Высокомолекулярные соединения (серия А), 2020, T. 62, № 4, стр. 310-318

ВВЕДЕНИЕ

Макромолекулы белков в живых организмах существуют в виде трехмерных глобулярных структур. Такие структуры представляют собой плотную пространственную укладку α-спиралей, β-листов, и других элементов вторичной структуры, а также и поперечных сшивок между удаленными по цепи звеньями за счет дисульфидных S–S-мостиков. Хотя последние формально не являются элементами вторичных структур, для упрощения изложения в дальнейшем под элементами вторичных структур подразумеваются и S–S-сшивки.

В условиях хромато-масс-спектрометрического эксперимента (LC–MS), который обычно проводится в водно-органических средах при pH 2.0 и температуре 50°С, происходит денатурация белка, и его глобулярная структура разрушается. Макромолекула разворачивается, приобретая конформацию, близкую к конформации клубка, при этом аминокислотные остатки, “спрятанные” внутри глобулы, выходят наружу, и для них появляется возможность взаимодействовать с поверхностью. Тем самым, при адсорбционном взаимодействии вся последовательность цепи становится доступной для “чтения” ее текста. Такая картина подтверждается экспериментальными данными: объем удерживания V_R коррелирует со всем аминокислотным составом белка, а не только с той его частью, которая находится на поверхности глобулы. По этой причине модель хроматографического разделения BioLCCC [1], в основе которой лежит предположение о макромолекуле как о клубке, представленном цепью случайных блужданий на решетке, в целом правильно отображает наблюдаемые экспериментальные закономерности.

В состоянии клубка все звенья имеют возможность взаимодействовать с поверхностью, создавая наиболее выгодные условия для “чтения” текста последовательности методами хроматографии. Точечные мутации последовательности, такие как перестановка, замена аминокислот и их химическая модификация относительно легко “читаемы” в макромолекуле, находящейся в клубковом состоянии. Связанность аминокислотных остатков в цепь формирует специфическое сильное взаимодействие между удаленными по цепи звеньями, при котором небольшое изменение адсорбционных свойств какого-то одного звена (например, в результате его модификации) влияет на взаимодействие с поверхностью всех остальных и, следовательно, на адсорбцию всей макромолекулы и ее хроматографические свойства. Зависимость адсорбции от последовательности звеньев в клубке имеет, как правило, энтропийную природу, и связана с наличием в адсорбированной макромолекуле петель и хвостов, распространяющихся в раствор и не контактирующих с поверхностью. При очень сильном адсорбционном взаимодействии (практически не реализуемом в LC), когда макромолекула полностью “распластана” на поверхности, последовательность звеньев не играет роли.

Особенно заметно влияние последовательности вблизи адсорбционной критической точки, в которой адсорбированный клубок как раз характеризуется наличием длинных петель и хвостов. В критической точке имеет место тонкая компенсация потерь энтропии цепи вблизи поверхности, обусловленных уменьшением числа способов укладки, энергией адсорбционного взаимодействия звеньев, и макромолекула оказывается весьма восприимчива к любому нарушению этой компенсации. В силу фазового характера адсорбции макромолекул, эксперимент LC–MS, осуществляемый при изменении во времени состава водно-органического растворителя, автоматически приводит к тому, что разделение происходит вблизи критической точки адсорбции со стороны адсорбционного режима. Тем самым, разделение в градиенте должно отображать не только аминокислотный состав макромолекулы, но и характер чередования остатков в цепи, т.е. ее последовательность.

Для коротких цепей пептидов вклад петель и хвостов незначителен, и основную роль здесь играет аминокислотный состав. Для них весьма успешными являются аддитивные модели [2–5], дополненные поправками на длину цепи и влияние соседей.

