Высокомолекулярные соединения (серия А), 2020, T. 62, № 4, стр. 256-262

ВВЕДЕНИЕ

Основной задачей тканевой инженерии является воссоздание органов человека или животного, утраченных вследствие травм или болезней. Для этого используют тканеинженерные конструкции, состоящие из одно-, двух- или трехмерных матриц, стволовых или соматических клеток, факторов роста, стимулирующих пролиферативную активность клеток, а также их направленную дифференцировку [1, 2]. Такой материал, помещенный в живой организм, приводит к регенерации нативной ткани (костной, мышечной, сосудистой, покровной и т.д.). Одновременно с формированием новой ткани или органа под действием биологической активной среды происходит резорбция полимерной матрицы. Главное требование к материалу матрицы, а также продуктам ее резорбции – отсутствие негативного влияния на окружающие ткани. Второе требование – прогнозируемая скорость резорбции, которая должна быть сопоставима со скоростью формирования ткани. Преждевременное биоразложение полимерной матрицы будет приводить к образованию дефектов реконструируемого органа, низкая скорость – препятствовать пролиферации клеток, замедлять формирование ткани. Как показали многочисленные исследования [3–7], полимеры молочной кислоты различных структурных форм, а также их смеси с другими биорезор-бируемыми полимерами отвечают основным требованиям, предъявляемым к материалам медицинского назначения и являются перспективным материалом для получения полимерных матриц и тканеинженерных конструкций. Материалы из поли(L-лактида) (ПЛА) в настоящее время широко применяются в медицине [3–5]. В связи с развитием трансплантологии и тканевой инженерии резко возрос интерес к волокнам и пленкам из ПЛА, а также композиционным материалам на его основе [6, 7].

Авторами настоящей статьи были разработаны материалы на основе нано- и микроволокон из ПЛА, которые успешно использованы в качестве резорбируемых матриц для тканеинженерных препаратов [8, 9]. В экспериментах in vivo трубки на основе нановолокон из ПЛА имплантировали в брюшную часть аорты крысы. Показано, что в процессе резорбции нановолокон происходит их замещение тканями сосуда (эндотелием, соединительной тканью). В результате комплекса клеточных процессов формируется фрагмент аорты по тканевому составу близкий к нативному.

Образцы трубок на основе микро- и нановолокон, полученные методом электроформования, могут быть использованы в качестве протезов кровеносных сосудов в трансплантологии. Сосуды в процессе жизнедеятельности человека или животного испытывают высокие динамические нагрузки. В связи с этим для успешного использования трубок в сосудистой хирургии необходим определенный уровень их прочностных и деформационных характеристик. Данные свойства зависят как от надмолекулярного строения отдельных волокон, размеров кристаллитов и наличия ламелярных или фибриллярных образований, так и от макроструктуры образца – диаметра волокон, их ориентации относительно оси трубки.

Известно [10], что свойства полимеров, в частности кинетика их деструкции в активных средах под действием механических нагрузок, существенно зависят от их надмолекулярной структуры, параметров кристаллической структуры. В работах [11–13] приведены данные о кристаллической структуре ПЛА. Показано, что он хорошо кристаллизуется и имеет две кристаллические модификации – α и β. Под действием температуры и растягивающих напряжений возможны полиморфные превращения кристаллитов α-формы в β-форму. Показано, что для невытянутых волокон характерна α-структура, наличие псевдоромбической ячейки с параметрами a = 10.62, b = 6.11, c = 28.79 Å. Вытянутые при высоких температурах волокна и пленки обладают β-структурой с параметрами элементарной ячейки a = 10.31, b = 18.21 и c = 9.00 Å. Спиральные конформации l0/3 и 3/1 α- и β-цепей имеют примерно равные энергии упаковки. Однако, несмотря на сходство между α- и β-формами, переход одной структуры в другую возможен лишь при воздействии температуры и растягивающих напряжений. В работе [11] установлено, что α-структура образована кристаллитами со сложенными цепями, имеет ламелярное строение, а β-структура – фибриллярное. Важными параметрами при получении высокопрочных волокон из ПЛА методом термической вытяжки являются скорость вытяжки и температура. Так, вытяжкой при Т = 191°С были получены волокна с прочностью σ = 2.3 ГПа [14]. Между тем, связь между количеством α- или β-структуры и прочностью волокон не доказана. Рентгеновские и колориметрические измерения, проведенные на волокнах [15], продемонстрировали вклад обеих структур в прочность волокон. Было отмечено, что условия получения волокон, в частности температура вытяжки, а также их морфология определяют соотношение α- и β-структур. Увеличение числа переплетений между соседними ламелями препятствует полному превращению ламелярной структуры в фибриллярную с удлиненной элементарной ячейкой.

