Высокомолекулярные соединения (серия А), 2021, T. 63, № 6, стр. 359-383

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БИОПОЛИМЕРОВ НА ГРАФИТОВЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ

Е. В. Дубровин ab*, Д. В. Клинов bc

a Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова. Физический факультет
119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2, Россия

b Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства
119435 Москва, ул. Малая Пироговская, 1а, Россия

c Научно-технологический университет “Сириус”
354340 Краснодарский край, Сочи, Олимпийский пр., 1, Россия

* E-mail: dubrovin@polly.phys.msu.ru

Поступила в редакцию 15.03.2021
После доработки 27.05.2021
Принята к публикации 29.07.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Рассмотрены основные закономерности взаимодействия молекул ДНК и белков с графитом. Проанализированы результаты исследования методом атомно-силовой микроскопии адсорбции ДНК и белков на поверхности высокоориентированного пиролитическиого графита. Эти результаты сопоставлены с результатами моделирования методом молекулярной динамики и данными оптических методов исследования. Обсуждаются дегибридизация ДНК и денатурация многих белков на поверхности графита, связанные преимущественно с π–π-стэкинговым взаимодействием (для ДНК и белков), а также с ван-дер-ваальсовым и гидрофобным взаимодействием (для белков). Отмечена сильная подверженность поверхности высокоориентированного пиролитического графита случайным загрязнениям из окружающей атмосферы, которые значительно изменяют свойства поверхности и, как следствие, влияют на кинетику адсорбции молекул биополимера и их конформацию на поверхности. Большое внимание уделено анализу взаимодействия биополимеров с поверхностью высокоориентированного пиролитическиого графита, модифицированного монослоями органических молекул.

ВВЕДЕНИЕ

Использование АСМ для исследования (адсорбции) биополимеров

Вскоре после своего возникновения в 1986 г. атомно-силовая микроскопия [1] стала широко применяться для исследования биополимеров, в частности, ДНК и белков, а также различных биополимерных комплексов и структур (первые обзоры работ на эту тему появились уже через несколько лет [2, 3]). Благодаря своему высокому пространственному разрешению, достигающему на мягких биологических объектах 0.5 нм в латеральном направлении и 0.1 нм по вертикали [4], АСМ позволяет визуализировать отдельные молекулы биополимера и молекулярные комплексы, а также выявлять их конформационные особенности на наномасштабе.

Несмотря на то, что разрешение современных электронных (или гелиевых ионных) микроскопов зачастую превосходит разрешение АСМ, значительная часть результатов, получаемых с помощью АСМ, остается уникальной и дополняет данные других методов исследования [5, 6]. Это связано с возможностью АСМ работать в условиях, не применимых для электронной (или гелиевой ионной) микроскопии, и определять характеристики образца, которые не могут быть получены другими методами микроскопии высокого разрешения. Так, АСМ позволяет работать в воздушных и водных средах (как правило, являющихся более естественными для биологических молекул, чем вакуум), использовать непрозрачные для электронов подложки (например, высокоориентированный пиролитический графит – ВОПГ), не требует металлизации или приготовления микросрезов образца, наконец, дает возможность исследовать динамические процессы в режиме реального времени. Несмотря на активное развитие низковакуумной просвечивающей электронной микроскопии, позволяющей работать в парах воды или в водных растворах, она не может заменить АСМ. Исследования таким методом требуют сложной подготовки пробы и подбора параметров работы, а разрешение данного метода применительно к биологическим объектам значительно уступает таковому у высоковакуумной микроскопии [7, 8]. Кроме того, современные атомно-силовые микроскопы предоставляют широкие возможности для картирования механических, оптических, электрических и химических свойств исследуемого образца на наномасштабе.

Адсорбция биополимера на твердой поверхности является необходимым условием его исследования с помощью АСМ. Кроме того, адсорбция биополимеров сама по себе имеет большое фундаментальное и прикладное значение. Например, адсорбция белков плазмы крови на поверхность антигена происходит уже с первых секунд после его попадания в организм, а биосовместимость материала во многом определяется особенностями адсорбции на нем белков контактирующей биологической жидкости [911]. Также адсорбция биополимеров на поверхности применяется при разработке различных биотехнологических устройств, например биосенсоров и адсорбционных хроматографов [12]. Наконец, помимо АСМ существуют и другие методы исследования поверхности, которые подразумевают адсорбцию изучаемого объекта на поверхности (например, кварцевые микровесы, эллипсометрия, поверхностный плазмонный резонанс), но не обладают (суб)нанометровым пространственным разрешением. В связи с этим АСМ, способная выявлять конформационные, морфологические, кинетические, механические и другие особенности адсорбированных молекул, является важным инструментом изучения адсорбции биополимеров, востребованным как в фундаментальных, так и прикладных исследованиях.

Анализ биополимеров с помощью АСМ применяется для решения задач в различных областях исследования, включая биофизику, физику полимеров, молекулярную биологию, биотехнологию и медицину. В частности, АСМ внесла большой вклад в изучение конформации ДНК и белков, структуры белок-белковых и нуклеиново-белковых комплексов [1316], ряда молекулярно-биологических процессов (трансляции [17], транскрипции [18], репликации [19] и т.д.), амилоидной агрегации белка [20], а также поверхностной диффузии биополимеров [21]. Соответственно на основе теоретических представлений о структуре и свойствах полимеров была развита специальная методология для анализа конформации биополимеров по данным АСМ.

Наиболее распространенным режимом работы АСМ, применяемым для исследования биополимеров, является режим прерывистого контакта [22]. В данном режиме кантилевер осуществляет вынужденные колебания с частотой, близкой к резонансной, а взаимодействие с поверхностью приводит к уменьшению амплитуды его колебания, значение которой и служит обратной связью для получения изображения. В режиме прерывистого контакта кантилевер воздействует на образец силами порядка 10 нН, а также позволяет минимизировать влияние капиллярных сил, ухудшающих разрешение микроскопа [23]. В последнее десятилетие режим прерывистого контакта постепенно вытесняется режимом пиковой силы (в англоязычной литературе PeakForce Tapping) или похожими режимами, называемыми гибридной модой (hybrid mode), прыгающим (jumping mode) или пульсирующим силовым режимом, которые основаны на получении силовой кривой (зависимости силы взаимодействия кантилевера с поверхностью от вертикального перемещения между образцом и кантилевером) в каждой точке растра изображения. Режим пиковой силы способен минимизировать силу взаимодействия кантилевера с образцом до значений порядка нескольких десятков пиконьютонов [23].

Методология анализа конформации полимеров по АСМ-изображениям

Если разрешение АСМ-изображения позволяет проследить контур адсорбированных полимерных молекул (что часто реализуется для молекул ДНК), становится возможным проведение анализа конформации полимера на основе статистического анализа контуров полимерных молекул. Для этого часто рассчитывают так называемый скейлинговый показатель степени ν, определяемый из соотношения

(1)
$\langle {{R}^{2}}\rangle = {\text{const}} \times {{L}^{{2\nu }}},$
где $\langle {{R}^{2}}\rangle $ – среднеквадратичное расстояние между концами полимерной молекулы, L – ее контурная длина; значения R и L измеряются непосредственно из АСМ-изображений молекул полимеров [24]. Значение ν наряду с анализом наличия самопересечений контура полимера позволяет приписать ему определенную конформацию. Например, ν = 1 соответствует конформации жестких стержней (молекула линейно вытянута, самопересечения исключены), ν = 0.75 при отсутствии самопересечений отвечает конформации самоизбегающих случайных блужданий, ν ≈ 0.59 при наличии самопересечений – двухмерной проекции трехмерного клубка (кинетическому захвату поверхностью), ν = 0.5 при отсутствии самопересечений – конформации компактной глобулы [6, 25, 26].

В том случае, когда молекулу полимера можно рассматривать как однородный упругий цилиндр (этот случай обычно реализуется для ДНК [27]), для описания конформации используется червеобразная (или персистентная) модель.

В рамках этой модели распределение угла θ между касательными, проведенными в двух точках контура полимера, разделенных контурной длиной l, является гауссовым [28]:

(2)
$N{{(\theta (l))}_{{2D}}} = \sqrt {\frac{P}{{2\pi l}}} {{e}^{{ - \frac{{P{{\theta }^{2}}}}{{2l}}}}}$

Здесь P – персистентная длина, являющаяся мерой гибкости молекулы полимера, а индекс 2D означает, что формула описывает двухмерный случай персистентной модели.

На практике персистентную длину определяют из одного из трех соотношений, являющихся следствием формулы (2):

(3)
$\langle {{\theta }^{2}}\rangle = l{\text{/}}P;$
(4)
$\left\langle {\cos \left( \theta \right)} \right\rangle = {{e}^{{ - \frac{l}{{2P}}}}}$
(5)
${{\langle {{R}^{2}}\rangle }_{{2D}}} = 4Pl\left( {1 - \frac{{2P\left( {1 - {{e}^{{ - \frac{l}{{2P}}}}}} \right)}}{l}} \right)$

Стоит отметить, что соотношения (3)–(5) не учитывают отталкивание различных звеньев полимера между собой (эффект исключенного объема). Такое приближение справедливо, когда контурная длина полимера не превышает 20Р [27].

Для обоснованного применения параметра персистентной длины необходимо соответствие исследуемой системы червеобразной модели [28]. Зачастую оценку P по одной из формул (3)–(5) проводят без анализа применимости червеобразной модели к системе. В этом случае имеет смысл говорить об “эффективной” или “измеренной” персистентной длине.

В случае адсорбции полимера по сценарию кинетического захвата поверхностью для нахождения P может использоваться следующее соотношение между среднеквадратичным расстоянием $\langle {{R}^{2}}\rangle $ и контурной длиной полимера l [27]:

(6)
${{\left\langle {{{R}^{2}}} \right\rangle }_{{{\text{проекц}}}}} = \frac{4}{3}Pl\left( {1 - \frac{{P\left( {1 - {{e}^{{ - \frac{l}{P}}}}} \right)}}{l}} \right)$

Подложки для АСМ-исследования биополимеров

Высокая степень гладкости поверхности подложки является важным фактором при АСМ-исследовании биополимеров из-за их размеров, как минимум один из которых обычно лежит в нанометровом диапазоне (например, диаметр B-формы ДНК составляет 2 нм, диаметр молекулы крупного глобулярного белка ферритина – 12 нм). Благодаря наличию протяженных (сотни квадратных микрон) участков поверхности с атомарной гладкостью и относительно низкой цене слюда является самой популярной подложкой для АСМ-исследования биополимеров.

Слюда представляет собой класс слоистых алюмосиликатных кристаллов, характеризующихся отрицательным зарядом алюмосиликатных слоев, скомпенсированных одновалентными катионами (например, К+ в мусковитной слюде), расположенными между слоями [29]. При погружении поверхности слюды в воду происходит диссоциация катионов, приводящая к возникновению отрицательного поверхностного заряда (–0.0025 Кл/м2 при нейтральном рН [30]), что в свою очередь препятствует адсорбции одноименно заряженных биополимеров (например, ДНК). В связи с этим для адсорбции таких молекул поверхность слюды модифицируют, например, двухвалентными катионами [31] или аминосиланами [13].

При скалывании слюды на воздухе в результате реакции между атмосферным СО2, водой и слюдой на ее поверхности образуется карбонат калия (K2CO3) с поверхностной концентрацией ≈1 молекула/нм2, который кристаллизуется при низкой влажности [32]. Образование соли на поверхности слюды может приводить к нежелательным для АСМ биополимеров эффектам, таким как высокая и неконтролируемая ионная сила в водном растворе вблизи поверхности подложки [33, 34], а также занижение измеряемой высоты адсорбированной молекулы, погруженной в солевую пленку.

Альтернативой слюде как подложке для АСМ является ВОПГ. Поверхность ВОПГ представляет собой гексагонально упакованную решетку из углеродных атомов в sp2-гибридизации и тоже содержит протяженные участки атомарно гладкой поверхности. Однако в отличие от поверхности слюды поверхность ВОПГ электрически нейтральна, химически инертна (за исключением границ ступеней) и имеет высокую электрическую проводимость. Особые свойства ВОПГ, а также его производных, таких как фуллеренов, углеродных нанотрубок (УНТ) и графена, делают их привлекательными для применения в качестве материала при разработке биосенсоров, катализаторов, устройств молекулярной электроники [3539]. Кроме того, пиролитический графит используется в качестве материала для имплантов [9, 40, 41], а модифицированные биомолекулами графитовые структуры имеют большую перспективу как биосовместимые и водорастворимые материалы для биомедицинских применений, включая доставку лекарств [42, 43]. Таким образом, понимание особенностей взаимодействия молекул биополимера с графитовыми поверхностями, с одной стороны, представляет большую методическую ценность для развития АСМ биополимеров на графите, а с другой стороны – самостоятельный научный и прикладной интерес.