Такая идеализированная картина, однако, не вполне точная. Существующие в глобулярном состоянии белка вторичные структуры могут не полностью разрушаться в эксперименте. В этом случае конформацию денатурированного белка можно представить в виде небольшого количества остатков α-спиралей и β-листов, соединенных гибкими цепями, сшитыми в некоторых местах дисульфидными S–S-мостиками. Остаточные вторичные структуры меняют адсорбционные свойства всей макромолекулы и должны учитываться моделью разделения. В настоящей работе в рамках модели BioLCCC теоретически проанализировано влияние остаточных вторичных структур на адсорбционные свойства белков и пептидов и указанное влияние сопоставлено с влиянием последовательности.

МОДЕЛЬ BioLCCC С ВТОРИЧНЫМИ СТРУКТУРАМИ

На рис. 1 показаны элементарные типы вторичных структур, которые могут существовать в частично денатурированном белке. В масштабе клубка α-спираль и β-лист можно представить жестким стержнем, а соединяющие их гибкие участки – цепью случайных блужданий.

Денатурированный белок может содержать и несколько таких структур, соединенных между собой (рис. 1, тип 5 и 6). Рассмотрим, каким образом вторичные структуры возможно интегрировать в матричную модель адсорбции макромолекулы в пространстве щелеобразной поры, лежащей в основе BioLCCC.

Напомним, что измеряемый в хроматографии объем удерживания V_R есть не что иное, как статистическая сумма макромолекулы в колонке, поэтому для понимания закономерностей разделения макромолекул необходимо найти их статистические суммы в представлении цепи блужданий со вставками в некоторых местах жестких стержней и сшивок. В дальнейшем выберем нормировку энергии таким образом, чтобы в неограниченном пространстве в отсутствии адсорбционных поверхностей статсумма макромолекулы Z была равна единице, а энергию адсорбции звеньев будем выражать в единицах kT.

Клубковая часть, как обычно, моделируется цепью, блуждающей по узлам кубической решетки, переходная матрица W(ε_i) которой имеет стандартный вид [1]:

Здесь ε_i – энергия адсорбции i-го звена в цепи (для определенности будем отсчитывать его от C-конца), зависящая от типа соответствующего аминокислотного остатка. Для топологии поры типа щели с размером D, ограниченной в одном направлении, при расчете статсуммы можно исключить интегрирование по двум пространственным координатам в плоскости, параллельной поверхности. Тогда статистическую сумму цепи, начинающуюся в слое k и заканчивающуюся в слое l, запишем в виде:

где U_{k, l}  – векторы, все компоненты которых нули, за исключением k = 1 и l = 1.

В данной модели радиус действия адсорбционных сил δ ограничен размером аминокислотного остатка a, т.е. предполагается короткодействующим. Обычно размер a, диаметр α-спирали d и размер молекул растворителя r имеют один порядок величины. Поэтому будет естественно величины, имеющие размерность длины, выразить в единицах размера аминокислотного звена a = 5 Å. Тогда размерность матрицы равна размеру поры адсорбента, представленному в единицах размера звена (например, для поры с размером 300 Å размерность матрицы D = 60).

Для спирального участка, моделируемого стержнем, шаг по решетке зависит от его длины L, которая связана с числом n входящих в него аминокислотных остатков как L = n – 1. Первый аминокислотный остаток, входящий в спираль, логично считать последним звеном клубковой части (рис. 2). При выбранной симметрии поры и уровне энергии для расчета статсуммы существенны только положения конца стержня в плоскостях, параллельных адсорбционным поверхностям.