В работе [16] показано, что при получении микроволокон из расплава ПЛА методом электроформования важными параметрами, определяющими качество этих микроволокон, являются температура фильеры и зона формования. С помощью высокоскоростной фотосъемки выявлено, что, если температура в зоне формования микроволокна ниже температуры стеклования полимера, то разделение струи подавляется быстрым осаждением полимера в зоне формования. Указанное обстоятельство препятствует вытяжке микроструй, приводит к увеличению их диаметра и соответственно диаметра волокон. При этом не наблюдалось изменений химической структуры ПЛА. В результате высокой скорости перехода расплава в твердое состояние волокна из ПЛА имели преимущественно аморфную структуру с небольшим содержанием β-кристаллов. Установлено, что ориентация макромолекул ПЛА способствует кристаллизации полимера при температуре около 95°С, причем степень кристалличности волокон ПЛА зависит от условий их термообработки.

Результаты исследования влияния термического воздействия на формирование кристаллической структуры ПЛА приведены в работе [17]. Показано, что отжиг при 90°С в течение 2 ч приводит к росту ламелярных кристаллов, ориентированная кристаллическая структура не переходит в сферолитную.

Кинетика резорбции, как и всех процессов разрушения зависит от структуры материала [10]. Для полимеров в ориентированном состоянии, в частности волокон, элементами надмолекулярной структуры, определяющими процесс разрушения, являются кристаллиты и межкристаллитные аморфные области. Кристаллическую структуру волокон и пленок ПЛА изучали в течение ряда лет, однако исследованию структуры нано- и микроволокон, полученных из раствора методом электроформования, уделено недостаточно внимания. Отсутствуют данные о структурных особенностях трубчатых образцов, влиянии термической обработки на их структуру и свойства. В связи с этим цель настоящей работы – исследование структуры микроволокон из ПЛА, а также влияния термической обработки на прочностные и деформационные свойства трубок, полученных из микроволокон.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Трубчатые образцы получали методом электроформования из раствора в дихлорэтане, использовали ПЛА марки PURASORB PL10, производства “Corbion Purac” (Нидерланды) с молекулярной массой ~90 × 10³. Дихлорэтан имел квалификацию х.ч. и был произведен Обществом с ограниченной ответственностью “Компонент-Реактив” (Россия). Концентрация полимера в растворе составляла 16 мас. %.

Электроформование волокон проводили на лабораторной установке “Nanon-01A” (MECC  Co., Япония). Скорость подачи растворов ПЛА через электрод-фильеру с диаметром 1.2 × 10^–3 м составляла (2.8 × 10^–6)–(7.0 × 10^–4) см³/с. Волокна осаждали на вращающийся приемный электрод в виде металлического стержня c диаметром 1.0 мм. Скорость вращения стержня составляла 500–2500 об/мин, расстояние между электродами 15 см, а электрическое напряжение между ними ~25 кВ.

На рис. 1а приведена микрофотография трубки на основе микроволокон из ПЛА, внутренний диаметр которой составляет ~1.0 мм, а толщина стенок ~0.3 мм. Электронно-микроскопическое изображение при большем увеличении (рис. 1б) позволяет оценить диаметр микроволокон, который равен ~2 мкм.

Рис. 1.

Фотография трубки на основе микроволокон ПЛА (а) и микрофотография стенки трубки (б). Цветные рисунки можно посмотреть в электронной версии журнала.

После электроформования трубки подвергали термообработке в диапазоне температур 40–160°С в изотермическом режиме, время выдержки на воздухе при каждой температуре 1 ч.

Для сравнения структуры микроволокон, полученных электроформованием, со структурой материала, сформованного в условиях, близким к равновесным, были приготовлены пленки из раствора ПЛА в дихлорэтане с концентрацией полимера 16 мас. %. Раствор поливали на стеклянную подложку и сушили при комнатной температуре в течение 24 ч, пленки имели толщину около 50 мкм.

Надмолекулярную структуру микроволокон исследовали на растровом электронном микроскопе “Supra 55 VP” (“Carl Zeiss”, Германия) в режиме регистрации вторичных электронов; предварительно на поверхность образцов наносили тонкий слой платины. Кристаллическую структуру образцов трубок изучали методом рентгеновской дифракции, измерения проводили на дифрактометре “Bruker D2 PHASER” (Германия) с использованием CuK_α-излучения, фильтрованного Ni. Параметры элементарной ячейки и размеры кристаллитов рассчитывали при полнопрофильном уточнении (метод Ритвельда), с помощью программы TOPAS 5.0 (“Bruker”). Степень кристалличности определяли по отношению интегральных интенсивностей рассеяния от кристаллических областей и диффузного рассеяния.