Круг анализируемых результатов

Несмотря на большое число работ по АСМ-исследованию биополимеров на поверхности графита, можно отметить некоторую противоречивость результатов, касающихся конформации ДНК и белков на графитовых поверхностях. Аналитические литературные обзоры по этой теме отсутствуют. Цель настоящей работы – анализ, систематизация и обобщение научных достижений, напрямую связанных с АСМ-исследованиями биополимеров (прежде всего ДНК и белков) на графитовых поверхностях.

Среди них стоит отметить обнаружение и визуализацию денатурирующего действия поверхности ВОПГ по отношению ко многим белкам, а также сильную подверженность поверхности ВОПГ случайным загрязнениям из окружающей атмосферы, которые значительно изменяют поверхностные свойства ВОПГ и, как следствие, влияют на кинетику адсорбции молекул биополимера и их конформацию на поверхности. Особое внимание будет уделено использованию поверхностей ВОПГ, модифицированных различными органическими соединениями, которые позволяют изменять свойства поверхности графита, придавая ей определенный заряд, степень гидрофильности/гидрофобности и создавая определенный нанорельеф поверхности.

Модифицированные поверхности ВОПГ представляют большой интерес как подложки при АСМ-исследовании биополимеров, поскольку в ряде случаев значительно повышают информативность структурного анализа отдельных молекул биополимера по сравнению с другими поверхностями. Кроме того, модифицированный ВОПГ важен для развития биосовместимых материалов. На основе проведенного анализа литературных данных сформулированы перспективы применения ВОПГ как подложки для проведения фундаментальных АСМ-исследований, а также для биомедицинских и биотехнологических приложений.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БИОПОЛИМЕРОВ СО СВЕЖЕСКОЛОТОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ ВОПГ

ДНК

ДНК представляет собой длинную цепочку чередующихся нуклеотидов (аденин, цитозин, гуанин, тимин), расположенных на каркасе из дезо-ксирибозы и соединенных фосфодиэфирными связями. Молекулы одноцепочечной ДНК хорошо адсорбируются на поверхности графитовых материалов, таких как УНТ [44], графен [38, 45], ВОПГ [46, 47]. Модельные эксперименты, теоретические расчеты и молекулярное моделирование показали, что основным механизмом нековалентной иммобилизации ДНК на графитовые поверхности является π–π-стэкинг между отдельными основаниями ДНК и ароматическими структурами поверхности графита, которые хорошо соответствуют друг другу (рис. 1а) [4850]. Сила взаимодействия оснований с поверхностью графита изменяется в следующем порядке: гуанин > аденин > тимин > цитозин [46, 51, 52]. Было установлено, что энергия стэкингового взаимодействия нуклеотидных оснований с поверхностью графита (–20…–25 ккал/моль) сравнима с энергией водородных связей, формируемых уотсон-криковской парой нуклеотидных оснований [50].

Рис. 1.

а: Оптимизированные с помощью теории функционала плотности с учетом дисперсионной поправки структуры оснований ДНК (аденин, тимин, цитозин, гуанин и урацил) на C96H24. Перепечатано с разрешения Королевского Химического Общеcтва из [50]; разрешение получено через Центр по проверке авторских прав. б: АСМ-изображение (2 × 2 мкм2) молекул линеаризованной плазмидной ДНК (2000 пар оснований), адсорбированных на свежесколотой поверхности ВОПГ. Перепечатано с разрешения из [126]. Копирайт (2014) Американское Химическое Общество. в: АСМ-изображения (3 × 3 мкм2) треугольных наноструктур ДНК-оригами на поверхности ВОПГ (слева) и SiO2 (справа) (изображения получены в режиме прерывистого контакта на воздухе). Перепечатано с разрешения из [54]. Копирайт (2017) Американское Химическое Общество. г: Слева полноатомная молекулярная модель фрагмента молекулы ДНК ((ГЦ)25), адсорбированного на поверхности графена; справа относящаяся к данной модели диаграмма корреляции между средним количеством пар оснований, внутренних π–π-связей, внутренних водородных связей, водородных связей ДНК-стеариламин (для сравнения с системой, представленной на рис. 4ж) и межфазовой энергией ДНК-поверхность. Перепечатано с разрешения из [57]. Копирайт (2020) Американское Химическое Общество. Цветные рисунки можно посмотреть в электронной версии.

Адсорбция на графитовые поверхности у двухцепочечной ДНК, как правило, слабее, чем у одноцепочечной [5356]. Молекулы двухцепочечной ДНК адсорбируются на поверхность свежесколотого ВОПГ в виде разветвленных и переплетенных структур, не позволяющих различить отдельные молекулы биополимера (рис. 1б). Адсорбция на поверхности ВОПГ треугольных наноструктур ДНК-оригами сопровождается значительным увеличением их толщины по сравнению с толщиной структур, адсорбированных на поверхность SiO2 (рис. 1в) [54].

Специфику адсорбции двухцепочечной ДНК на графитовые поверхности можно объяснить особенностями взаимодействия нуклеотидных оснований с графитом. При адсорбции двухцепочечной ДНК на поверхность графита может происходить деформация или частичная дегибридизация (расхождение двойной спирали) ДНК, приводящая к выходу нуклеотидных оснований к поверхности графита и образованию π–π-стэкинга [54, 55]. Это приводит к нарушению целостности и потере жесткости двойной спирали ДНК, адсорбированной на графит, и увеличению толщины наноструктур ДНК-оригами. Потеря стабильности двухцепочечной ДНК, адсорбированной на поверхности графита, убедительно продемонстрирована результатами полноатомного молекулярного моделирования, выявившего расхождение двойной спирали ДНК и уменьшение количества как водородных связей, так и π–π-связей внутри молекулы ДНК (рис. 1г) [57]. Таким образом, чистая поверхность ВОПГ непригодна для использования в АСМ-исследованиях ДНК и комплексов ДНК–белок. Для этих целей поверхность ВОПГ модифицируют органическими молекулами (см. раздел “Адсорбция биополимеров на модифицированной поверхности ВОПГ”).

Белки

Белки характеризуются иерархической структурой, включающей в себя первичную (последовательность аминокислотных остатков), вторичную (α-спирали и β-структуры), третичную и четвертичную структуры. При адсорбции белка на подложке меняется окружение молекулы белка со стороны ее контакта с поверхностью: молекулы воды “вытесняются” поверхностью. Это может приводить к изменению баланса сил (ван-дер-ваальсовых, гидрофобных, электростатических, водородных связей) между частями белковой молекулы и конформационным перестройкам, например к частичной или полной денатурации молекулы белка [5860]. В связи с этим конформация адсорбированных белков, вообще говоря, отличается от нативной конформации белка в растворе. Конформационные изменения белка при адсорбции имеют важное значение в биомедицине и биотехнологии, в частности, они могут активировать определенные биологические процессы (например, запускать систему комплемента [61]), уменьшать каталитическую активность адсорбированных на твердой поверхности ферментов [62], увеличивать токсичность модифицированных белками наночастиц [63].

Было предложено условное разделение белков на “мягкие” и “твердые” в зависимости от их подверженности конформационным изменениям [60, 64]. Примерами “мягких” белков являются миоглобин, фибриноген, казеин, иммуноглобулины; они характеризуются менее стабильной третичной структурой, более сильной деформацией и разворачиванием на поверхности. Примеры “твердых” белков – лизоцим, цитохром С, супероксиддисмутаза; такие белки, как правило, не испытывают значительных конформационных изменений при адсорбции на поверхности.

Свойства поверхности во многом определяют степень и характер конформационных изменений адсорбирующегося на ней белка. Для регистрации изменений вторичной структуры белка традиционно применяют такие методы как круговой дихроизм [65, 66], спектроскопия нарушенного полного внутреннего отражения [67, 68] и нейтронная рефлектометрия [69]. Данные методы основаны на анализе участка поверхности, содержащего ансамбли большого числа молекул. Таким образом было, например, показано, что гидрофобные поверхности, как правило, способствуют более сильному разворачиванию глобулярных белков, чем гидрофильные поверхности [70]. Традиционные методы не дают информацию о конформационных изменениях отдельных белковых молекул. Данные АСМ дополняют результаты оптических методов, предоставляя информацию о конформационных, кинетических и механических свойствах адсорбированных белков на уровне отдельных молекул с (суб)нанометровым пространственным разрешением.

При исследовании адсорбции белков на графитовые поверхности наибольшее внимание уделено белкам плазмы крови, таким как фибриноген, антитела класса IgG и сывороточные альбумины. Понимание их взаимодействия с графитом особенно важно в биомедицине и биотехнологии, поэтому рассмотрим их более подробно.

Фибриноген представляет собой гликопротеин c М = 34 × 104, состоящий из трех пар полипептидных цепей (Aα, Bβ и γ)2, организованных в трехузловую структуру с одной центральной и двумя внешними глобулярными областями, соединенными спиральными участками. Молекула фибриногена также имеет неструктурированную концевую С часть Aα-цепей с длиной 390 аминокислотных остатков, называемую αС-областью. Все 6 цепей скреплены вместе 29 дисульфидными связями [71].

АСМ-исследования фибриногена на поверхности ВОПГ, проведенные в фосфатно-солевом буфере, привели к противоречивым результам, касающимся конформации и динамики адсорбции молекул белка. В работе [72] сразу после нанесения фибриногена (концентрация 50 мкг/мл) наблюдалось формирование сетевидного монослоя высотой 3–4 нм, который нарастал по площади до сплошного монослоя за ~225 с. Через 30 мин после нанесения раствора фибриногена на поверхности ВОПГ появлялись глобулярные агрегаты высотой 8–60 нм, которые, вероятно, образовывались на сформировавшемся слое фибриногена [72, 73]. В работе [74] на поверхности ВОПГ возникал сетчатый адсорбат высотой около 1 нм уже через 1 мин после нанесения фибриногена (7 мкг/мл). В перечисленных работах адсорбция отдельных молекул на поверхности графита не наблюдалась, что авторы связывали с более сильным латеральным взаимодействием молекул белка друг с другом, чем с поверхностью ВОПГ [72] или с денатурацией белка при адсорбции [74]. В то же время в работе [75] происходила адсорбция на поверхности ВОПГ отдельных молекул фибриногена (0.5–1 мкг/мл), что подтверждалось типичной трехузловой структурой молекул, причем высота их глобулярных частей уменьшалась от ~2 до ~1 нм в течение 130 мин.

В ряде работ АСМ-исследование адсорбции фибриногена на поверхности ВОПГ или графена проводили на воздухе после высушивания образца. K.L. Marchin и C.L. Berrie отметили тенденцию фибриногена к формированию кластеров (агрегатов) высотой ~1 нм на поверхности ВОПГ, хотя фибриноген адсорбировался на поверхность и в виде отдельных вытянутых молекул высотой ~1 нм и длиной ~63 нм (0.05–10 мкг/мл; время адсорбции 10 мин) [76]. Такие размеры авторы связали с расплыванием молекулы фибриногена на поверхности ВОПГ, вызванным расправленной конфигурацией ее αС-областей. Образование похожих кластеров фибриногена на поверхности ВОПГ наблюдали R.T.T. Gettens с соавторами [77] при низкой концентрации фибриногена (0.01–1 мкг/мл) и/или небольшом времени после нанесения образца (5–15 мин). При этом при увеличении концентрации или времени адсорбции формировались сетчатые слои белка (рис. 2а). В обеих работах отмечалось преимущественная адсорбция фибриногена вдоль границ ступеней. Вытянутые молекулы, а также кластеры фибриногена наблюдали также R. Ohta с соавторами, которые интерпретировали заниженную высоту (~1.5 нм) и завышенные латеральные размеры (по сравнению с известными кристаллографическими данными) денатурацией фибриногена при адсорбции на поверхности ВОПГ [78]. N.A. Barinov с соавторами показали, что при нанесении фибриногена (10–50 мкг/мл) на свежесколотую поверхность ВОПГ в течение 10 с присутствуют отдельные частично денатурированные молекулы фибриногена, которые содержат внешние глобулы высотой 2.5 ± 0.3 нм, погруженные в слой адсорбата высотой 0.5–1.0 нм (рис. 2б) [79].

Рис. 2.

а: Структуры, образующиеся через 60 мин после нанесения фибриногена (концентрация 2.5 мкг/мл) на поверхность ВОПГ (перепад высоты 10 нм). Перепечатано с разрешения из [77] Копирайт (2005) Уайли Периодикалс. б–г: Молекулы фибриногена (б), IgG (в), сывороточного альбумина человека (10–50 мкг/мл), адсорбированные на поверхности ВОПГ в течение 10 с (г). Перепечатано из [79], Копирайт (2016), с разрешения Эльзевир. д: Структуры, образующиеся через 1 мин после нанесения сывороточного альбумина человека (концентрация 10 мкг/мл) на поверхность ВОПГ. Перепечатано с разрешения из [86] Копирайт (2015) Уайли Периодикалс. е: АСМ-изображение поверхности ВОПГ, инкубированной в растворе додекамерного пептида GAMHLPWHMGTL. Перепечатано с разрешения из [91]. Копирайт (2012) Американское Химическое Общество. Представленные изображения получены на воздухе.