Стержень с длиной L (обычно для белков спираль содержит не менее четырех звеньев, т.е. L > 4), начинающийся в слое k, может располагаться в слоях k ± 1, … k ± L, общее число которых 2L + 1. Поскольку расстояние между плоскостями одинаковое, то вероятность попадания конца стержня на поверхность соответствующего шарового слоя также одинаковая, т.е. вероятность попадания второго конца стержня в любой доступный слой равна 1/(2L + 1). Таким образом, переходная матрица, описывающая стержень спирали в поре, имеет вид:

Для упрощения показана матрица для L = 2, в общем случае ее структура очевидна. Энергия адсорбционного взаимодействия тогда, когда стержень целиком попадает в адсорбционный слой, есть сумма значений энергии взаимодействия всех входящих в него аминокислотных остатков, ${{E}_{\alpha }} = \sum\nolimits_2^n {{{\varepsilon }_{i}}} $. Если только конец стержня n попадает в адсорбционный слой, энергия адсорбции равна энергии адсорбции концевого аминокислотного остатка ${{\varepsilon }_{n}}$; будем считать, что все остальные звенья стержня в такой “наклонной” конфигурации с поверхностью не взаимодействуют. Длина стержня L = 1, по сути, соответствует одному шагу цепи блужданий, однако, матрица (2) в этом случае несколько отличается от переходной матрицы цепи блужданий (1). Данное отличие не существенно, и для реальных длинных стержней статсумма, рассчитанная по выражению (2), мало отличается от точной модели адсорбции стержня [6, 7].

Таким образом, статсумму цепи общей длиной N, содержащей спиральный участок между звеньями m и k, представим в виде

где U – единичный вектор. Обобщение на случай нескольких спиральных участков в цепи очевидно.

Рассмотрим другие типы вторичных структур, представленные на рис. 2. Для начала запишем очевидное тождество для цепи блужданий с длиной N, которую можно представить в качестве цепи с длиной n, пришедшую в слой k, а затем покинувшего его цепь с длиной N – n. Если просуммировать по всем слоям k = 1 … D, то в итоге должна получиться просто статсумма цепи блужданий с длиной N:

Здесь E – единичная матрица. Если в звене n имеется, например, узел разветвления (рис. 2, схема 3) и к нему подходит еще одна цепь, то вместо единичной матрицы в уравнении (4) необходимо поставить диагональную матрицу, элементы которой представляют собой статистические суммы боковой цепи с длиной N_b, начинающейся в слое k:

Таким образом, статистическую сумму цепи с узлом разветвления запишем в виде

Если к звену n примыкает складка (рис. 2, схема 2), простирающаяся до l-го звена, тогда элементы диагональной матрицы суть статсуммы стержня длиной L = [l – m]/2, один конец которого находится в слое k:

Статистическую сумму цепи со складкой можно представить как

Наконец, цепь может содержать в своей структуре цикл, статистическая сумма которого

Множитель A учитывает отличие статсуммы цикла в неограниченном пространстве от единицы. Для кубической решетки этот множитель быстро становится близким к статсумме одномерной гауссовой циклической цепи:

Для рассматриваемой одномерной модели поры можно не учитывать то, что конец цикла не попадает в исходную точку (рис. 2, схема 4), а оказывается лишь в исходном слое – по координатам, параллельным адсорбционным поверхностям, звенья цепи не имеют ограничений.

Рассмотренные выше элементарные типы вторичных структур позволяют записать статсумму и для более сложной структуры, например, изображенной на схеме 5 рис. 2:

Здесь Λ – диагональная матрица, элементы которой есть статистические суммы складки, начинающейся в слое k, с примыкающим к ней на другом конце циклом:

Для завершения модели необходимо определить значения энергии адсорбции аминокислотных остатков в спиральном состоянии. Это сложно выполнимая задача: для нее потребуются модели пептидов в заведомо спиральном состоянии. В настоящей работе для оценки влияния вторичных структур использован более простой вариант. Поскольку механизм адсорбции на обращенной фазе обусловлен в основном гидрофобным взаимодействием, в первом приближении будем считать, что энергия аминокислотных звеньев в спиральном состоянии близка к энергии адсорбции аминокислот в коротких пептидах, моделируемых жестким стержнем [7]. Если принять такое предположение, то между значениями энергии звеньев в клубке ε_c и в спирали ε_h существует зависимость, близкая к линейной. Это означает, что более гидрофобная аминокислота в клубковом состоянии будет более гидрофобной и в спиральном состоянии. Такое приближение значительно сокращает набор параметров в модели: вместо двадцати дополнительных значений энергии имеем два дополнительных коэффициента линейного преобразования.