Термические свойства образцов ПЛА исследовали методом ДСК на дифференциальном сканирующем калориметре “DSC 204 F1 Phoenix” (“Netzsch”, Германия) в инертной среде при нагревании со скоростью 10 град/мин образца ПЛА с массой 5 мг.

Деформационно-прочностные свойства материалов изучали в режиме одноосного растяжения с помощью разрывной машины “Instron 5943” (Англия). Образцы пленок и трубок растягивали до их разрушения с помощью плоских зажимов пневматического типа; скорость растяжения 10 мм/мин, длина испытываемого участка 20 мм. Механические характеристики образцов определяли усреднением данных измерений для двадцати образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПЛА относят к хорошо кристаллизующимся полимерам, о чем свидетельствуют результаты исследований его кристаллической структуры [11–13]. Это подтверждают и результаты рентгеноструктурных исследований гранул исходного ПЛА, а также пленки, сформованной из раствора при условиях кристаллизации, приближенных к равновесным, при температуре 20°С. На дифрактограммах обоих образцов, приведенных на рис. 2 (кривые 8, 9) видны рефлексы на углах 2θ = 12.1°, 14.8°, 16.7°, 18.9°, 22.4°, 27.4°, 29.1°, соответствующие отражениям от плоскостей α-формы кристаллической ячейки ПЛА [11, 17, 18].

Рис. 2.

Рентгенодифрактограммы волокон, обработанных при 40 (1), 60 (2), 80 (3), 100 (4), 120 (5), 140 (6) и 160°С (7), а также гранул ПЛА (8) и пленки, полученной из раствора (9).

На дифрактограммах микроволокон, полученных электроформованием и обработанных при низких температурах, Т = 40–60°С (рис. 2, кривые 1 и 2), видно только размытое гало, что указывает на аморфную структуру микроволокон.

Термообработка при более высоких температурах (80°С и выше) существенно меняет дифракционную картину (рис. 2, кривые 3–7). На рентгенограммах появляются узкие дифракционные максимумы разной интенсивности, которые свидетельствуют о наличии в термообработанных микроволокнах ПЛА кристаллических областей. Повышение температуры вплоть до 160°С принципиально не меняет дифракционную картину, однако можно отметить закономерное смещение пиков в большие углы, указывающие на сжатие элементарной ячейки – преимущественно в направлениях b и c. Уменьшение размеров кристаллической ячейки в процессе термообработки свидетельствует об уменьшении дефектности кристаллов ПЛА, что свою очередь должно способствовать увеличению межмолекулярного взаимодействия.

В табл. 1 приведены значения параметров элементарной ячейки, размера кристаллитов L, а также степени кристалличности исходных волокон ПЛА и волокон, обработанных при разной температуре. Для сравнения представлены аналогичные значения для пленки, полученной из раствора методом сухого формования, и исходных гранул.

Из анализа этих данных можно сделать вывод о хорошо развитой кристаллической структуре микроволокон ПЛА, подвергнутых термической обработке при температуре выше 80°С. Микроволокна состоят из ламелей, включающих кристаллы α-модификации. Ламелярная структура подтверждается исследованием поверхности микроволокон методом электронной микроскопии. На рис. 3 приведены микрофотографии с разным увеличением волокон, полученных методом электроформования и обработанных при 90°С. На поверхности волокон наблюдается значительное количество пор с размером 100–300 нм (рис. 3а), а также ламелей с размером ~20 × 200 нм (рис. 3б). Высота ламелей (около 20 нм) близка к размеру кристаллитов микроволокон, определенному по данным большеугловой рентгеновской дифракции (25–34 нм). Ламелярная структура характерна для большинства гибкоцепных полимеров в неориентированном состоянии [19, 20]. Складчатая структура макромолекул, наличие ламелей препятствуют образованию проходных цепей, соединяющих отдельные элементы структуры. Такая надмолекулярная структура не позволяет реализовать высокие прочностные и упругие свойства полимера. Отметим, что, согласно работе [14], высокая прочность достигнута на волокнах ПЛА с исключительно фибриллярной структурой.

Рис. 3.

Микрофотографии микроволокон ПЛА, полученных электроформованием и обработанных при 90°С.

Второй фактор, снижающий прочность волокон, полученных из раствора методом электроформования, – их высокая пористость. Поры образуются в процессе удаления растворителя из микроструй, при их прохождении от фильеры к приемному электроду. Отметим, что метод электроформования является по сути вариантом метода сухого формования волокон. Как известно, большинство волокон, полученных “сухим” формованием из растворов характеризуются высокой пористостью [21].

