассматривается как один из компонентов индукции родов. В другом исследовании установлено [19], что перед родами и в родах у женщин повышается экспрессия мРНК белка TRPC1, а у рожениц также возрастала экспрессия мРНК TRPC6 и TRPC7. В то же время экспрессия мРНК TRPC3 и TRPC4 при беременности и в родах не менялась. Эти авторы также показали, что цитокин интерлейкин ИЛ1-бета как один из факторов, индуцирующих роды, не вызывает экспрессию мРНК TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC6 или TRPC7, но повышает экспрессию белка TRPC3. Авторы полагат, что белки TRPC (1–7) как Са-каналы семейства SOC играют важную роль в регуляции сократительной деятельности матки рожениц, а интерлейкин ИЛ1-бета за счет влияния на экспрессию белка TRPC3 индукцирует родовую деятельность [19]. Вопрос о предродовых и родовых изменениях экспрессии мРНК других представителей Са-каналов семейства SOC, в том числе STIM1, STIM2, Orai, Orai1 и Orai3 остается открытым.

Проведена оценка функциональной роли Са-каналов семейства SOC в миоцитах матки. Эти каналы активировались при пассивном истощении запасов ионов Са²⁺ в СР ингибиторами Са-насосов СР (т.е. SERCA), в том числе тапсигаргином [5, 48, 69, 75], или циклопиазоновой кислотой [48, 73, 74]. Эти каналы восстановливали концентрацию ионов Са²⁺ в СР. Они активировались агонистами рецепторов, ассоциированных c G-белком, в том числе, окситоцином [5, 48, 50, 69, 75], простагландином F2альфа [75], АТФ [75], т.е. при активном истощении запасов ионов Са²⁺ в СР. Показано [75], что нокдаун мРНК ТRPC4 в миоцитах матки беременных женщин ослаблял увеличение внутриклеточного кальция в цитозоле, вызываемое (с участием G-белка) окситоцином, простагландином F2альфа или АТФ, но не влиял на повышение кальция, вызываемое ДАГ (диацилглицеролом) или при блокаде работы SERCA тапсигаргином. Это означает, что каналы типа TRPC4 важны для реализации сигнального пути, ассоциированного с G-белками. Остается много неясного в управлении экспрессией мРНК Са-каналов семейства SOC и управлении активностью этих каналов, в том числе с участием прогестерона, эстрогенов, катехоламинов и других гормонов и БАВ.

SOC в миокарде. Вопрос о роли Са-каналов семейства SOC в деятельности миокарда остается открытым [1]. Показана экспрессия мРНК hTRPC1 и hTRPC4 в кардиомиоцитах человека [63], а также наличие Orai1 и STIM1 в кардиомиоцитах новорожденных крыс, которые участвуют в снижении уровня ионов Са²⁺ в цитозоле во время диастолы и способствуют восстановлению запасов ионов Са²⁺ в СР при ингибировании работы SERCA тапсигаргином [80]. В этих же опытах показано, что в отличие от белка STIM1, белок Orai1 как кальциевый канал уменьшал основные размеры кардиомиоцитов, уровень mRNA предсердного и мозгового натриуретического пептида, снижал активность кальциневринсигнальной системы (кальциневрин – активатор иммунного надзора). Оба белка, и STIM1, и Orai1, полностью блокировали гипертрофию кардиомиоцитов, вызываемую фенилэфрином, и повышали экспрессию натриуретического фактора ингибированием ассоциированного с Gq-белком кальмодулинкиназного и ERK1/2 сигнального пути. Авторы подчеркнули, что только Orai1 (но не STIM1) предотвращал Gq-опосредованной CаN-зависимый пролиферативный сигналинг (путь). Авторы заключают, что STIM1 и Orai1 играют ключевую роль в регуляции роста нормальных и гипертрофированных кардиомиоцитов [80].