Таким образом, в большинстве работ по АСМ-исследованию адсорбции фибриногена на поверхности ВОПГ наблюдается образование кластеров и/или сетчатых слоев белка, а также преимущественная адсорбция отдельных молекул и кластеров вдоль границ ступеней графита. Разными авторами отмечена разная высота сформированных структур (1–4 нм). Также есть некоторое противоречие в оценке обратимости адсорбции фибриногена на поверхности ВОПГ: в работе [77] отмечается обратимость адсорбции фибриногена на поверхности ВОПГ, тогда как в работе [72] – сильная адгезия фибриногена на поверхности ВОПГ и даже стойкость сетчатых структур фибриногена к промыванию детергентом (3%-ным додецилсульфатом натрия).

Антитела IgG представляют собой класс высококонсервативных гликопротеинов, состоящих из двух идентичных пар полипептидных цепей: легких (М = 25 × 103) и тяжелых (М = 50 × 103), связанных дисульфидными связями. Полипептидные цепи образуют молекулу Y-образной формы с двумя Fab-фрагментами (содержащими антиген-связывающий участок) и одним Fc-фрагментом на концах [80].

D. Cullen и C. Lowe в своем АСМ-исследовании, проведенном в фосфатном буфере, сообщили о том, что молекулы IgG (50 мкг/мл) адсорбируются на поверхности ВОПГ лоскутами, содержащими 300–500 молекул, которые со временем увеличивались по площади, превращаясь в монослой с углублениями 2–3 нм, что позволило сделать предположение о нативной структуре адсорбированного белка [81]. J.G. Vilhena с соавторами тоже не выявили признаков денатурации адсорбированных на поверхности графена молекул IgG. Тем не менее, они обнаружили адсорбцию отдельных молекул IgG на поверхности графена и выявили несколько отличающихся по высоте и морфологии ориентаций адсорбированных молекул IgG, включая плоскую и три вида вертикальной ориентации. При этом значительная часть ориентаций характеризовалась обращенными в сторону от поверхности Fab-фрагментами, что должно означать сохранение биофункциональности адсорбированного белка [82]. Однако недавно проведенное АСМ-исследование на воздухе показало, что в течение 10 с после нанесения молекулы IgG расплываются на свежесколотой поверхности ВОПГ с уменьшением высоты до 1.1 ± 0.3 нм, что свидетельствует о сильной денатурации адсорбированных антител (рис. 2в) [79].

Сывороточный альбумин – основной белок плазмы крови млекопитающих, имеющий молекулярную массу 67 × 103. Он состоит из одной полипептидной цепи, скрепленной 17 дисульфидными связями. Сывороточные альбумины разных млекопитающих высоко гомологичны по структуре и состоят в основном из α-спиралей, уложенных в три похожих между собой домена, формирующих сердцевидную структуру молекулы [83].

В АСМ-исследовании адсорбции бычьего сывороточного альбумина на поверхности ВОПГ в фосфатно-солевом буфере через 30 мин после нанесения белка наблюдалось образование на базальной плоскости графита глобулярных агрегатов высотой 6–13 нм (при концентрации белка 50 мкг/мл) либо сегрегированных доменов высотой 1.7 ± 0.3 нм (при концентрации белка 10 мкг/мл) [73]. Такая маленькая высота доменов указывает на денатурацию бычьего сывороточного альбумина на поверхности ВОПГ. Сильная денатурация отдельных молекул сывороточного альбумина человека наблюдалась уже через несколько секунд после нанесения белка (10 мкг/мл) на свежесколотую поверхность ВОПГ в работе [79] (рис. 2г). Отдельные молекулы бычьего сывороточного альбумина, нанесенные на поверхность ВОПГ с помощью электроспрея, адсорбировались как на базальную поверхность ВОПГ, так и на границы ступеней, причем на границах ступеней адсорбция обычно происходила сильнее, что, вероятно, связано с наличием заряда на них [84]. Характер адсорбции и размеры молекулы позволили сделать предположение о денатурации белка, однако она могла произойти при нанесении.

В другом АСМ-исследовании сывороточный альбумин человека адсорбировался на поверхности ВОПГ из раствора низкой концентрации (1 мкг/мл) в виде отдельных нативноподобных молекул (т.е. молекул, имеющих форму, близкую к форме нативных молекул) высотой ~3 нм, тогда как при нанесении из раствора с более высокой концентрацией (100 мкг/мл) образовывал сетчатую структуру [85]. В работе [86] авторы также отмечают наличие нативноподобных молекул сывороточного альбумина человека высотой 1.91 ± ± 0.22 нм на графите при адсорбции из раствора низкой концентрации (1 мкг/мл; время инкубации 72 мин) и образование сетчатых пленок высотой 2.2 ± 0.3 нм при увеличении концентрации белка до 10 мкг/мл (рис. 2д).

АСМ-исследования адсорбции на поверхности ВОПГ глюкооксидазы [81], цитохрома С [87], фибронектина [85] и лакказы [88] выявили образование этими белками сетчатых пленок высотой от 0.5 до 3 нм, что свидетельствует о более сильном взаимодействии молекул белка между собой, чем с поверхностью графита. Молекулы рецептора мембраны тромбоцитов aIIbb3, мембранного арабиногалактана (AGP), а также октапептида NAP [89] адсорбировались на поверхности ВОПГ в виде глобул или их агрегатов и сетчатые структуры не образовывали.

Таким образом, характер адсорбции белков на поверхности графита сильно зависит от природы белка, его исходной концентрации и времени адсорбции. Адсорбция отдельных молекул обычно наблюдается при относительно небольших значениях концентраций и времени инкубации. При увеличении указанных параметров молекулы агрегируют на поверхности друг с другом, образуя конгломераты, разветвленные сети и слои. При этом во многих случаях наблюдается разворачивание белков на поверхности графита.

Для изучения конформационных и функциональных изменений белков, адсорбированных на графитовых поверхностях, в ряде работ использовали дополнительные методы. Так, с помощью кругового дихроизма было показано, что при адсорбции на поверхности УНТ фибриногена, гамма-глобулина и бычьего сывороточного альбумина значительно уменьшается доля α-спиралей и увеличивается доля β-структур, причем у фибриногена и гамма-глобулина эти изменения необратимые, а у бычьего сывороточного альбумина – частично обратимые [90]. Методом ИК-спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения обнаружен голубой сдвиг амидных областей адсорбированного на поверхности ВОПГ 12-звенного графен-связывающего пептида, что интерпретировано как нарушение α-спиральной структуры пептида за счет взаимодействия с поверхностью [91]. Адсорбированный на поверхности ВОПГ или графена пептид морфологически представляет собой сетчатый слой высотой около 1 нм (рис. 2е). С помощью кварцевых микровесов показана потеря аффинности адсорбированного на поверхности графена конковалина А к полисахаридам клеточной стенки B. subtilis, что может объясняться денатурацией белка, вызванной взаимодействием с поверхностью [92]. Однако при биоконъюгации конковалина А к поверхности графена способность связывать полисахариды сохраняется. Напротив, была отмечена потеря специфичности IgG при биоконъюгации на поверхности графена [93].

В некоторых работах были изучены вопросы сохранения функциональности белков после их адсорбции на графитовых поверхностях. Так, молекулы лакказы сохраняют свою каталитическую активность после адсорбции на поверхности ВОПГ. При ковалентной пришивке к поверхности графена молекул пероксидазы хрена (состоящих в основном из α-спиралей) и глюкооксидазы (состоящих из смеси α-спиралей и β-листов) повышается ферментативная активность у глюкозоксидазы и уменьшается у пероксидазы хрена, что демонстрирует возможную роль β-листов к стабилизации структуры адсорбированного на графитовых поверхностях белков [94].

В работе [95] с помощью спектроскопии генерации суммарной частоты и молекулярной динамики показано, что замена (мутация) двух ароматических аминокислотных остатков аланином уменьшает взаимодействие молекул пептида с поверхностью графена и приводит к изменению плоскостной ориентации адсорбированного пептида на вертикальную. Полученные результаты позволили сделать предположение, что взаимодействие пептидов с графеном зависит от конкуренции между планарными, т.е. содержащими ароматические боковые группы, и гидрофильными (например, лизином) остатками пептида.

Молекулярная динамика дает возможность более детально прояснить характер взаимодействия белков с графитовыми поверхностями. Отмечается большая роль π–π-стэкинга во взаимодействии ароматических групп аминокислотных остатков тирозина, триптофана и фенилаланина, а также гетероцикла гистидина с графитовыми поверхностями [42, 90, 95, 96]. Это связано с хорошим структурным соответствием циклических групп и гексагональной структуры графита. Многие УНТ- и графен-связывающие пептиды, полученные с помощью фагового дисплея, оказались богатыми ароматическими и гетероциклическими аминокислотными остатками, например, В1–В4, Р1, GrBPS [97]. Помимо π–π-стэкинга другие виды взаимодействия, такие как гидрофобное, ван-дер-ваальсово и электростатическое (для заряженных участков поверхности, например, ступеней ВОПГ), могут играть важную роль во взаимодействии белков с графитовыми поверхностями [9496].

В многочисленных работах по молекулярному моделированию адсорбции белков и пептидов на графитовых поверхностях сообщается о том, что адсорбция сопровождается изменениями вторичной структуры молекул, в частности частичной или полной денатурацией ряда глобулярных белков (или их доменов), включая фибриноген [98], сывороточный альбумин человека [99101] и другие (рис. 3) [96, 102104]. Это вызвано переориентацией отдельных доменов вследствие гидрофобного, вандерваальсового и π–π-стэкингового взаимодействия с поверхностью графита. Сравнение разных с точки зрения размера, топологии и стабильности белков продемонстрировало, что богатые β-листами белки остаются более стабильными после адсорбции на графит, чем α-спиральные белки [96].

Рис. 3.

Результаты молекулярного моделирования адсорбции стрептавидина на поверхности графита: а – первоначальные ориентации молекулы белка; б – конформация молекулы стрептавидина через 40 нс для каждой первоначальной ориентации. Перепечатано с разрешения из [102]. Копирайт (2016) Американское Химическое Общество.

ВЛИЯНИЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ПОВЕРХНОСТЬ ВОПГ

Несколько лет назад было обнаружено, что графитовые поверхности в лабораторных условиях склонны к случайному, неконтролируемому загрязнению углеводородными примесями из атмосферы [105]. Для поверхности ВОПГ загрязнение приводит к увеличению угла смачивания водой с 64.4° ± 2.9° для свежесколотой (~10 c) поверхности до ~90° для поверхности, находящейся на воздухе в течение ~10 мин [106, 107]. Таким образом, широко распространенное восприятие ВОПГ и графена как гидрофобных материалов не совсем верно, а их чистые поверхности являются слабо гидрофильными. Адсорбированные атмосферные примеси обычно образуют пленки на поверхности графита [105], которые зачастую самоорганизуются в периодические ламелярные структуры с периодом ламелей 4–5 нм [108]. Кроме того, была продемонстрирована контаминация поверхности графита примесями, выделяемыми стандартной пластиковой пипеткой, при нанесении воды на поверхность свежесколотого ВОПГ [109]. В этом случае также образовывались периодические ламеллярные структуры с периодом ~5 нм.

Высокая подверженность графитовых поверхностей загрязнению при контакте с воздухом или жидкостью может быть причиной противоречивых наблюдений, касающихся конформации и особенностей адсорбции белков на графите. Действительно, в большинстве таких АСМ-исследований отсутствует ключевая информация о времени нахождения графитовых поверхностей на воздухе после скалывания/очистки перед нанесением образца и нет учета возможной контаминации графита из воздуха или водного раствора. Адсорбцию биополимера на контаминированную углеводородными примесями графитовую поверхность можно рассматривать как адсорбцию на модифицированную поверхность графита. Например, молекулярное моделирование выявило уменьшение силы адсорбции инсулина на контаминированную этаном поверхность графита и отсутствие денатурации белка на такой поверхности в отличие от чистого графита [103]. В связи с этим актуален пересмотр интерпретации части результатов АСМ-исследования биополимеров, адсорбированных на графитовых поверхностях. В частности, при использовании графита в качестве подложки целесообразно минимизировать время его контакта с окружающей средой до секунд. Стоит отметить, что в работе, где нанесение молекул белка (фибриногена, ферритина, сывороточного альбумина человека, IgG) на поверхность ВОПГ проводилось в течение 10 с после скалывания, наблюдалась денатурация и расплывание молекул на поверхности [79].