Кристаллизацию ПЛА исследовали методом ДСК. На рис. 4 приведены кривые ДСК исследуемых образцов. Видно, что в процессе нагревания трубки на основе свежесформованных микроволокон ПЛА наблюдается скачок теплоемкости при Т = 60°С (рис. 4, кривая 1), обусловленный увеличением сегментальной подвижности макромолекул при температуре стеклования полимера, что согласуется с данными работ [22, 23]. При Т = = 95°С на кривой виден экзо-максимум, который, как показал рентгеноструктурный анализ, связан с кристаллизацией ПЛА. Плавление кристаллитов происходит при Т = 179°С. Необходимо отметить, что плавление кристаллитов микроволокон происходит при более низких температурах, чем плавление кристаллитов гранул (рис. 4, кривые 1 и 2), что может быть связано с дефектностью кристаллитов микроволокон, их высокой пористостью.

Рис. 4.

Кривые ДСК для трубки на основе свежесформованных микроволокон (1), гранул ПЛА (2) и пленки, полученной из раствора (3).

Наиболее термостабильной структурой обладают исходные гранулы ПЛА (рис. 4, кривая 2), при их нагревании вплоть до температуры плавления Т = 191°С практически не наблюдается никаких эндо- и экзо-эффектов. Похожая картина характерна и для пленки, полученной из раствора (рис. 4, кривая 3), однако плавление кристаллитов в этом случае происходит при Т = 185°С, что несколько ниже, чем для гранул ПЛА. Такие различия в температурах плавления гранул и пленок, очевидно, связаны с различной дефектностью кристаллитов, а также с разной степенью кристалличности, что следует из результатов рентгеноструктурного анализа.

Как отмечалось ранее, трубки на основе нано- и микроволокон могут быть использованы в качестве матриц тканеинженерных препаратов для сосудистой трансплантологии. Такие матрицы как в сухом состоянии, так и в водных средах должны обладать комплексом механических свойств, обеспечивающим возможность хирургических манипуляций, а также стерилизации. Второй важной особенностью имплантатов сосудов является способность выдерживать значительные механические нагрузки, которые возникают при прохождении потока крови. Известно [24, 25], что сосуды человека выдерживают давление от 100 до 400 кПа и, при таком давлении не должна происходить пластическая деформация трубки, уменьшение толщины ее стенок. Истончение стенки сосуда приводит к образованию аневризмы, которая является одним из наиболее опасных и критичных дефектов кровеносного сосуда, приводящих к быстрому его разрушениию. В связи с этим в работе исследована зависимость прочностных и деформационных характеристик трубок на основе микроволокон ПЛА от температуры их термообработки. На рис. 5 представлены диаграммы нагрузка–деформация трубок, обработанных при 40–160°С.

Рис. 5.

Зависимость напряжения от деформации при растяжении трубок, обработанных при повышенных температурах (а) и фрагмент диаграммы (б). Температура обработки 40 (1), 60 (2), 70 (3), 80 (4), 90 (5), 100 (6), 120 (7), 140 (8) и 160°С (9).

На кривых 1, 3 и 4 видно, что термообработка приводит к существенному изменению характера зависимостей нагрузка–деформация. При температурах обработки выше 80°С резко уменьшается величина деформации образцов, повышается их прочность. Важно отметить, что практически на всех кривых (кривые 2, 5–9) наблюдается линейный участок, свидетельствующий о наличии упругой составляющей деформации, ее величина равна 2.5–3.0%. Это, как указывалось выше, очень важно для имплантатов сосудов. Зависимости напряжения и деформации при разрыве от температуры обработки приведены на рис. 6. Видно, что максимальную прочность (~3 МПа) имеют трубки, обработанные при 90°С. Такая прочность более чем в 10 раз превышает давление, действующее на сосуды человека при прохождении через них потока крови [26, 27]. Вместе с тем образец обладает достаточной эластичностью, позволяющей проводить хирургические манипуляции без его хрупкого разрушения. Наблюдаемые деформационно-прочностные характеристики обусловлены помимо укладки волокон надмолекулярной структурой микроволокон из ПЛА. Как показали дифракционные и ДСК-исследования, при температуре 80–100°С происходит кристаллизация ПЛА, увеличивается его степень кристалличности. Именно это и вызывает существенное повышение прочности, уменьшение пластической деформации. Дальнейшее развитие кристаллизационных процессов, протекающих при температурах выше 110°С, способствует повышению хрупкости трубчатых образцов, что делает невозможным их использование в хирургической практике.

Рис. 6.

Зависимости прочности (1) и деформации при разрыве трубок (2) от температуры обработки.

Таким образом, проведено исследование зависимости прочностных и деформационных характеристик трубчатых образцов на основе биосовместимого, биорезорбируемого поли(L-лактида) от условий термической обработки. Определен оптимальный режим, при котором формируется ламелярная структура микроволокон. Деформационные и прочностные характеристики трубок позволяют рекомендовать их для использования в качестве матриц тканеинженерных препаратов при трансплантологии кровеносных сосудов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 19-73-30003).