Показано [83], что в кардиомицитах крысы экспрессированы TRPC3, STIM1 и Orai. Са-каналы, управляемые через различные рецепторы (TRPC3, ИТФ3, Orai, RACK1 (receptor for activated protein kinase C-1, т.е. рецептор для активации протеинкиназы С-1). При действии агонистив эти каналы объединяются в ансамбли и обеспечивают вход ионов Са²⁺ из среды и заполнение кальциевого депо. Ключевую роль в таком объединении играет белок TRPC3, так как подавление его экспрессии предотвращало образование ансамбля Са-каналов. Сообщают [28] о наличии TRPC в кардиомиоцитах, и о их причастности к развитию сердечной патологии. Таким образом, в кардиомиоцитах содержатся TRPC, в том числе TRPC1, TRPC3 и TRPC4, а также STIM1 и Orai1.

SOC-каналы нейронов мозга. Большинство физиологических функций нейронов (нейросекреция, долгосрочное потенцирование, синаптическая пластичность, экспрессия генов, клеточный рост, дифференцировка нейронов и пр.) регулируются, как известно, за счет изменения концентрации кальция в цитозоле. Это достигается поступлением ионов Са²⁺ из среды в цитозоль по потенциалчувствительным Са-каналам и по Са-каналам, управляемым кальциевым депо, т.е. по Са-каналам семейства SOC, а также поступлением ионов Са²⁺ из внутриклеточных кальциевых депо, т.е. из ЭР и митохондрий нейрона. Так, показано [11], что в нейронах имеются депоуправляемые Са-каналы, т.е. каналы семейства SOC, которые функционируют независимо от попотенциалуправляемых Са-каналов плазматической мембраны, так как они открываются лишь при истощении запасов ионов Са²⁺ в ЭР. Эти авторы исследовали на нейронах коры (E13, E14, E16 и E18) плодов и новорожденных мышей механизм функционирования каналов семейства SOC, активируя их пассивным истощением запасов кальция в ЭР тапсигаргином. При этом появлялся Са-ток, который не зависел от блокаторов Са-каналов (Cd²⁺ и Ni²⁺), но снижался ингибитором SOCE – препаратом SKF-96365. Ионы La³⁺ полностью подавляли Са-токи у новорожденных мышей, но не блокировали этот ток у нейронов плодов, т.е. уже в эмбриональном периоде нейроны содержат SOC и их свойства по мере созревания организма меняются. Показано [2], что у пациентов с болезнью Хантингтона под влиянием экспрессии гена хатингтина, или хентингтина (Htt138Q, Htt138Q-1exon), повашается и экспрессия мРНК TRPC1 – одного из Са-каналов семейства SOC. Это состояние сопровождается повышенным содержанием ионов Са²⁺ в цитозоле нейронов, что приводило к их апоптозу. Таким образом, дальнейшее изучение роли Са-каналов семейства SOC в деятельности нейронов в физиологических условиях и патогенезе нейродегенеративных и других заболеваний ЦНС весьма перспективно.

SOC-КАНАЛЫ В НЕВОЗБУДИМЫХ КЛЕТКАХ

SOC-каналы в клетках крови. Как известно [54], в электрически невозбудимых клетках приток ионов Са²⁺ необходим для экзоцитоза, ферментной активности, экспрессии генов, клеточного роста, пролиферации, апоптоза и других процессов Основной путь вхождения кальция клетки невозбудимых тканей являются Са-каналы семейства SOC, т.е. депоуправляемые Са-каналы.

SOC-каналы в Т-лимфоцитах. Установлено [23, 51, 71], что для активации и развития лимфоцитов важна активация транскрипционных ядерных факторов, в том числе фактора NF-AT. Ионы Са²⁺ входят в лимфоцит по Са-каналам семейства SOC, в том числе по каналам STIM1 и Orai1 [23]. Отсутствие Orai1 в Т-лимфоцитах, как уже отмечалось, приводит к формированию синдрома наследственной тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (SCID), что характерно для людей, гомозиготных по мутации гена Orai1 [23]. Экспрессия Orai1 в Т-клетках таких пациентов восстанавливала способность входа кальция из среды в ответ на высвобождение кальция из ЭР [23]. Это открытие имело важное значение в понимании физиологической роли одного из важнейших Ca-каналов семейства SOC, каким является белок Orai1.

