1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Водные ресурсы
  4. T. 47, № 3, 2020

Водные ресурсы, 2020, T. 47, № 3, стр. 330-335

Сравнительный анализ биомаркеров печени морского ерша Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 из Севастопольских акваторий (Черное море) с разным уровнем загрязнения

И. И. Чеснокова a, Т. Б. Сигачева a, *, Е. Н. Скуратовская a

a ФИЦ “Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского РАН”
299011 Севастополь, Россия

* E-mail: mtk.fam@mail.ru

Поступила в редакцию 11.09.2019
После доработки 11.09.2019
Принята к публикации 24.12.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведен сравнительный анализ некоторых биохимических показателей печени морского ерша Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 из акваторий г. Севастополя (Черное море) с разным уровнем комплексного загрязнения. Установлено достоверное увеличение содержания продуктов окислительной модификации белков, перекисного окисления липидов и активности аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в печени ершей из более загрязненных акваторий (Стрелецкая и Александровская) по сравнению с аналогичными показателями рыб из бух. Казачьей. Рассмотрены причины выявленных отличий и информативность исследованных биомаркеров для оценки качества морских прибрежных акваторий.

Ключевые слова: морской ерш, печень, комплексное загрязнение, окислительный стресс, биомаркеры, Черное море.

ВВЕДЕНИЕ

Среди наиболее актуальных природоохранных проблем Черноморского региона выделяют нормирование потоков поступления загрязняющих веществ в морскую среду [4] и разработку системы оценки качества морских прибрежных акваторий [14]. Современные антропогенные воздействия на морские прибрежные экосистемы, как правило, – комплексные, и даже при контроле значительной части загрязнителей определить количественное содержание всех из них не представляется возможным. Большое разнообразие загрязняющих веществ, попадающих в морские водоемы, приводит к их взаимодействию, в ряде случаев – к возникновению новых соединений с неизвестными свойствами, а также к эффектам синергизма и антагонизма при их воздействии на гидробионтов. Кроме того, в морские акватории впадают стоки рек со всего водосборного бассейна, что вместе с трансграничным переносом токсикантов значительно усиливает антропогенную нагрузку на прибрежные районы, осложняет поиск источников их загрязнения [9]. В связи с этим наряду с традиционными физико-химическими методами исследования качества водной среды международными организациями (ЕU BEEP, MOLAR, SETAC, LIMPACs) рекомендовано применение методов биоиндикации, отражающих реакцию биоты на весь комплекс негативного влияния среды в целом.

Применение этого подхода требует подбора биоиндикаторных видов и информативных биомаркеров, позволяющих оценить степень нарушения биологических функций гидробионтов в условиях многофакторного антропогенного прессинга [14]. Для ранней биоиндикации морских акваторий рекомендовано использовать комплекс биохимических показателей, позволяющих на молекулярном уровне оценить изменения, происходящие в организме животных до появления видимых патологий, своевременно определить существующие риски, провести природоохранные мероприятия [1, 8].

Для проведения биоиндикационных исследований в акваториях г. Севастополя в качестве биоиндикаторного вида авторами был выбран морской ерш Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 и комплекс биохимических показателей – биомаркеров, рекомендованных для этих целей: прямые биомаркеры тканевого повреждения при окислительном стрессе (ОС) – уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) [15, 20] и показатели функционального состояния печени (активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы (ЩФ)) рыб [16, 18].

Цель работы – сравнительная оценка комплекса биохимических показателей печени морского ерша Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 из бухт г. Севастополя (Черное море) с разным уровнем комплексного загрязнения.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований служил морской ерш Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 (Scorpaenidae) – типичный представитель черноморской ихтиофауны. Рыб отлавливали в июне 2018 г. в трех севастопольских бухтах (Стрелецкая, n = 11; Александровская, n = 15; Казачья, n = 10) (рис. 1), грунты которых характеризуются разным уровнем загрязнения хлорорганическими соединениями (ХОС) [7], нефтяными углеводородами (НУ) и хлороформ-экстрагируемыми веществами (ХЭВ) [10, 11, 13].

Рис. 1.

Картосхема территории расположения районов отбора рыб. Бухты: 1 – Казачья, 2 – Стрелецкая, 3 – Александровская.