АДСОРБЦИЯ БИОПОЛИМЕРОВ НА МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ ВОПГ

Дегибридизация ДНК и разворачивание многих белков на чистой поверхности графита значительно ограничивает его применение как подложки для стабильного и хорошо воспроизводимого АСМ-анализа биополимеров, поэтому с начала 2000-х годов стали разрабатываться методики модификации поверхности графита. Модификация поверхности графита изменяет характер адсорбции на ней молекул биополимеров и в ряде случаев делает такую поверхность удобной для АСМ-изучения структурных, конформационных и кинетических характеристик отдельных молекул биополимеров.

Адсорбция ДНК на модифицированной в плазме поверхности ВОПГ

Выдерживание поверхности ВОПГ в тлеющем разряде в присутствии паров пентиламина в течение нескольких секунд позволило модифицировать поверхность аминогруппами и сохранить низкую среднеквадратичную шероховатость поверхности (0.2–0.5 нм) [110, 111]. Таким образом модифицированная поверхность допускает хорошо воспроизводимую адсорбцию молекул ДНК из водного или солевого раствора в расправленном состоянии. В данном случае адсорбция ДНК осуществляется за счет электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и положительно заряженными аминогруппами на поверхности. Измеряемая из АСМ-изображений высота молекулы ДНК на модифицированной поверхности ВОПГ (1.6 ± 0.3 нм) оказалась большей, чем на слюде (0.7 ± 0.1 нм), что может быть связано как с отсутствием солевой “шубы” вокруг молекулы ДНК на модифицированной поверхности ВОПГ, так и с меньшей, чем на поверхности слюды, деформацией двойной спирали ДНК. В другой работе адсорбция расправленных молекул ДНК на поверхности ВОПГ, модифицированной в плазме в присутствии паров воды, происходила в присутствии одновалентных и двухвалентных катионов, которые, по всей видимости, перезаряжают активированную гидроксильными группами поверхность ВОПГ [112].

Модификация не растворимыми в воде органическими соединениями

Способность органических молекул к самоупорядочению на базальной поверхности графита была впервые продемонстрирована на примере алканов, чьи углеводородные цепочки выстраивались вдоль направлений кристаллографических осей поверхности ВОПГ [113]. В дальнейших исследованиях было показано, что самоорганизация на поверхности графита (образование так называемых наношаблонов) является общим свойством многих классов органических молекул, включая длинноцепочечные алканы, спирты, порфирины, олигопептиды, жирные кислоты, а также их производные (рис. 4а, 4б) [114120]. Было установлено, что самоорганизация органических молекул происходит за счет ван-дер-ваальсовых сил и образования водородных связей между функциональными группами молекул [114, 118, 121, 122], причем большую роль играет соответствие длины связи С–С углеводородной цепочки и поверхности графита [116, 123]. В ряде работ была исследована адсорбция молекул ДНК на поверхности ВОПГ, модифицированной наношаблонами из стеариламина, додециламина, стеариновой кислоты и стеарилового спирта [47, 124127]. Для формирования самоорганизующихся пленок данные соединения наносили из растворов в хлороформе, изопропаноле или этаноле с помощью спинкоутинга (центрифугирования), а также из паров.

Рис. 4.

а: АСМ-изображение самоорганизующегося слоя стеариламина на поверхности ВОПГ (слева вверху приведено Фурье-преобразование изображения). Перепечатано из [124], Копирайт (2010), с разрешения Эльзевир. б: АСМ-изображение самоорганизующегося слоя стеариновой кислоты на поверхности ВОПГ. Перепечатано с разрешения из [119]. Копирайт (2013) Американское Химическое Общество. в: АСМ-изображение ДНК, нанесенной из 1 мМ раствора трис (pH 7.8) на самоорганизующийся слой додециламина на поверхности ВОПГ. Перепечатано с разрешения из [125]. Копирайт (2009) Американское Химическое Общество. г–е: АСМ-изображения (1 × 1 мкм2) ДНК на самоорганизующемся слое стеариламина (г, д), стеариновой кислоты (е) на поверхности ВОПГ в 5 мМ растворе NaCl(г), 10 мМ растворе MgCl2 (д), 10 мМ растворе NaCl (е). Воспроизведено из [127] по лицензии CC BY-NC 3.0 – опубликовано Королевским Химическим Обществом. ж: слева полноатомная молекулярная модель фрагмента молекулы ДНК ((ГЦ)25), адсорбированного на поверхности модифицированного стеариламином графена; справа относящаяся к данной модели диаграмма корреляции между средним количеством пар оснований, внутренних π–π-связей, внутренних водородных связей, водородных связей ДНК-стеариламин и межфазовой энергией ДНК-поверхность. Перепечатано с разрешения из [57]. Копирайт (2020) Американское Химическое Общество. АСМ-изображения (а, в–е) получены в режиме прерывистого контакта на воздухе (а, в), в растворе (г–е) по каналу “фаза” (а, г–е), “высота” (в). АСМ-изображение (б) получено в растворе в режиме частотной модуляции по каналу “высота”.

ДНК. ДНК адсорбируется на наношаблонах стеариламина, додециламина, стеариновой кислоты и стеарилового спирта в расправленном состоянии, при этом наблюдается эпитаксиальный эффект: сегменты адсорбированных молекул ДНК вытянуты прямолинейно вдоль ламелей наношаблона, направленных вдоль осей симметрии третьего порядка на поверхности графита (рис. 4в–4е) [124, 126, 127]. Высота молекулы ДНК на наношаблонах, как правило, превышает 1 нм, как и в случае с модифицированной в плазме поверхностью графита. Контурная длина молекул ДНК на наношаблонах додециламина и стеариламина значительно (на 35 и 20% соответственно) превышает теоретическую длину в предположении B-формы, что свидетельствует о механическом растяжении “линейно-сегментированных” молекул ДНК на таких наношаблонах [124, 125].

На примере самоорганизованного слоя стеариламина на поверхности графена с помощью полноатомного молекулярного моделирования было показано, что молекулы модификатора увеличивают конформационную стабильность ДНК за счет стабилизации водородных связей между парными основаниями и стэкингового взаимодействия между парами нуклеотидов (рис. 1г и 4ж) [57]. Кроме того, присутствие молекул модификатора препятствует π–π-стэкингу ДНК с поверхностью графена, тем самым уменьшая дегиб-ридизацию ДНК, адсорбированной на модифицированной поверхности графена по сравнению с немодифицированной.

Статистический анализ флуктуаций направлений контуров молекул ДНК, адсорбированных на три наношаблона на поверхности ВОПГ – наношаблоны из стеариламина, стеариновой кислоты и стеарилового спирта, различающихся лишь функциональной группой (–NH2, –COH и –COOH), продемонстрировал различную конформацию ДНК на этих поверхностях. На поверхностях наношаблона стеариламина и стеариновой кислоты адсорбцию ДНК можно охарактеризовать по-разному на двух масштабах (рис. 5). На малой длине (менее 200 нм для стеариламина и менее 400 нм для стеарилового спирта) конформация ДНК близка к конформации жестких стержней (ν = = 0.87 ± 0.01), что соответствует наблюдаемой эпитаксии ДНК. На большой длине конформация ДНК соответствует конформации двухмерной плотной глобулы при отсутствии самопересечений (ν = 0.52 ± 0.02) для стеариламина и смешанной, не полностью релаксированной конформации (ν = 0.66 ± 0.02) для стеарилового спирта [126]. Наблюдаемое различие конформации ДНК на наношаблонах стеариламина и стеарилового спирта объясняется их разным взаимодействием с ДНК: с положительно заряженным наношаблоном стеариламина ДНК взаимодействует в основном посредством электростатического притяжения, а с практически нейтральным наношаблоном стеарилового спирта – посредством ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий.

Рис. 5.

Зависимость среднеквадратичного расстояния 〈R2〉 от внутренней длины контура l для λ-ДНК, адсорбированной на наношаблонах стеариламина, стеарилового спирта и стеариновой кислоты. Прямые линии – линейные аппроксимации зависимостей (в двойном логарифмическом масштабе) по методу наименьших квадратов. Перепечатано с разрешения из [126]. Копирайт (2014) Американское Химическое Общество.

Оценка персистентной длины λ-ДНК, адсорбированной на наношаблоне стеариламина, составила 31 ± 2 нм, что значительно меньше значения, получаемого для ДНК, нанесенной из раствора с низкой ионной силой (<20 мМ) на слюду (~53 нм) [27]. Это обстоятельство свидетельствует о потере жесткости молекулы ДНК, адсорбированной на наношаблоне стеариламина, что можно объяснить частичной нейтрализацией отрицательного заряда ДНК положительно заряженными аминогруппами наношаблона. Было показано, что взаимодействие ДНК с положительно заряженными поверхностями может приводить к пятикратному уменьшению персистентной длины [128]. Другой фактор уменьшения персистентной длины – частичная денатурация ДНК на наношаблоне, которая подтверждается наличием на АСМ-изображениях пузырьков плавления (рис. 4в, стрелка). Причиной локальной денатурации ДНК может быть дополнительное напряжение в молекуле ДНК, вызываемое ее локальным распрямлением при адсорбции на поверхности наношаблона [129131].

Взаимодействие ДНК с наношаблоном стеариновой кислоты оказалось слабее, чем с наношаблонами стеариламина и стеарилового спирта: конформацию ДНК на этой поверхности можно охарактеризовать моделью самоизбегающих случайных блужданий при отсутствии самопересечений (ν = 0.77 ± 0.01) [127], а при высушивании поверхности с адсорбированной ДНК наблюдается эффект “молекулярного расчесывания”, приводящий к выстраиванию молекул ДНК (ν = 0.93 ± ± 0.01; рис. 5) за счет действия силы поверхностного натяжения вдоль направления отступающего мениска жидкости [126]. Такое поведение ДНК на поверхности наношаблона стеариновой кислоты можно объяснить небольшим отрицательным зарядом стеариновой кислоты, затрудняющим взаимодействие поверхности с одноименно заряженной ДНК (такое взаимодействие остается возможным за счет ван-дер-ваальсовой составляющей).

Было исследовано влияние ионной силы и катионного состава раствора на конформацию молекул ДНК, адсорбированных на поверхности наношаблона стеариламина. Так, увеличение ионной силы приводит к компактизации ДНК на поверхности (уменьшению $\langle {{R}^{2}}\rangle $ для ДНК-сегментов фиксированной длины), а добавление 10 мМ раствора MgCl2 – к образованию плотных “листовых” структур ДНК, в которых нить ДНК упакована в соседние ламели стеариламина (рис. 4д) [127]. Эти результаты объясняются уменьшением эффективной жесткости молекулы ДНК из-за экранирования части ее отрицательного заряда, а также эффектом дебаевской экранировки, позволяющим сегментам ДНК приближаться друг к другу на ширину одной ламели стеариламина. Было обнаружено, что скейлинговый показатель степени ν не зависит от ионной силы в диапазоне 0–20 мМ [127]. Значения ν и эффективной персистентной длины Р для ДНК, адсорбированной на модифицированной поверхности ВОПГ из разных растворов, приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Скейлинговый показатель степени ν и эффективная персистентная длина Р для ДНК, адсорбированной на модифицированной поверхности ВОПГ из разных растворов

Вид ДНК Модификатор Раствор Среда в АСМ ν P, нм Литература
Двухцепочечная (λ) Стеариламин Вода Воздух 0.52 ± 0.02 (l > 200 нм)
0.87 ± 0.01 (l ≤ 200 нм)
31 ± 2 124
Двухцепочечная (линеаризованная плазмидная, 2000 пар оснований) Стеариламин Вода Воздух 0.53 ± 0.02 (l > 250 нм) 34 ± 2 124
Двухцепочечная (T7) Стеариламин 20 мM NaCl 20 мM раствор NaCl 0.51 ± 0.01 125
Двухцепочечная (T7) Стеариламин 20 мM NaCl 20 мM раствор NaCl 0.51 ± 0.01 125
Двухцепочечная (T7) Стеариламин 5 мM MgCl2 5 мM раствор MgCl2 0.54 ± 0.02 125
Двухцепочечная (λ) Стеариловый спирт Вода Воздух 0.66 ± 0.02 (l > 400 нм)
0.87 ± 0.01 (l ≤ 400 нм)
124
Двухцепочечная (λ) Стеариновая кислота Вода Воздух 0.93 ± 0.01 124
Двухцепочечная (T7) Стеариновая кислота 10 мM NaCl 10 мM раствор NaCl 0.77 ± 0.01 125
Двухцепочечная (плазмидная, 3845 пар оснований) GM Вода Воздух 0.59 ± 0.01 130
Одноцепочечная (5386 пар оснований) GM Вода Воздух 0.73 ± 0.01 9.1 ± 0.3 134
Одноцепочечная (5386 пар оснований) GM ~1 мM NaCl Воздух 6.7 ± 0.2 134
Одноцепочечная (5386 пар оснований) GM ~10 мM NaCl Воздух 4.6 ± 0.3 134

В АСМ-исследованиях, проведенных in situ в режиме реального времени, было продемонстрировано, что тепловое движение молекул ДНК на поверхностях наношаблонов стеариламина и стеариновой кислоты имеет направленный характер, причем направления движения совпадают с направлениями эпитаксии ДНК, т.е. движение сегментов ДНК происходит вдоль ламелей подстилающего наношаблона, выстроенных по трем направлениям симметрии поверхности ВОПГ (рис. 6а) [127, 132]. При этом наблюдается также движение сегментов ДНК поперек ламелей и вне плоскости поверхности.