SOC-каналы в нейтрофилах. Са-каналы семейства SOC важны и для функционирования нейтрофилов [66]. В нейтрофилах человека есть два пути активации входа ионов Са²⁺. Один из них – это рецептор-управляемый, или агонист-управляемый путь. Его активность возрастает при воздействии провоспалительных агонистов, в том числе хемотоксического пептида fMet-Leu-Phe (FMLP), лейкотриена В-4 (LTB₄) с хемокинетической и хемотактильной активностью, а также тромбоцитарного активирующего фактора (PAF). Второй путь, это поток ионов Са²⁺ по Са-каналам семейства SOC. Они активируются при снижении запасов ионов Са²⁺ в ЭР в результате пассивного истощения за счет ингибирования SERCA тапсигаргином, а также при активном истощении кальциевого депо указанными выше агонистами. При действии fMet-Leu-Phe (FMLP), лейкотриена В-4 (LTB₄) и тромбоцитарного активирующего фактора (PAF) возрастали оба потока ионов Са²⁺ из среды в цитозоль через агонист-управляемые каналы, и через Са-депоуправляемые каналы, т.е. через Са-каналы семейства SOC. В нейтрофилах они представлены TRP-каналами, так как Са-ток по этим каналам, т.е. SOCE, блокируется классическим блокатором Са-каналов семейства SOC препаратом 2-аминоэтоксидифенил боратом (2-Aminoethoxydiphenyl borate, 2-APB), а также блокатором TRP-каналов препаратом Pyr3. Однако какой вид TRP-каналов экспрессирован в нейтрофилах – пока остается неясным.

SOC-каналы в лимфобластах. Клетки лимфоцитарного ряда могут служить индикатором состояния Са-каналов семейства SOC в других тканях и органах. Так, показано [53], что болезнь Хантингтона обусловлена наличием гена, кодирующего белок хентингтина (HTT). Вследствие этого в нейронах повышалась экспрессия Са-каналов семейства SOC, в том числе TRPC1, что повышает вероятность их апоптоза. В лимфобластах пациентов с болезнью Хантингтона также повышена экспрессия Са-каналов семейства SOC, и поэтому из-за высокого содержания ионов Са²⁺ в цитозоле происходит гибель митохондрий этих клеток.

SOC-каналы в эритроцитах. Daniels et al. [20] на эритроцитах человека c помощью фуры-2 показали, что тапсигаргин, нейропертид Y и альфа-тромбин высвобождали ионы Са²⁺ из кальциевых депо, чувствительных к инозитолтрифосфату, и приводили к повышению концентрации ионов Са²⁺ в цитозоле. Запасы кальция в этом депо пополнялись поступлением ионов Са²⁺ внутрь эритроцитов из среды, так как при предварительном выдерживании эритроцитов в бескальциевой среде реакция на нейропертид Y и альфа-тромбин блокировалась. Результаты исследования косвенно свидетельствовали о наличии в эритроцитах Са-каналов семейства SOC.

На эритроцитах человека с использованием флуоресцентного зонда фура-2 и тапсигаргина как ингибитора Са-насоса ЭР показано [24], что концентрация ионов Са²⁺ в цитозоле повышается относительно медленно. Косвенно, это означало наличие в эритроцитах человека ЭР, из которого ионы Са²⁺ могут поступать в цитозоль и вновь откачиваться в ЭР с помощью Са-насоса (SERCA). Это позволило предположить наличие в эритроцитах человека Са-каналов семейства SOC.

При использовании конфокальной микроскопии установлено [8], что эритроциты варана (ящерицы, lizards Ameiva ameiva, Squamata, Teiidae), имеющие ядро, содержат три вида кальциевых депо, контролирующие уровень кальция в цитозоле: 1) ЭР, из которой кальций освобождается под влиянием тапсигаргина или при активации инозитолтрифосфат-рецепторов (ИТФ₃-Р), 2) кислые депо, их которых кальций высвобождается монензином (Na⁺/H⁺-ионофор), нигерицином (K⁺/H⁺-ионофор) и бафилормицином А1 (bafilomycin, ингибитор протонного насоса), 3) депо, из которого кальций выходит под влиянием иономицина как ионофора кальция.