ПРИМЕРЫ РАСЧЕТА И ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ВТОРИЧНЫХ СТРУКТУР

Рассмотрим особенности, к которым в адсорбционном поведении может приводить учет в клубках вторичных структур. На практике необходимо знать, какие аминокислотные остатки входят в клубковые участки, а какие в спиральные. В приложении к определенной макромолекуле белка, скорее всего, это можно определить экспериментально, используя различные физические методы. В общем случае произвольной последовательности, для теоретического анализа необходимо пользоваться математическим моделированием.

Существует множество алгоритмов, предсказывающих наличие вторичных структур в белках, которые дают примерно одинаковый результат. В настоящей работе была использована модель PSIPRED [8]. Для заданной последовательности цепи эта модель определяет в каком состоянии (с – клубок, h – спираль) находится тот или иной аминокислотный остаток. Например, для белка Cytochrome модель PRISPED предсказывает четыре спиральных участка, включающие звенья 3–18, 50–53, 61–69 и 88–101. Таким образом, если предположить, что в денатурированной макромолекуле Cytochrome спиральные участки сохраняются, то ее можно представить в виде четырех стержней разной длины, соединенных гибкими цепями. Важно, что алгоритмы предсказания вторичных структур неявно предполагают нормальные условия, в то время как хроматографический эксперимент осуществляется обычно в кислой среде (pH 2.0) при температуре ~50°С, значит, некоторые из спиралей могут разрушиться.

В рамках такого приближения были рассчитаны значения объема удерживания макромолекул белков как с учетом вторичных структур, так и без учета последних. В расчетах, как и ранее в работе [7], были использованы стандартные условия LC-эксперимента: растворитель вода–ацетонитрил с добавление кислоты для достижения pH 2.0, градиент от 0 до 100% ацетонитрила в течение 100 мин, колонка 250 × 4.6 мм, эффективность колонки ~4000 теоретических тарелок.

Аминокислотные остатки в спиральном состоянии могут иметь отличную от клубкового состояния энергию, и для более точного моделирования необходимо вводить дополнительную таблицу значений эффективной энергии остатков в состоянии спирали. В данной работе будем считать, что значения энергии остатков в спиральном состоянии близки к значениям эффективной энергии остатков в модели адсорбции пептидов как жестких стержней. Эти значения, а также значения энергии в состоянии клубка, приведены в работе [7].

На рис. 3 показана модельная хроматограмма белка Cytochrome, рассчитанная как в предположении о наличии в структуре клубка спиралей, так и для чисто клубкового состояния. Видно, что наличие вторичных структур в денатурированном белке оказывается весьма существенным и влечет заметное изменение объема удерживания по сравнению с представлением всей цепи в виде клубка. При этом, вопреки ожиданию, макромолекула со спиральными участками элюируется раньше, чем клубок, даже с учетом того, что значения эффективной энергии остатков в спирали больше таковых в клубке.

Чтобы выделить данный факт, был рассчитан объем удерживания макромолекулы в предположении о равенстве энергии адсорбции остатков в спиральном и клубковом состоянии. Объем удерживания такой макромолекулы еще меньше. Скорее всего, это связано с тем, что переход стержня в адсорбированное состояние, в зависимости от его длины, носит резкий и немонотонный характер [6]. Возможно, что такое поведение отражает особенности модели, в которой энергия “наклонных” состояний спиральных участков принята равной нулю.

Ранее в широком ряду белков обнаружена хорошая корреляция между экспериментальными и теоретическими величинами объемов удерживания в предположении о чисто клубковом состоянии макромолекулы. По-видимому, такая корреляция свидетельство того, что в условиях LC-эксперимента вторичные структуры разрушаются и их влияние становится незначительным. Однако, если эксперимент проводить в нормальных условиях при pH 7.0, влияние вторичных структур может оказаться существенным и определять картину хроматографического разделения.