Рис. 6.

а: Последовательность АСМ-изображений фрагмента молекулы ДНК бактериофага Т7, адсорбированной на поверхности самоорганизующегося слоя стеариламина на поверхности ВОПГ в 5 мМ растворе NaCl. Снизу приведено время (в минутах) получения каждого АСМ-изображения относительно первого. Стрелки показывают “перескок” контура ДНК между соседними ламелями стеариламина. Размер АСМ-изображений 130 × 220 нм2 (изображения получены в режиме прерывистого контакта по каналу “фаза” в растворе). Воспроизведено из [127] по лицензии CC BY-NC 3.0 – опубликовано Королевским Химическим Обществом. б: Последовательность АСМ-изображений остановленных элонгационных комплексов на самоорганизующемся слое стеариламина на поверхности ВОПГ до (изображения 1–2) и после (изображения 3–4) добавления нуклеозидтрифосфатов. Стрелка указывает на молекулу РНК-полимеразы. Снизу приведено время (в минутах) получения каждого АСМ-изображения относительно первого. Размер АСМ-изображений 500 × 500 нм2 (изображения получены в режиме пиковой силы в растворе). Перепечатано с разрешения из [132]. Копирайт (2017) Американское Химическое Общество.

Изучение транскрипции. С использованием модифицированной наношаблоном стеариламина поверхности ВОПГ в качестве подложки был разработан подход для АСМ-исследования транскрипции на масштабе отдельных молекул ДНК в режиме реального времени (рис. 6б) [132]. Остановленные элонгационные транскрипционные комплексы адсорбировали на поверхность наношаблона, после чего во время зацикленного АСМ-сканирования добавляли набор нуклеозидтрифосфатов к раствору, в котором проводилось сканирование. На АСМ-изображениях наблюдалась диссоциация РНК-полимеразы с ДНК после окончания транскрипции. Модифицированная молекулярными наношаблонами поверхность ВОПГ позволяет избежать высоких ионных концентраций вблизи поверхности, типичных для слюды, и, вероятно, может применяться для АСМ-исследования других ДНК-белковых взаимодействий в режиме реального времени.

Модификация с помощью N,N'-(декан-1,10-диил)-бис-(тетраглицинамида)

Для проведения АСМ-исследований на модифицированной поверхности ВОПГ была разработана процедура с использованием молекулы на основе олигоглицина и углеводорода: N,N'-(декан-1,10-диил)-бис-(тетраглицинамид) ([Gly4–NHCH2]C8H16[CH2NH–Gly4], GM). Данная линейная молекула содержит два положительно заряженных (при нейтральном значении рН) тетраглициновых участка по краям и один обладающий гидрофобными свойствами центральный углеводородный участок длиной в 10 атомов углерода. В отличие от модификаторов, описанных выше, молекулы GM хорошо растворимы в воде и наносятся из водного раствора с помощью дропкастинга (литья по каплям), образуя монослой высотой около 0.4 нм [133].

ДНК. Молекулы ДНК адсорбируются на поверхности GM–ВОПГ из воды или растворов со слабой ионной силой в расправленном состоянии и позволяют получать стабильные АСМ-изображения как в водной среде, так и после высушивания (рис. 7) [132, 134, 135]. Морфометрические характеристики ДНК на этой поверхности отличаются от таковых на слюде. Так, одноцепочечная ДНК адсорбируется на поверхность GM–ВОПГ без вторично структурированных элементов, образующихся при адсорбции на поверхность слюды (рис. 7а, 7б) [134, 136]. Высота молекулы, измеренная из АСМ-изображений, несколько больше для GM–ВОПГ (0.35 ± 0.05 нм для одноцепочечной и 0.9 ± 0.1 нм для двухцепочечной ДНК), чем для слюды (0.3 ± 0.1 и 0.7 ± 0.1 нм), а значения контурной длины молекул соответствуют друг другу [134]. Равномерная адсорбция молекул ДНК также происходит на GM-модифицированной поверхности графена [137].

Рис. 7.

а–в: АСМ-изображения одноцепочечной ДНК M13mp18 (а, б), двухцепочечной λ-ДНК, адсорбированной из буфера 1 мМ трис–HCl (в) на поверхности GM–ВОПГ(а, в), на поверхности слюды в присутствии 5 мМ Mg2+ (б). Перепечатано с разрешения из [134] Копирайт (2006) Федерация Европейских Биохимических Обществ. г: Последовательности АСМ-изображений молекул плазмидной ДНК, адсорбированных на поверхности GM–ВОПГ в воде (верхний ряд), в растворе 5 мМ NaCl (средний ряд), в растворе 100 мМ NaCl (нижний ряд). Стрелки указывают на движение сегментов молекул ДНК. Время получения каждого АСМ-изображения приведено относительно первого АСМ-изображения последовательности (в минутах). Размер АСМ-изображений составляет 570 × 720 нм2 (верхний ряд), 300 × × 300 нм2 (средний ряд) и 500 × 500 нм2 (нижний ряд). Перепечатано с разрешения из [132]. Копирайт (2017) Американское Химическое Общество. Представленные изображения получены в режиме прерывистого контакта по каналу “высота” на воздухе (а–в) и в растворе (г).

Адсорбция ДНК на поверхности GM–ВОПГ из водного раствора осуществляется за счет электростатического взаимодействия между аминогруппами монослоя GM и фосфатными группами молекул ДНК [134]. Конформация адсорбированных молекул двухцепочечной ДНК близка к проекции трехмерной конформации на двухмерную поверхность при наличии самопересечений (ν = 0.59 ± 0.01), что соответствует сценарию “кинетического захвата” [132, 138]. Действительно, покадровые АСМ-исследования в воде, проведенные в режиме реального времени, продемонстрировали, что конформация ДНК на поверхности GM–ВОПГ зафиксирована, однако увеличение концентрации NaCl приводит к экранированию зарядов и возникновению теплового движения биомолекул на поверхности (рис. 7г) [132]. Для одноцепочечной ДНК на поверхности GM–ВОПГ было найдено значение ν = 0.73 ± 0.01, что характеризует ее конформацию как самоизбегающее случайное блуждание [136]. При этом эффективная персистентная длина одноцепочечной ДНК, адсорбированной на поверхности GM–ВОПГ, варьирует от ~9 нм при адсорбции из раствора очень низкой ионной силы до ~4.5 нм при адсорбции из 10 мМ раствора NaCl (табл. 1) [136].

Использование поверхности GM–ВОПГ в качестве подложки для АСМ-исследования позволило улучшить качество морфологического анализа олигонуклеотидов и наноструктур на их основе. Анализ АСМ-изображений таких структур позволяет различать вызванные образованием неканонических структур небольшие изменения длины олигонуклеотидов [139], а также различные неканонические структуры между собой по высоте [140] и морфологии [141, 142].

С помощью АСМ высокого разрешения обнаружено аномально большое количество изгибов малого радиуса (<3.5 нм) на адсорбированных на поверхности GM–ВОПГ молекулах ДНК при адсорбции из воды или растворов с низкой ионной силой [138]. Такие изгибы сопряжены с локальным нарушением целостности двойной спирали ДНК [143] и появлением глазков плавления и шпилек ДНК, вызывающих механическую нестабильность молекулы биополимера. Возникновение волнообразного изгиба ДНК интерпретировано сверхкритическим изгибным напряжением, обусловленным анизотропным электростатическим взаимодействием ДНК с чередующимися линейными рядами положительных зарядов аминогрупп на подстилающих ламелях GM. Обнаруженный эффект подчеркивает особую роль одномерных периодически заряженных структур во взаимодействии с ДНК.

Белки. Конформация и кинетика адсорбции белков на GM-модифицированной поверхности ВОПГ значительно отличаются от таковых на немодифицированных графитовых поверхностях. С помощью АСМ на воздухе были исследованы морфологические особенности белков, нанесенных на поверхность GM–ВОПГ из 1–50 мкг/мл раствора в воде или физиологическом буфере при длительности выдерживания после нанесения от нескольких секунд до 1 мин [74, 79, 133, 144149]. Некоторые примеры приведены на рис. 8 (внизу представлены кристаллографические структуры исследуемых белков, визуализированные с помощью программы NGL Viewer [150]).

Рис. 8.

а: АСМ-анализ белков и ДНК-белковых комплексов на поверхности GM–ВОПГ. Слева АСМ-изображение молекул фибриногена, справа соответствующее распределение высот областей молекулы. Перепечатано с разрешения из [144] Копирайт (2015) Международное общество по изучению тромбозов и гемостаза – опубликовано издательством Уайли энд Сонс. Снизу приведена кристаллическая структура фибриногена (номер PDB 3GHG). б–в: АСМ-изображения молекул IgG (стрелками показаны молекулы с выраженной Y-образной формой) (б) и сывороточного альбумина человека (в). Перепечатано из [72], Копирайт (2016), с разрешения Эльзевир. Снизу приведены кристаллические структуры IgG (номер PDB 1IGT) и сывороточного альбумина человека (номер PDB 1AO6). г: АСМ-изображение одиночных комплексов и суперкомплексов миелопероксидазы (МПО) и церулоплазмина (ЦП). Справа приведены профили сечения молекулы миелопероксидазы, церулоплазмина и суперкомплекса миелопероксидаза–церулоплазмин вдоль пунктирных линий на АСМ-изображении. Перепечатано из [147], Копирайт (2018), с разрешения Эльзевир. Снизу приведены кристаллические структуры миелопероксидазы человека (номер PDB 1MHL) и церулоплазмина человека (номер PDB 1KCW). д: АСМ-изображение комплекса анти-ДНК IgG c ДНК. Перепечатано из [133], Копирайт (2020), с разрешения Эльзевир. Представленные изображения получены в режиме прерывистого контакта по каналу “высота” на воздухе. Кристаллические структуры белка визуализированы с помощью NGL Viewer [150].

При таких условиях фибриноген адсорбируется на поверхности GM–ВОПГ в виде отдельных молекул вытянутой формы с ярко выраженной трехузловой структурой (рис. 8а) [74, 79, 133, 144146]. Высота у внешних глобул составляет ~3 нм, а у центральной глобулы – ~2 нм (рис. 8а). Эти размеры значительно ближе к кристаллографическим размерам (5 и 3 нм соответственно [151]), чем значения, получаемые методом АСМ на других поверхностях, например поверхности стекла, свежесколотой и модифицированной слюды [133, 145]. Кроме того, на поверхности GM–ВОПГ становится возможна визуализация дополнительных структурных особенностей молекулы, таких как αС-домены, петли спиральных участков, субструктуры внешних глобул (γ- и β-узлов) [133, 144]. Таким образом, использование GM–ВОПГ позволяет повысить достоверность структурного анализа фибриногена на субмолекулярном уровне.

Молекулы IgG адсорбируются на поверхности GM–ВОПГ в основном по отдельности в виде частиц высотой 2.9 ± 0.3 нм Y-образной структуры (рис. 8б), отражающей кристаллографическую структуру молекулы и указывающей на плоскостную ориентацию адсорбированной молекулы [79, 133]. Сравнение средних размеров молекулы IgG, полученных из АСМ-изображений белка, адсорбированного на разных поверхностях, свидетельствует о наименьшем искажении высоты на поверхности GM–ВОПГ [133].

Сывороточный альбумин человека тоже адсорбируется на поверхности GM–ВОПГ в виде индивидуальных молекул (рис. 8в). Молекулы имеют вытянутую глобулярную форму со средней высотой глобул 2.2 нм, что значительно выше средней высоты молекулы, измеренной из АСМ-изображений на поверхности слюды [152] или кремния [153].

АСМ-исследования продемонстрировали, что ряд других белков, таких как ферритин, миелопероксидаза, лактоферрин, церулоплазмин, фактор XIII и РНК-полимеразы, также адсорбируется на поверхность GM–ВОПГ в нативноподобной конформации с размерами, близкими к кристаллографическим [79, 147149]. АСМ-анализ позволил выявить ряд новых структурных данных об этих белках и их комплексах. Например, была впервые охарактеризована наноморфология отдельных комплексов миелопероксидазы с церулоплазмином и лактоферрина с церулоплазмином, обнаружено формирование суперкомплексов миелопероксидазы с церулоплазмином, имеющих структуру плотно уложенных линейно выстроенных бусин (рис. 8г) [147], описаны изменения молекулярной организации фактора XIII, вызванные его активацией [148].