В целом, сведения о наличии Са-каналов семейства SOC в эритроцитах, в том числе в эритроцитах человека, крайне малочисленны и, как правило, косвенные. Поэтому вопрос о конкретных типах SOC-каналов в эритроцитах остается открытым.

SOC-каналы в других невозбудимых клетках. Полагают [54], что не только в клетках крови, но и других электрически невозбудимых клетках приток ионов Са²⁺ необходим для регуляции всех физиологически важных процессов, так как основной путь вхождения кальция в этих клетках – это Са-каналы, управляемые кальциевым депо, т.е. Са-каналы семейства SOC. Функционирование этих каналов лучше всего отражает I_CRAC (SOCE), который порождается током ионов Са²⁺, который идет из ЭР, митохондрий и внеклеточной среды. В частности, в остеоцитах человека выявлена экспрессия мРНК hTRPC1 и hTRPC4 [63], в клетках простаты человека – мРНК hTRPC1 и hTRPC4 [63], в эпителиоцитах легких человека – мРНК hTRPC1 и hTRPC6 [63], в клетках плаценты человека – мРНК hTRPC1 и hTRPC6 [63], в эндотелии легочных сосудов человека – мРНК TRPC и Orai1 [16]. Cа-каналы семейства SOC выявлены в адипоцитах бурой ткани крысы [31], в клетках яичника китайского хомячка [81] и в ацинарных клетках околоушных желез [59].

SOC-каналы в опухолевых клетках. На “бессмертных”, или иммортализованных линиях клеток, слитых с другими клетками (гибридомы) и на первичных культурах раковых клеток показано, что они также содержат Са-каналы семейства SOC. Так, в клетках рака предстательной железы человека имеется мРНК Orai1 и, в меньшей степени, мРНК STIM1 и TRPC1 [77, 85]. Са-каналы семейства SOC обнаружены в клетках рака ротовой полости (линия OC2) [14], а также в клетках эпидермальной карциномы человека (линия А431) [3], в опытах с которыми показано, что при активном опустошении ЭР (агонистами, ассоциированными с фосфолипазой С) или при пассивном опустошении (ингибированием Са-насоса тапсигаргином) возникает депоуправляемый Са-ток, т.е. SOCE [3]. Очевидно, что ингибирование SOC-каналов опухолевых клеток может быть перспективным методом онкотерапии.

РОЛЬ SOC-КАНАЛОВ В ЭФФЕКТАХ РЯДА БАВ

Катехоламины. Имеются лишь единичные работы оценки вклада Са-каналов семейства SOC в эффекты катехоламинов при активации альфа- или бета-адренорецепторов (АР). Так, сообщается, что при активации альфа-АР происходит активация Cа-каналов семейства SOC, что и приводит к росту тонуса гладких мышц ушной артерии кролика [31, 89]. Показана причастность Са-каналов семейства SOC к тонотропному эффекту фенилэфрина при активации альфа-АР миоцитов сосудов [89] и к эффекту активации бета₃-АР адипоцитов, в результате которой происходило разобщение оксилительного фосфорилирования в митохондриях [31].

Ацетилхолин. О роли Са-каналов семейства SOC в эффектах агонистов М-холинорецепторов есть единичные исследования, проведенные на ацинарных клетках околоушных желез [59] и на клетках яичника китайского хомячка [81]. Так, для ацинарных клеток околоушных желез установлено, что карбахол повышает продукцию слюны, что блокируется атропином. При этом рост секреторной активности клеток сопровождался повышением ионов Са²⁺ в цитозоле клетки, судя по накоплению ⁴⁵Са [59]. Авторы объяснили этот эффект активацией Са-каналов семейства SOC. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования роли Са-каналов семейства SOC в эффектах агонистов М-холинорецепторов, в том числе агонистов М1-, М2-, М3-, М4- и М5-холинорецепторов.