По данным Л.В. Малаховой с соавторами [2018], наиболее загрязнены ХОС донные отложения бухт Стрелецкой и Александровской, тогда как в грунтах бух. Казачьей эти соединения присутствовали в более низких концентрациях [7]. Среднее содержание ΣПХБ6 в донных отложениях бухт Стрелецкой и Александровской составило 100 и 110 (нг г–1 на сухую массу) соответственно, а концентрация ΣДДТ – 51 и 35 (нг г–1 на сухую массу) [7]. Распределение НУ и ХЭВ в грунтах районов отбора проб соответствовало таковому для ХОС. Максимальное содержание НУ и ХЭВ отмечено в донных отложениях бухт Стрелецкой (105 и 200 (мг 100 г–1 возд.-сух. д. о.)) [13] и Александровской (94 и 270 (мг 100 г–1 возд.-сух. д. о.)) [10], тогда как в грунтах бух. Казачьей концентрация НУ и ХЭВ составила 23.4 и 60 (мг 100 г–1 возд.-сух. д. о.) соответственно [11].

Исследования проводили на нерестящихся самках морского ерша доминантной возрастной группы (4–5 лет).

Материалом для биохимических исследований служила печень рыб. Печень несколько раз промывали холодным 0.85% физраствором, гомогенизировали и центрифугировали (10 000g) 15 мин на холоде. Для дальнейшего анализа использовали супернатант.

В супернатантах определяли содержание окисленных форм белков (опт. ед/мг белка) по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином. Образовавшиеся в результате реакции производные 2,4-динитрофенилгидразона регистрировали при следующих длинах волн (λ): альдегидные и кетонные продукты нейтрального характера при 356 и 370 нм соответственно, альдегидные и кетонные продукты основного характера при 430 и 530 нм [3].

Содержание ТБК-активных продуктов (нмоль ТБК/мг белка) регистрировали по реакции с тиобарбитуровой кислотой [12].

Активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) (мкмоль/(ч мг белка)), аланинаминотрансферазы (АЛТ) (мкмоль/(ч мг белка)) и щелочной фосфатазы (ЩФ) (нмоль/(с мг белка)) определяли с использованием стандартных наборов реактивов “ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ” (Россия).

Все определения проводили на спектрофотометре “СФ-2000” (ОКБ “Спектр”, г. Санкт-Петербург, Россия). Биохимические показатели пересчитывали на 1 мг белка сырой массы ткани, концентрацию которого определяли с использованием стандартного набора реагентов “ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ” (Россия).

Результаты обрабатывали статистически, вычисляли среднее арифметическое и стандартную ошибку средней. Достоверность различий между выборками оценивали с применением U-критерия Манна–Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р ≤ 0.05. Статистический анализ проводили с использованием компьютерных программ Past 3 и Microsoft Office Excel 2016.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Содержание окисленных форм белков и вторичных продуктов ПОЛ – ТБК-активных продуктов в печени морского ерша из севастопольских акваторий с разным уровнем комплексного загрязнения представлено в табл. 1.

Таблица 1.  

Содержание окисленных форм белков и ТБК-активных продуктов в печени морского ерша Scorpaena porcus из севастопольских акваторий с разным уровнем загрязнения

Бухты Продукты нейтрального характера, опт. ед/мг белка Продукты основного характера, опт. ед/мг белка ТБК,
нмоль ТБК/мг белка
альдегидные 356 нм кетонные
370 нм 		альдегидные 430 нм кетонные
530 нм
Александровская 0.099 ± 0.016 0.120 ± 0.018 0.066 ± 0.012 0.025 ± 0.006 9.28 ± 1.3
Стрелецкая 0.067 ± 0.017 0.082 ± 0.016 0.038 ± 0.010* 0.019 ± 0.004 13.43 ± 3.02
Казачья 0.027 ± 0.004*, ** 0.042 ± 0.005*, ** 0.018 ± 0.003*, ** 0.006 ± 0.001* 5.69 ± 0.67*, **

  *  Достоверность различий между показателями печени морского ерша из бухт Александровской и др. ** То же из бухт Стрелецкой и Казачьей.

Уровень продуктов ОМБ в печени морского ерша из бухт Александровской (λ = 356, p ≤ 0.001; λ = 370, p ≤ 0.001; λ = 430, p ≤ 0.001; λ = 530, p ≤ 0.05) и Стрелецкой (λ = 356, p ≤ 0.001; λ = 370, p ≤ 0.001; λ = 430, p ≤ 0.05) был достоверно выше по сравнению с аналогичными показателями рыб из бух. Казачьей. Сравнительный анализ показателей ОМБ в печени морского ерша из бухт Стрелецкой и Александровской не показал достоверных различий, за исключением более высокого содержания альдегидопроизводных основного характера в печени рыб из последней акватории (p ≤ 0.05) (табл. 1).