Реализация сценария “кинетического захвата” при адсорбции ДНК на поверхности GM–ВОПГ, а также адсорбция на этой поверхности отдельных молекул белка в нативноподобной конформации при недлительной адсорбции предполагают перспективу использования поверхности GM–ВОПГ для АСМ-исследования структуры и свойств ДНК-белковых комплексов на уровне отдельных молекул. В работе [133] подтверждено сохранение целостности комплексов ДНК с анти-ДНК антителами класса IgG при их нековалентной адсорбции на поверхности GM–ВОПГ (рис. 8д). В работе [154] на модельных системах отдельных комплексов и квазикристаллов белка Dps с ДНК, адсорбированных на поверхности GM–ВОПГ, исследованы особенности упаковки генетического материала внутри бактериальных клеток. В частности, АСМ-анализ выявил неспецифический характер связывания Dps с ДНК, показал отсутствие накручивания ДНК вокруг молекулы Dps, оценил длину участка (~6 нм) взаимного контакта молекул, а также позволил сделать предположение о линейной упаковке ДНК вдоль рядов упорядоченных молекул Dps в кристалле.

Таким образом, применение поверхности GM–ВОПГ для структурного АСМ-анализа отдельных молекул ДНК, белка и ДНК-белковых комплексов является перспективным. Данный подход может быть особенно важным для АСМ-исследования белков, содержащих неструктурированные участки, структуру которых затруднительно расшифровать кристаллографическими методами. Кроме того, поверхность GM–ВОПГ является перспективной для структурного АСМ-анализа полисахаридов [155].

Разворачивание белков. Для некоторых белков продемонстрирована сильная зависимость конформации адсорбированных молекул от времени их контакта с поверхностью GM–ВОПГ. Так, АСМ-исследования, проведенные на воздухе после высушивания образцов через разные промежутки времени, продемонстрировали, что фибриноген разворачивается в тонкие фибриллярные структуры (высотой 0.3–2.0 нм) в течение нескольких минут после адсорбции на поверхность (рис. 9а, 9в), причем разворачивание разных глобулярных областей молекулы происходит независимо друг от друга [74, 146].

Рис. 9.

а: АСМ-изображение (1 × 1 мкм2) молекул фибриногена, нанесенных на поверхность GM–ВОПГ и инкубированных в воде 10 мин. Снизу приведены увеличенные участки поверхности с развернутыми молекулами фибриногена. Точечная стрелка указывает на центральную область молекулы, сплошные стрелки – на точки разветвления фибрилл во внешних областях молекулы; пунктирные стрелки – на фибриллы, соединяющие центральную область молекулы с внешней. Перепечатано из [146], Копирайт (2018), с разрешения Эльзевир. б: Полученная в буферном растворе последовательность АСМ-изображений (100 × 100 нм2) молекулы фибриногена, адсорбированной на поверхности GM–ВОПГ. Время получения каждого АСМ-изображения приведено относительно первого АСМ-изображения последовательности. в: Доля (в процентах) нативноподобных и развернутых молекул фибриногена как функция времени. б–в – Перепечатано с разрешения из [74]. Копирайт (2019) Американское Химическое Общество. г: Полученная в воде последовательность АСМ-изображений (100 × 100 нм2) молекул РНК-полимеразы E. coli, адсорбированных на поверхности GM–ВОПГ. Время каждого АСМ-изображения приведено относительно первого АСМ-изображения последовательности. Перепечатано из [149], Копирайт (2020), с разрешения Эльзевир. д: Зависимость средней высоты молекул РНК-полимеразы E. coli, адсорбированных на поверхности ВОПГ, модифицированного GM и денатурированным слоем белка. Перепечатано из [149], Копирайт (2020), с разрешения Эльзевир. Представленные изображения получены в режиме прерывистого контакта на воздухе (а, в) и в режиме пиковой силы в растворе (б, г).

Также наблюдалось вызванное взаимодействием с поверхностью GM–ВОПГ разворачивание молекул холофермента РНК-полимеразы E. coli и РНК-полимеразы бактериофага SP6 в фибриллярные структуры высотой 1–2 нм [149]. Характерное время разворачивания молекул составляет ~7 мин, а эффективная персистентная длина развернутых молекул – 8 и 11 нм для РНК-полимеразы E. coli и бактериофага SP6 соответственно. Высота, контурная и персистентная длины образующихся в результате разворачивания фибрилл молекул фибриногена и РНК-полимеразы свидетельствуют о разворачивании в основном третичной структуры этих белков [74, 146, 149].

Относительно большое характерное время разворачивания молекул фибриногена и РНК-полимеразы E. coli на поверхности GM–ВОПГ (7– 10 мин) позволило на их примере впервые визуализировать процесс разворачивания отдельных молекул in situ в режиме реального времени. На рис. 9б проиллюстрировано разворачивание молекулы фибриногена, а на рис. 9г – разворачивание молекул РНК-полимеразы E. coli из нативной формы в фибриллярную [74, 149]. Зависимость средней высоты адсорбированных молекул РНК-полимеразы E. coli от времени (рис. 9д, нижняя кривая) демонстрирует постепенное уменьшение высоты, связанное с разворачиванием белка. Обнаруженные особенности поведения двух данных белков позволяют предположить, что поверхность GM–ВОПГ способна вызывать разворачивание третичной структуры и у других белков.

Причиной значительного изменения поведения биополимеров при адсорбции на поверхности GM–ВОПГ по сравнению с их поведением при адсорбции на свежесколотой поверхности ВОПГ может быть ряд факторов. Во-первых, это увеличение гидрофильности поверхности (проявляющееся в уменьшении среднего значения статического угла смачивания водой на 12°–15° [74, 133]). Вместе с тем наличие у молекул GM гидрофобного углеводородного участка, образующего протяженные ламели на поверхности графита [156], оставляет предпосылки для разворачивания контактирующей с ней молекулы белка. Гидрофобность поверхности является хорошо известным фактором, вызывающим денатурацию глобулярных белков при адсорбции [59, 60, 70, 157, 158]. Во-вторых, наличие электрического заряда у поверхности GM–ВОПГ может стабилизировать адсорбцию белка при наличии у него противоположно заряженного участка. Наконец, как было отмечено выше, модификация графита органическими молекулами затрудняет π–π-стэкинговое взаимодействие биополимера с поверхностью ВОПГ, вызывающее денатурацию ДНК и конформационные изменения белков при адсорбции. Для более детального понимания особенностей взаимодействия поверхности GM–ВОПГ с белками перспективно использование методов молекулярной динамики.

Совокупность данных о морфологии ДНК и белков на поверхности GM-ВОПГ позволяет рассматривать данную поверхность как эффективный инструмент для структурных исследований биополимеров и биополимерных комплексов, способный повысить точность данных АСМ. Вместе с тем следует учитывать особенности взаимодействия биополимеров с этой поверхностью, такие как волнообразный изгиб ДНК при малой ионной силе и разворачивающие действие со стороны поверхности GM-графита на некоторые белки на масштабе времени в несколько минут. Также для развития АСМ биополимеров представляется перспективной контролируемая модификация графитовых поверхностей другими органическими соединениями.

Модификация денатурированным белком

Способность некоторых белков к сильной денатурации при адсорбции на чистой поверхности ВОПГ была использована для модификации поверхности графита слоем денатурированного белка. В работе [149] с помощью АСМ-исследования in situ в режиме реального времени наблюдали за морфологическими изменениями свежесколотой поверхности ВОПГ после добавления раствора холофермента РНК-полимеразы E. coli. Было продемонстрировано, что в такой системе сначала происходит формирование денатурированного слоя белка на поверхности ВОПГ (рис. 10а, кадры 1–2), за которым следует адсорбция на этом слое нативноподобных молекул РНК-полимеразы (рис. 10а, кадры 3–16). Причем адсорбированные на слое денатурированного белка молекулы РНК-полимеразы остаются стабильными по меньшей мере в течение ~1.5 часов (рис. 9д, верхняя кривая; рис. 10а, 10б). В данном случае можно говорить об “антиметаморфных” свойствах модифицированной денатурированным белком поверхности ВОПГ, т.е. поверхности, не вызывающей конформационных изменений адсорбирующихся на ней белков [159], в отличие от “метаморфной” поверхности GM–ВОПГ (и тем более немодифицированной поверхности ВОПГ), вызывающей разворачивание молекул РНК-полимеразы при адсорбции. Поскольку, как уже упоминалось, свежесколотая поверхность ВОПГ способна денатурировать многие белки, создание денатурированного слоя белка, выступающего в качестве модификатора поверхности графита, может быть использовано для получения различных графитовых биоматериалов. Стоит отметить, что “антиметаморфные” поверхности широко востребованы в биомедицине и биотехнологии, например, для разработки биосовместимых поверхностей или биосенсорных поверхностей, основанных на применении ферментов [62].

Рис. 10.

а: Последовательность АСМ-изображений свежесколотой поверхности ВОПГ до (кадр 1) и после (кадры 2–16) добавления раствора РНК-полимеразы E. coli. Номера и время получения кадров приведены относительно первого кадра. Стрелками указаны примеры деадсорбировавшихся молекул, пунктирными кругами – области с наблюдаемой поверхностной диффузией молекул. б: Серии увеличенных изображений из кадров 9–16. АСМ-изображения получены в режиме пиковой силы. Размеры изображений 1 × 1 мкм2 (a) и 100 × 100 нм2 (б). Перепечатано из [149], Копирайт (2020), с разрешения Эльзевир. Представленные изображения получены в режиме пиковой силы в растворе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При контакте графитовых поверхностей с ДНК большую роль играет π–π-стэкинговое взаимодействие, а при контакте с белками – π–π-стэкинговое, ван-дер-ваальсово и гидрофобное взаимодействие. Взаимодействие с поверхностью графита приводит молекулы ДНК к дегибридизации, а молекулы многих белков – к денатурации и агрегации на поверхности, что сужает возможности использования чистых графитовых поверхностей для нанесения биополимеров с сохранением их нативной структуры. В связи с этим применение свежесколотой поверхности ВОПГ в качестве подложки для АСМ-исследования биополимеров ограничено. Кроме того, большая подверженность графитовых поверхностей случайным и слабо контролируемым загрязнениям из окружающей среды ухудшает воспроизводимость и осложняет интерпретацию данных экспериментов, полученных на такой подложке.

Модификация графитовой поверхности (самоорганизующимся) монослоем органических молекул значительно изменяет свойства поверхности и характер ее взаимодействия с молекулами биополимера. В зависимости от молекулы модификатора наблюдаются различные конформации адсорбируемых молекул ДНК на поверхность модифицированного ВОПГ, включая такие, как конформация компактной глобулы, самоизбегающие случайные блуждания, двухмерная проекция трехмерного клубка. Такое разнообразие конформаций является следствием разных видов и сил взаимодействия биополимера с поверхностью. При адсорбции на модифицированных графитовых поверхностях диаметр молекул ДНК и высота молекул белка обычно подвержены меньшему искажению, чем при адсорбции на поверхности слюды, широко используемой для АСМ-анализа биополимеров.

На примере взаимодействия поверхности GM–ВОПГ с ДНК впервые выявлено влияние периодического линейно распределенного заряда на структуру адсорбированной молекулы ДНК, приводящее к возникновению аномально большого числа изгибов малого радиуса вдоль контура молекулы.

Конформация некоторых белков на поверхности GM–ВОПГ зависит от времени контакта с ней. При относительно небольшом времени адсорбции (до 1 мин) все исследованные на данный момент белки имеют нативноподобную конформацию. При таких условиях нанесения АСМ позволила значительно улучшить качество структурного анализа некоторых белков по сравнению с экспериментами на других подожках и сделать ряд новых важных наблюдений. При увеличении времени контакта некоторых белков с поверхностью GM-ВОПГ до нескольких минут наблюдается медленное разворачивание третичной структуры молекул белка из глобулярных в фибриллярные структуры.

С помощью АСМ-анализа продемонстрирована стабилизация конформации молекул РНК-полимеразы при адсорбции на поверхности ВОПГ, модифицированной слоем того же белка, денатурированного от взаимодействия со свежесколотой поверхностью ВОПГ. Данный подход к модификации поверхности графита может быть использован для разработки широко востребованных в биотехнологии биосовместимых поверхностей.

Большое разнообразие конформаций и кинетики адсорбции молекул ДНК и белков на модифицированных графитовых поверхностях делает такие поверхности перспективными для широкого применения в биотехнологии и медицине. Кроме того, модифицированные (в частности, с помощью N,N'-(декан-1,10-диил)-бис-(тетраглицинамида)) поверхности ВОПГ перспективны как подложки для развития основанного на АСМ структурного анализа ДНК, белков и структур на их основе.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 20-13-50047).