Экстракты растений. Показано, что релаксирующий эффект некоторых экстрактов растений может происходить за счет активации SOC-каналов [34]. Так, в опытах с кольцевыми сегментами грудного отдела аорты крысы авторы показали, что спиртовый экстракт ксантоцераса рябинолистного (Xanthoceras sorbifolia), или чекалкина ореха рябинолистного, снижал их тонус, который предварительно был повышен фенилэфрином. В основе релаксирующего влияния этого экстракта лежало повышение продукции NO эндотелием, так как входящие по Са-каналам семейства SOC ионы Са²⁺ повышали экспрессию NO-синтазы. Под влиянием NO возрастало содержание в миоцитах цГМФ, что активировало калиевые каналы и вызывало релаксацию миоцитов. Причастность эндотелия к релаксирующму эффекту экстракта доказана тем, что релаксирующий эффект экстракта блокировался удалением (денудацией) эндотелия, а также под влиянием ингибитора NO-синтазы препарата L-NAME или под влиянием ингибитора гуанилатциклазы препарата ODQ. А причастность к релаксирующему эффекту Са-каналов семейства SOC доказана тем, что релаксирующий эффект экстракта снижался при действии тапсигаргина (как ингибитора SERCA) или при действии ингибиторов этих каналов, в том числе препарата 2-APB, т.е. 2-аминоэтилдифенил борината и ионов гадолиния (Gd³⁺).

Однако далеко не во всех случаях сосудорелаксирующий эффект БАВ растений обусловлен активацией Са-каналов семейства SOC. Так, Zhang et al. [89] на кольцевых сегментах малой мезентериальной (брыжеечной) артерии крысы, исходный базальный тонус которых повышался фенилэфрином, показали, что, действительно, императорин, полученный из царского корня (Imperatoria Ostruthium L.) оказываает мощное сосудорасширяющее действие. Авторы показали, что этот эффект императорина обусловлен его способностью блокировать потеценциалчувствительные Са-каналы L-типа, так как эффект императорина аналогичен релаксирующему эффекту нифедипина как блокатора этих каналов. В то же время Са-каналы семейства SOC в этом процессе не участвовали, если судить по характеру внутриклеточных потоков ионов Са²⁺, наблюдаемых при конфокальной микроскопии. Кроме того, императорин не способен был ингибировать сокращение, вызываемое тапсигаргином, т.е. при истощении запасов ионов Са²⁺ в ЭР.

ПРИЧАСТНОСТЬ SOC-КАНАЛОВ К ФОРМИРОВАНИЮ ПАТОЛОГИИ

TRPC-каналопатия. Сообщается [68], что снижение экспрессии TRPC-каналов или полное их отсутствие приводит к развитию патологии, например, при недостатке TRPC1- и TRPC3-каналов ингибируется пролиферация нейронов, а потеря TRPC1- ведет к нейродегенерации. Отмечено [2], что при избыточной экспрессии TRPC1 развивается болезнь Хантингтона, так как возрастает внутриклеточная концентрация ионов Са²⁺, что индуцирует апоптоз, в том числе за счет повышения уровня ядерного транскрипционного фактора NF-каппа B. На культуре нейронов гиппокампа показано [49], что глутамат в больших концентрациях активирует TRPC1-каналы, повышая тем самым уровень ионов Са²⁺ в цитозоле, что индуцирует апоптоз. Отмечена причастность отдельных изоформ белка TRPC к патогенезу сахарного диабета, диабетических осложнений [28]. Происходящие при воспалении в эндотелии сосудов нарушения межклеточных границ и образование межклеточных мостиков обусловлено вхождением в эндотелиоциты ионов Са²⁺ по каналам семейства SOC, в том числе по отдельным видами TRPC [16]. Как правило, речь идет о причастности к развитию патологии TRPC1-каналов [2, 49, 68], но не исключается и роль в этом процессе других представителей семейства TRPC-каналов [2]. Это позволяет утверждать, что TRPC-каналы являются потенциальными терапевтическими мишенями при лечении различных заболеваний. Так, на клетках нейроблаcтомы человека показано [2], что препарат EVP4593 снижает тапсигаргин-индуцируемые токи и, тем самыми, снижает вероятность гибели этих клеток, что говорит о перспективности применения данного препарата для лечения пациентов с болезнью Хантингтона.