Другой пример – белок группы инсулина Relaxin, состоящий из двух цепей А и B, соединенных тремя связями S–S (рис. 4). Скорее всего, денатурированный белок имеет клубкообразную, сшитую этими связями структуру, включающую циклы и хвосты. При исследовании белки подвергают ферментативному гидролизу, в результате чего они распадаются на фрагменты, в которых связи S–S не разрушены. Образуются как линейные пептиды, так и пептиды сложной формы – разветвленные и циклические [9].

Расчет в рамках рассматриваемой модели и условий LC-эксперимента [9] показывает удовлетворительную корреляцию между экспериментальным и теоретическим порядком выхода этих фрагментов (рис. 4, темные точки). Однако, если заменить разветвленные и циклические структуры их линейными аналогами, имеющими тот же набор аминокислот, то расчетные времена мало изменяться (светлые точки), а корреляция будет не менее хорошей. Следовательно, для коротких пептидов главную роль в разделении играет их аминокислотный состав, а топология цепи мало значима. Это не удивительно, так как короткие цепи адсорбируются практически целиком, и роль петель, энтропия которых определяет зависимость от последовательности, незначительна.

Еще один пример для рассмотрения – одноцепочечный белок IGF-I, сшитый дисульфидными мостиками (рис. 5). При его гидролизе протеазой V8, наряду с линейными, также образуются разветвленные и циклические структуры [9].

Как и в предыдущем случае, расчет в целом правильно предсказывает порядок выхода фрагментов. Если снова заменить сложные разветвленные структуры обычными линейными цепочками с тем же набором аминокислот, то результат корреляции получается не хуже.

Рассмотрим “мысленную”, но вполне реализуемую экспериментально задачу. Представим макромолекулу инсулина в денатурированном состоянии. Она имеет вид клубка из двух цепей A и B, соединенных тремя связями S–S, и состоит как из циклических участков, так и из линейных хвостов (рис. 6).

Допустим, что есть химическая реакция, расщепляющая связи S–S. В зависимости от глубины протекания этой реакции возможно образование шести различных структур, формирующихся путем разрыва одной или двух связей S–S (в пределе получаются две отдельных цепи A и B). Такие структуры имеют одинаковый набор аминокислот и отличаются своей топологией.

На рис. 6a видно, что в градиенте, некоторые из указанных структур могут разделяться, однако эффективность разделения (кроме предельного случая двух отдельных цепей) невысокая. Ситуацию можно слегка улучшить, используя изократические условия (рис. 6б), однако и в этом случае полного разделения всех шести структур вряд ли можно добиться.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Модель хроматографического разделения, основанная на представлении макромолекулы в виде цепи блужданий, допускает несложное обобщение на случай наличия в ней разных типов вторичных структур: спиральных участков, складок, S–S-сшивок. Для практического применения эту модель необходимо дополнить набором значений эффективной энергии аминокислотных остатков в спиральном или складчатом состоянии, а также S–S-сшивок. Это не простая экспериментальная задача, так как для ее реализации необходимо иметь ряд моделей пептидов в заведомо известном (например, спиральном) состоянии в условиях хроматографического эксперимента. Учет влияния вторичных структур, возможно, поможет в интерпретации данных по хроматографическому разделению денатурированных белков, не подвергнутых ферментативному гидролизу.

Что касается пептидов, обычно используемых в протеомных экспериментах для идентификации белков, то для них усложнение модели, учитывающей влияние вторичных структур, оказывается малозначимым. Для интерпретации хроматографического разделения пептидов, в дополнение к их анализу методами масс-спектрометрии, вполне достаточно модели клубка и простых аддитивных моделей [1–5].

Работа выполнена в соответствии с Государственным заданием 0082-2019-0003 (№ АААА-А20-120021090129-9).