Acknowledgments: The reported study was funded by RFBR, project number 20-13-50047.

Список литературы

  1. Binnig G., Quate C., Gerber C. // Phys. Rev. Lett. 1986. V. 56. № 9. P. 930.

  2. Hansma H.G., Sinsheimer R.L., Groppe J., Bruice T.C., Elings V., Gurley G., Bezanilla M., Mastrangelo I.A., Hough P.V.C., Hansma P.K. // Scanning. 1993. V. 15. № 5. P. 296.

  3. Lal R., John S.A. // Am. J. Physiol.-Cell Physiol. 1994. V. 266. № 1. P. C1.

  4. Müller D.J., Janovjak H., Lehto T., Kuerschner L., Anderson K. // Progr. Biophys. Molec. Biol. 2002. V. 79. № 1. P. 1.

  5. Dufrêne Y.F., Ando T., Garcia R., Alsteens D., Martinez-Martin D., Engel A., Gerber C., Müller D.J. // Nat. Nanotechnol. 2017. V. 12. № 4. P. 295.

  6. Gallyamov M.O. // Macromol. Rapid Commun. 2011. V. 32. № 16. P. 1210.

  7. Mirsaidov U.M., Zheng H., Casana Y., Matsudaira P. // Biophys. J. 2012. V. 102. P. L15.

  8. Carter B., Williams D.B. // Transmission Electron Microscopy: Diffraction, Imaging and Spectrometry. Springer, 2016.

  9. Jandt K.D. // Adv. Eng. Mater. 2007. V. 9. № 12. P. 1035.

  10. Xu L.-C., Bauer J.W., Siedlecki C.A. // Colloids Surf. B. 2014. V. 124. P. 49.

  11. Pinto A.M., Gonçalves I.C., Magalhães F.D. // Colloids Surf. B. 2013. V. 111. P. 188.

  12. Fu Q., Si Y., Liu L., Yu J., Ding B. // J. Colloid Interface Sci. 2019. V. 555. P. 11.

  13. Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S. // Methods. 2009. V. 47. № 3. P. 206.

  14. Lyubchenko Y.L. // Biophys Rev. 2014. V. 6. № 2. P. 181.

  15. Lyubchenko Y.L. // J. Phys. D. 2018. V. 51. № 40. P. 403001.

  16. Beckwitt E.C., Kong M., Van Houten B. // Seminars Cell Development. Biol. 2018. V. 73. P. 220.

  17. Skabkin M.A., Kiselyova O.I., Chernov K.G., Sorokin A.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V., Vasiliev V.D., Ovchinnikov L.P. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. № 18. P. 5621.

  18. Billingsley D.J., Bonass W.A., Crampton N., Kirkham J., Thomson N.H. // Phys. Biol. 2012. V. 9. № 2. P. 021001.

  19. Chao J., Zhang P., Wang Q., Wu N., Zhang F., Hu J., Fan C.H., Li B. // Nanoscale. 2016. V. 8. № 11. P. 5842.

  20. Adamcik J., Mezzenga R. // Macromolecules. 2012. V. 45. № 3. P. 1137.

  21. Sanchez H., Suzuki Y., Yokokawa M., Takeyasu K., Wyman C. // Integrative Biol. 2011. V. 3. № 11. P. 1127.

  22. Zhong Q., Inniss D., Kjoller K., Elings V. // Surf. Sci. 1993. V. 290. № 1–2. P. L688.

  23. Xu K., Sun W., Shao Y., Wei F., Zhang X., Wang W., Li P. // Nanotechnol. Revs. 2018. V. 7. № 6. P. 605.

  24. Stokke B., Brant D. // Biopolymers. 1990. V. 30. № 13–14. P. 1161.

  25. Valle F., Favre M., De Los Rios P., Rosa A., Dietler G. // Phys. Rev. Lett. 2005. V. 95. № 15. P. 158105.

  26. Ercolini E., Valle F., Adamcik J., Witz G., Metzler R., De Los Rios P., Roca J., Dietler G. // Phys. Rev. Lett. 2007. V. 98. № 5. 058102.

  27. Rivetti C., Guthold M., Bustamante C. // J. Mol. Biol. 1996. V. 264. № 5. P. 919.

  28. Frontali C., Dore E., Ferrauto A., Gratton E., Bettini A., Pozzan M., Valdevit E. // Biopolymers. 1979. V. 18. № 6. P. 1353.

  29. Müller D.J., Amrein M., Engel A. // J. Struct. Biol. 1997. V. 119. № 2. P. 172.

  30. Pashley R.M. // J. Colloid Interface Sci. 1981. V. 80. № 1. P. 153.

  31. Vesenka J., Guthold M., Tang C., Keller D., Delaine E., Bustamante C. // Ultramicroscopy. 1992. V. 42. P. 1243.

  32. Christenson H.K., Thomson N.H. // Surf. Sci. Rep. 2016. V. 71. № 2. P. 367.

  33. Pastre D., Pietrement O., Fusil P., Landousy F., Jeusset J., David M.O., Hamon C., Le Cam E., Zozime A. // Biophys. J. 2003. V. 85. № 4. P. 2507.

  34. Sorel I., Piétrement O., Hamon L., Baconnais S., Le Cam E., Pastré D. // Biochemistry. 2006. V. 45. № 49. P. 14675.

  35. McCreery R.L. // Chem. Rev. 2008. V. 108. № 7. P. 2646.

  36. Ensafi A.A., Heydari-Bafrooei E., Dinari M., Mallakpour S. // J. Mat. Chem. B. 2014. V. 2. № 20. P. 3022.

  37. Walcarius A. // Trends Analyt.Chem. 2012. V. 38. P. 79.

  38. Bonanni A., Pumera M. // ACS Nano. 2011. V. 5. № 3. P. 2356.

  39. Jang S.K., Jang J., Choe W.-S., Lee S. // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015. V. 7. № 2. P. 1250.

  40. Vesel A., Elersic K., Modic M., Junkar I., Mozetic M. // Materials. 2014. V. 7. № 3. P. 2014.

  41. Pesakova V., Klezl Z., Balik K., Adam M. // J. Mater. Sci., Mater. Med. 2000. V. 11. № 12. P. 793.

  42. Zhang L., Sheng Y., Yazdi A.Z., Sarikhani K., Wang F., Jiang Y., Liu J., Zheng T., Wang W., Ouyang P., Chen P. // Nanoscale. 2019. V. 11. № 6. P. 2999.

  43. Wei X.-Q., Hao L.-Y., Shao X.-R., Zhang Q., Jia X.-Q., Zhang Z.-R., Lin Y.-F., Peng Q. // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015. V. 7. № 24. P. 13367.

  44. Zheng M., Jagota A., Semke E.D., Diner B.A., Mclean R.S., Lustig S.R., Richardson R.E., Tassi N.G. // Nature Materials. 2003. V. 2. № 5. P. 338.

  45. Husale B.S., Sahoo S., Radenovic A., Traversi F., Annibale P., Kis A. // Langmuir. 2010. V. 26. № 23. P. 18078.

  46. Manohar S., Mantz A.R., Bancroft K.E., Hui C.-Y., Jagota A., Vezenov D.V. // Nano Lett. 2008. V. 8. № 12. P. 4365.

  47. Xiong X., Han J., Chen Y., Li S., Xiao W., Shi Q. // Nanotechnology. 2020. V. 32. № 5. P. 055601.

  48. Freund J.E., Edelwirth M., Kröbel P., Heckl W.M. // Phys. Rev. B. 1997. V. 55. № 8. P. 5394.

  49. Edelwirth M., Freund J., Sowerby S.J., Heckl W.M. // Surface Sci. 1998. V. 417. № 2. P. 201.

  50. Antony J., Grimme S. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2008. V. 10. № 19. P. 2722.

  51. Sowerby S.J., Cohn C.A., Heckl W.M., Holm N.G. // PNAS. 2001. V. 98. № 3. P. 820.

  52. Shi X., Kong Y., Zhao Y., Gao H. // Acta Mech. Sin. 2005. V. 21. № 3. P. 249.

  53. Lin L., Liu Y., Zhao X., Li J. // Anal. Chem. 2011. V. 83. № 22. P. 8396.

  54. Ricardo K.B., Xu A., Salim M., Zhou F., Liu H. // Langmuir. 2017. V. 33. № 16. P. 3991.

  55. Tang L., Chang H., Liu Y., Li J. // Adv. Funct. Materials. 2012. V. 22. № 14. P. 3083.

  56. He S., Song B., Li D., Zhu C., Qi W., Wen Y., Wang L., Song S., Fang H., Fan C. // Adv. Funct. Mater. 2010. V. 20. № 3. P. 453.

  57. Kim H.S., Brown N.A., Zauscher S., Yingling Y.G. // Langmuir. 2020. V. 36. № 4. P. 931.

  58. Coglitore D., Janot J.-M., Balme S. // Adv.Colloid Interface Sci. 2019. V. 270. P. 278.

  59. Rabe M., Verdes D., Seeger S. // Adv. Colloid Interface Sci. 2011. V. 162. № 1–2. P. 87.

  60. Norde W., Lyklema J. // Adv. Colloid Interface Sci. 2012. V. 179. P. 5.

  61. Deng Z.J., Liang M., Monteiro M., Toth I., Minchin R.F. // Nat. Nanotechnol. 2011. V. 6. № 1. P. 39.

  62. Bolivar J.M., Nidetzky B. // Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 2020. V. 1868. № 2. P. 140333.

  63. Liu J., Peng Q. // Acta Biomater. 2017. V. 55. P. 13.

  64. Norde W. // Colloids Surfaces B. 2008. V. 61. № 1. P. 1.

  65. Norde W., Giacomelli C.E. // J. Biotechnol. 2000. V. 79. № 3. P. 259.

  66. Vieira E.P., Rocha S., Carmo Pereira M., Möhwald H., Coelho M.A.N. // Langmuir. 2009. V. 25. № 17. P. 9879.

  67. Sethuraman A., Belfort G. // Biophys. J. 2005. V. 88. № 2. P. 1322.

  68. Sharp J.S., Forrest J.A., Jones R.A.L. // Biochemistry. 2002. V. 41. № 52. P. 15810.

  69. Su T.J., Lu J.R., Thomas R.K., Cui Z.F., Penfold J. // J. Colloid Interface Sci. 1998. V. 203. № 2. P. 419.

  70. Lu D.R., Park K. // J. Colloid Interface Sci. 1991. V. 144. № 1. P. 271.

  71. Mosesson M.W. // J. Thrombosis Haemostasis. 2005. V. 3. № 8. P. 1894.

  72. Ta T.C., Sykes M.T., McDermott M.T. // Langmuir. 1998. V. 14. № 9. P. 2435.

  73. Ta T.C., McDermott M.T. // Colloid Surf. B. 2003. V. 32. № 3. P. 191.

  74. Dubrovin E.V., Barinov N.A., Schäffer T.E., Klinov D.V. // Langmuir. 2019. V. 35. № 30. P. 9732.

  75. Agnihotri A., Siedlecki C.A. // Langmuir. 2004. V. 20. № 20. P. 8846.

  76. Marchin K.L., Berrie C.L. // Langmuir. 2003. V. 19. № 23. P. 9883.

  77. Gettens R.T.T., Bai Z.J., Gilbert J.L. // J. Biomed. Mater. Res. A. 2005. V. 72. № 3. P. 246.

  78. Ohta R., Saito N., Ishizaki T., Takai O. // Surf. Sci. 2006. V. 600. № 8. P. 1674.

  79. Barinov N.A., Prokhorov V.V., Dubrovin E.V., Klinov D.V. // Colloids Surf. B. 2016. V. 146. P. 777.

  80. Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. // Front. Immunol. 2014. V. 5. P. 1.

  81. Cullen D., Lowe C. // J. Colloid Interface Sci. 1994. V. 166. № 1. P. 102.

  82. Vilhena J.G., Dumitru A.C., Herruzo E.T., Mendieta-Moreno J.I., Garcia R., Serena P.A., Pérez R. // Nanoscale. 2016. V. 8. № 27. P. 13463.

  83. Bujacz A. // Acta Cryst. D. 2012. V. 68. № 10. P. 1278.

  84. Rauschenbach S., Stadler F.L., Lunedei E., Malinowski N., Koltsov S., Costantini G., Kern K. // Small. 2006. V. 2. № 4. P. 540.

  85. Orasanu-Gourlay A., Bradley R.H. // Adsorpt. Sci. Technol. 2006. V. 24. № 2. P. 117.

  86. Peng X., Fu H., Liu R., Zhao L., Zu Y., Xu F., Liu Z. // Scanning. 2015. V. 37. № 2. P. 158.

  87. Boussaad S., Tao N.J., Arechabaleta R. // Chem. Phys. Lett. 1997. V. 280. № 3–4. P. 397.

  88. Gonzalez Arzola K., Gonzalez Orive A., Arevalo M.C., Vazquez L., Hernandez Creus A., Falcon M.A. // Int. J. Electrochem. Sci. 2012. V. 7. № 2. P. 1011.