При нейродегенеративных заболеваниях, в том числе при болезни Альцеймера, болезни Хантингтона, при амиотрофическом латеральном склерозе, при болезни Паркинсона, а также при биполярном расстройстве (маниакально-депрессином расстройстве) повышена экспрессия Са-каналов семейства SOC, что вызывает избыточное накопление ионов Са²⁺ в цитозоле, и как следствие – апоптоз нейронов. Так, полагают, что TRPС-, TRPМ-, TRPV-, TRPM-, TRPP-, TRPML- и TRPA-каналы имеют прямое отношение к развитию болезни Альцгеймера [87].

Болезнь Хантингтона. Показано, что развитие болезни Хантингтона, при которой человек постепенно лишаются памяти, когнитивных навыков и нормального движения, связано с наличием дефектного гена (гена хантингтина, Htt), который приводит к избыточной экспрессии Са-каналов семейства SOC, что повышает содержание ионов Са²⁺ в цитозоле нейронов, и как следствие – к дисфункции митохондрий, экспрессии ядерного транскрипционного фактора NF-каппа В и, в конечном итоге, к апоптозу нейронов [2, 53]. Так, установлено, что митохондрии лимфобластов пациентов с болезнью Хантингтона имеют более низкий потенциал мембраны и уровень деполяризации при более низких нагрузках кальция, чем митохондрии в контроле [53]. Аналогичные дефекты обнаружены и в митохондриях нейронов мозга трансгенных мышей, экспрессирующих полнометражный мутант гентингтина [53]. Вигонт и соавт. [2], моделируя болезнь Хантингтона на нейронах нейробластомы человека (SK-N-SH) и шипиковых нейронах стриатума мыши (MSN), выявили, что введение в нейроны гена хантингтина (Htt1) повышало экспрессию TRPC1. Это увеличивало внутриклеточную концентрацию ионов Са²⁺. А соединение EVP4593, являющееся структурным аналогом хиназолина, снижало амплитуду депоуправляемых Са-токов в клетках SK-N-SH, экспрессирующих Htt138Q, и в клетках MSN, экспрессирующих Htt138Q-1exon. Это говорит о перспективности создания лекарственных средств на основе соединения EVP4593 для лечения нейрогенеративных заболеваний.

Роль SOC-каналов в эксайтотоксическом эффекте глутамата. На нейронах гиппокампа показано [49], что под влиянием больших концентраций глутамата в них увеличивается экспрессия белка TRPC1, вследствие чего, возрастает интенсивность емкостного входа ионов Са²⁺ в клетку (SOCE) и индуцируется апоптоз. Удаление генов белка TRPC1 повышало устойчивость нейронов к глутамату, т.е. снижало вероятность глутаматиндуцированной гибели нейронов. Аналогичный эффект наблюдался при блокаде SOC с помощью 2-аминоэтилдифенил борината. Авторы предположили, что TRPC1 – это перспективная мишень предотвращения или уменьшения глутаматиндуцированного повреждения нейронов.

Роль SOC-каналов при гипоксии нейронов. В опытах с нейронами коры мышей установлено [9], что при гипоксии нейронов повышается экспрессия STIM2. Это увеличивает интенсивность SOCE и приводит к избыточному накоплению ионов Са²⁺ в цитозоле, что индуцирует апоптоз нейронов. Выбивание генов белка STIM2 повышает выживаемость нейронов в условиях гипоксии.

Роль SOC-каналов в формировании висцеральной патологии. Изменение экспрессии TRPC-каналов рассматривают в качестве одной из основых причин развития диабета, диабетической нефропатии и диабетической васкулопатии, сердечнососудистых заболеваний и заболеваний почек [28].

Роль SOC-каналов в формировании врожденных иммунодефицитных состояний. Выше уже сообщалось о том, что у человека для функционирования Т-лимфоцитов как участиника иммуногого надзора необходимо наличие Orai1-канала, отсутствие которых вызывает ряд врожденных иммунодефицитных состояний [23]. Показано, что экспрессия Orai1-каналов в Т-лимфоцитах таких пациентов восстанавливает способность входа ионов Са²⁺ из среды в ответ на высвобождение кальция из ЭР и возвращает этим лимфоцитам их способность проявлять иммунологическую активность [23]. Тем самым продемонстрирован новый путь лечения этих заболеваний.