  89. Korolkov V.V., Allen S., Roberts C.J., Gozes I., Tendler S.J.B. // Peptides. 2014. V. 62. P. 55.

  90. Ge C., Du J., Zhao L., Wang L., Liu Y., Li D., Yang Y., Zhou R., Zhao Y., Chai Z., Chen C. // PNAS. 2011. V. 108. № 41. P. 16968.

  91. Katoch J., Kim S.N., Kuang Z., Farmer B.L., Naik R.R., Tatulian S.A., Ishigami M. // Nano Lett. 2012. V. 12. № 5. P. 2342.

  92. Alava T., Mann J.A., Théodore C., Benitez J.J., Dichtel W.R., Parpia J.M., Craighead H.G. // Anal. Chem. 2013. V. 85. № 5. P. 2754.

  93. Mann J.A., Alava T., Craighead H.G., Dichtel W.R. // Angew. Chem. Int. Ed. 2013. V. 52. № 11. P. 3177.

  94. Hou B., Radadia A.D. // ACS Biomater. Sci. Eng. 2018. V. 4. № 2. P. 675.

  95. Zou X., Wei S., Jasensky J., Xiao M., Wang Q., Brooks C.L., Chen Z. // J. Am. Chem. Soc. 2017. V. 139. № 5. P. 1928.

  96. Guo J., Yao X., Ning L., Wang Q., Liu H. // RSC Adv. 2014. V. 4. № 20. P. 9953.

  97. Walsh T.R., Knecht M.R. // Bioconjugate Chem. 2019. V. 30. № 11. P. 2727.

  98. Koehler S., Schmid F., Settanni G. // Langmuir. 2015. V. 31. № 48. P. 13180.

  99. Raffaini G., Ganazzoli F. // Langmuir. 2003. V. 19. № 8. P. 3403.

  100. Raffaini G., Ganazzoli F. // J. Biomed. Mater. Res. A. 2006. V. 76. № 3. P. 638.

  101. Muecksch C., Urbassek H.M. // Langmuir. 2011. V. 27. № 21. P. 12938.

  102. Muecksch C., Urbassek H.M. // Langmuir. 2016. V. 32. № 36. P. 9156.

  103. Muecksch C., Roesch C., Mueller-Renno C., Ziegler C., Urbassek H.M. // J. Phys. Chem. C. 2015. V. 119. № 22. P. 12496.

  104. Raffaini G., Ganazzoli F. // Langmuir. 2004. V. 20. № 8. P. 3371.

  105. Martinez-Martin D., Longuinhos R., Izquierdo J.G., Marele A., Alexandre S.S., Jaafar M., Gomez-Rodriguez J.M., Banares L., Soler J.M., Gomez-Herrero J. // Carbon. 2013. V. 61. P. 33.

  106. Li Z., Wang Y., Kozbial A., Shenoy G., Zhou F., McGinley R., Ireland P., Morganstein B., Kunkel A., Surwade S.P. // Nat. Mater. 2013. V. 12. № 10. P. 925.

  107. Kozbial A., Li Z., Sun J., Gong X., Zhou F., Wang Y., Xu H., Liu H., Li L. // Carbon. 2014. V. 74. P. 218.

  108. Temiryazev A., Frolov A., Temiryazeva M. // Carbon. 2019. V. 143. P. 30.

  109. Seibert S., Klassen S., Latus A., Bechstein R., Kühnle A. // Langmuir. 2020. V. 36. № 27. P. 7789.

  110. Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. // AIP Conf. Proc. 2003. V. 696. P. 452.

  111. Klinov D.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V. // Phys. Low-Dimens. Struct. 2003. V. 3–4. P. 119.

  112. Klinov D.V., Martynkina L.P., Yurchenko V.Yu., Demin V.V., Streltsov S.A., Gerasimov Yu.A., Vengerov Yu.Yu. // Russ. J. Bioorgan. Chem. 2003. V. 29. № 4. P. 363.

  113. Groszek A.J. // Proc. Roy. Soc. London A. 1970. V. 314. № 1519. P. 473.

  114. Medina S., Benitez J.J., Castro M.A., Cerrillos C., Millan C., Alba M.D. // Thin Solid Films. 2013. V. 539. P. 194.

  115. Silly F. // Nanotechnology. 2012. V. 23. № 22. P. 225603.

  116. Yang T., Berber S., Liu J.-F., Miller G.P., Tomanek D. // J. Chem. Phys. 2008. V. 128. № 12. P. 124709.

  117. Krukowski P., Klusek Z., Olejniczak W., Klepaczko R., Puchalski M., Dabrowski P., Kowalczyk P.J., Gwozdzinski K. // Appl. Surf. Sci. 2009. V. 255. № 21. P. 8769.

  118. Prokhorov V.V., Klinov D.V., Chinarev A.A., Tuzikov A.B., Gorokhova I.V., Bovin N.V. // Langmuir. 2011. V. 27. № 10. P. 5879.

  119. Hiasa T., Onishi H. // Langmuir. 2013. V. 29. № 19. P. 5801.

  120. De Cat I., Gobbo C., Van Averbeke B., Lazzaroni R., De Feyter S., van Esch J. // J. Am. Chem. Soc. 2011. V. 133. № 51. P. 20942.

  121. Dickerson P.N., Hibberd A.M., Oncel N., Bernasek S.L. // Langmuir. 2010. V. 26. № 23. P. 18155.

  122. den Boer D., Habets T., Coenen M.J.J., van der Maas M., Peters T.P.J., Crossley M.J., Khoury T., Rowan A.E., Nolte R.J.M., Speller S., Elemans J.A.A.W. // Langmuir. 2011. V. 27. № 6. P. 2644.

  123. Arrigoni C., Schull G., Bleger D., Douillard L., Fiorini-Debuisschert C., Mathevet F., Kreher D., Attias A.-J., Charra F. // J. Phys. Chem. Lett. 2010. V. 1. № 1. P. 190.

  124. Dubrovin E.V., Gerritsen J.W., Zivkovic J., Yaminsky I.V., Speller S. // Colloid Surf. B. 2010. V. 76. № 1. P. 63.

  125. Adamcik J., Tobenas S., Di Santo G., Klinov D., Dietler G. // Langmuir. 2009. V. 25. № 5. P. 3159.

  126. Dubrovin E.V., Speller S., Yaminsky I.V. // Langmuir. 2014. V. 30. № 51. P. 15423.

  127. Dubrovin E.V., Schächtele M., Schäffer T.E. // RSC Adv. 2016. V. 6. № 83. P. 79584.

  128. Podesta A., Indrieri M., Brogioli D., Manning G.S., Milani P., Guerra R., Finzi L., Dunlap D. // Biophys. J. 2005. V. 89. № 4. P. 2558.

  129. Strick T.R., Allemand J.F., Bensimon D., Bensimon A., Croquette V. // Science. 1996. V. 271. № 5257. P. 1835.

  130. Strick T.R., Allemand J.F., Bensimon D., Croquette V. // Biophys. J. 1998. V. 74. № 4. P. 2016.

  131. Cocco S., Monasson R. // Phys. Rev. Lett. 1999. V. 83. № 24. P. 5178.

  132. Dubrovin E.V., Schächtele M., Klinov D.V., Schäffer T.E. // Langmuir. 2017. V. 33. № 38. P. 10027.

  133. Klinov D.V., Protopopova A.D., Andrianov D.S., Litvinov R.I., Weisel J.W. // Colloids Surf B. 2020. V. 196. P. 111321.

  134. Adamcik J., Klinov D.V., Witz G., Sekatskii S.K., Dietler G. // FEBS Lett. 2006. V. 580. № 24. P. 5671.

  135. Klinov D.V., Neretina T.V., Prokhorov V.V., Dobrynina T.V., Aldarov K.G., Demin V.V. // Biochemistry (Moscow). 2009. V. 74. № 10. P. 1150.

  136. Rechendorff K., Witz G., Adamcik J., Dietler G. // J. Chem. Phys. 2009. V. 131. № 9. P. 095103.

  137. Frolov A.V., Barinov N.A., Klinov D.V., Koledov V.V., Lega P.V., Orlov A.P., Smolovich A.M. // J. Commun. Technol. Electron. 2018. V. 63. № 10. P. 1226.

  138. Prokhorov V.V., Barinov N.A., Prusakov K.A., Dubrovin E.V., Frank-Kamenetskii M.D., Klinov D.V. // Nano-Micro Lett. 2021. V. 13.

  139. Sekridova A.V., Varizhuk A.M., Tatarinova O.N., Severov V.V., Barinov N.A., Smirnov I.P., Lazarev V.N., Klinov D.V., Pozmogova G.E. // Biochem. Moscow Suppl. B. 2017. V. 11. № 1. P. 62.

  140. Varizhuk A.M., Protopopova A.D., Tsvetkov V.B., Barinov N.A., Podgorsky V.V., Tankevich M.V., Vlasenok M.A., Severov V.V., Smirnov I.P., Dubrovin E.V., Klinov D.V., Pozmogova G.E. // Nucleic Acids Res. 2018. V. 46. № 17. P. 8978.

  141. Protopopova A.D., Tsvetkov V.B., Varizhuk A.M., Barinov N.A., Podgorsky V.V., Klinov D.V., Pozmogova G.E. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2018. V. 20. № 5. P. 3543.

  142. Brylev V.A., Ustinov A.V., Tsvetkov V.B., Barinov N.A., Aparin I.O., Sapozhnikova K.A., Berlina Y.Y., Kokin E.A., Klinov D.V., Zatsepin T.S., Korshun V.A. // Langmuir. 2020. V. 36. № 49. P. 15119.

  143. Vologodskii A., D. Frank-Kamenetskii M. // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41. № 14. P. 6785.

  144. Protopopova A.D., Barinov N.A., Zavyalova E.G., Kopylov A.M., Sergienko V.I., Klinov D.V. // J. Thromb. Haemost. 2015. V. 13. № 4. P. 570.

  145. Protopopova A.D., Litvinov R., Galanakis D.K., Nagaswami C., Barinov N.A., Mukhitov A.R., Klinov D.V., Weisel J. // Nanoscale. 2017. V. 9. P. 13707.

  146. Barinov N.A., Protopopova A.D., Dubrovin E.V., Klinov D.V. // Colloids Surf. B. 2018. V. 167. P. 370.

  147. Barinov N.A., Vlasova I.I., Sokolov A.V., Kostevich V.A., Dubrovin E.V., Klinov D.V. // Biochim. Biophys. Acta, General Subjects. 2018. V. 1862. № 12. P. 2862.

  148. Protopopova A.D., Ramirez A., Klinov D.V., Litvinov R.I., Weisel J.W. // J. Thrombosis Haemostasis. 2019. V. 17. № 5. P. 737.

  149. Dubrovin E.V., Klinov D.V., Schäffer T.E. // Colloids Surf. B. 2020. V. 193. P. 111077.

  150. Rose A.S., Bradley A.R., Valasatava Y., Duarte J.M., Prlić A., Rose P.W. // Bioinformatics. 2018. V. 34. P. 3755.

  151. Kollman J.M., Pandi L., Sawaya M.R., Riley M., Doolittle R.F. // Biochemistry. 2009. V. 48. № 18. P. 3877.

  152. Quist A., Bjorck L., Reimann C., Oscarsson S., Sundqvist B. // Surf. Sci. 1995. V. 325. № 1–2. P. L406.

  153. Jachimska B., Tokarczyk K., Lapczynska M., Puciul-Malinowska A., Zapotoczny S. // Colloid Surf. A. 2016. V. 489. P. 163.

  154. Dubrovin E.V., Dadinova L.A., Petoukhov M.V., Soshinskaya E.Yu., Mozhaev A.A., Klinov D.V., Schäffer T.E., Shtykova E.V., Batishchev O.V. // J. Mol. Biol. 2021. V. 433. P.166930.

  155. Ovodova R.G., Popov S.V., Bushneva O.A., Golovchenko V.V., Chizhov A.O., Klinov D.V., Ovodov Yu.S. // Biochemistry (Moscow). 2006. V. 71. P. 538.

  156. Barinov N.A., Tolstova A.P., Bersenev E.A., Ivanov D.A., Dubrovin E.V., Klinov D.V. // Colloids Surf. B. 2021. V. 206. 111921.

  157. Nakanishi K., Sakiyama T., Imamura K. // J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 91. № 3. P. 233.

  158. Roach P., Farrar D., Perry C.C. // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. № 22. P. 8168.

  159. Blaszykowski C., Sheikh S., Thompson M. // Trends Biotechnol. 2014. V. 32. № 2. P. 61.

Дополнительные материалы отсутствуют.