Так же как и в случае с уровнем ОМБ, содержание ТБК-активных продуктов в печени морского ерша из бухт Александровской (p ≤ 0.05) и Стрелецкой (p ≤ 0.05) достоверно выше по сравнению с таковым у рыб из бух. Казачьей. Достоверных различий между значением данного показателя в печени морского ерша из бухт Стрелецкой и Александровской не установлено (табл. 1).

Показатели функционального состояния печени морского ерша из разных бухт г. Севастополя представлены в табл. 2.

Таблица 2.  

Показатели функционального состояния печени морского ерша Scorpaena porcus из севастопольских акваторий с разным уровнем загрязнения

Бухты АЛТ,
мкмоль/ч мг белка 		АСТ,
мкмоль/ч мг белка 		ЩФ,
нмоль/с мг белка
Александровская 0.53 ± 0.07 0.27 ± 0.05 781 ± 106
Стрелецкая 0.29 ± 0.06* 0.20 ± 0.05 1071 ± 207
Казачья 0.35 ± 0.10 0.05 ± 0.01*, ** 103 ± 12*, **

  * Достоверность различий между показателями печени морского ерша из бухт Александровской и др. ** То же из бухт Стрелецкой и Казачьей.

Активность АСТ в печени морского ерша из бухт Александровской и Стрелецкой (p ≤ 0.001) достоверно выше, чем у рыб из бух. Казачьей. Активность АЛТ в печени морского ерша из бух. Александровской достоверно превалировала (p ≤ 0.05) по сравнению с таковой у рыб из бух. Стрелецкой (табл. 2).

Активность ЩФ имела максимальные значения в печени ершей из бух. Стрелецкой и снижалась в ряду: бух. Стрелецкая → бух. Александровская → бух. Казачья. В печени рыб из бух. Казачьей активность ЩФ была в 10 раз ниже по сравнению с таковой у рыб из бух. Стрелецкой (p ≤ 0.001) и в 7.5 раза ниже, чем у рыб из бух. Александровской (p ≤ 0.001) (табл. 2).

Таким образом, результаты сравнительного анализа некоторых биомаркеров печени морского ерша из трех севастопольских бухт позволили установить определенные различия, которые могут быть связаны с уровнем комплексного загрязнения районов исследования.

ОБСУЖДЕНИЕ

С учетом ключевой роли активных форм кислорода (АФК) и свободно-радикальных процессов в механизмах токсичности широкого спектра загрязнителей для биоиндикациионной оценки качества водной среды рекомендовано применение показателей ОС. Уровень ОС определяется буферной емкостью антиоксидантной (АО) защитной системы, обезвреживающей АФК, и интенсивностью свободнорадикальных процессов. Универсальный показатель ОС при действии отдельных токсикантов и комплексном загрязнении акваторий – увеличение в тканях гидробионтов содержания продуктов ПОЛ и ОМБ [15, 17]. В настоящей работе содержание продуктов ПОЛ и ОМБ достоверно выше в печени рыб из акваторий с более высоким уровнем загрязнения ХОС, НУ и ХЭВ (Стрелецкая, Александровская) по сравнению с аналогичными показателями рыб из бух. Казачьей (табл. 1). Выявленные различия свидетельствуют о влиянии комплексного загрязнения бухт Стрелецкой и Александровской на показатели прооксидантно-антиоксидантной системы печени рыб и о смещении реакций в сторону процессов свободно-радикального окисления (СРО) белков и липидов.

Другие важнейшие биомаркеры, характеризующие функциональное состояние печени рыб, – ферменты аминотрансферазы, выполняющие ключевую роль в метаболизме аминокислот и белков, а также ЩФ – фермент фосфорно-кальциевого обмена. Как известно, основные субстраты для синтеза всех протеиногенных аминокислот – пируват, оксалоацетат и α-кетолутарат [5] – продукты реакций переаминирования, катализируемых аминотрансферазами. Анализ аминотрансферазной активности в печени ершей из трех севастопольских акваторий позволил установить увеличение активности АСТ у особей из более загрязненных бухт Стрелецкой и Александровской по сравнению с таковой в печени рыб из бух. Казачьей (табл. 2). Выявленные особенности на фоне высокого содержания продуктов ОС в тканях рыб из бухт Стрелецкой и Александровской (табл. 1), вероятно, обусловлены компенсаторной перестройкой белкового метаболизма, направленной на увеличение субстратного обеспечения реакций глюконеогенеза и синтеза аминокислот в печени ершей из районов с высоким уровнем комплексного загрязнения. В [18] установлено увеличение активности аминотрансфераз, содержания окисленных форм белков и пирувата и снижение концентрации лактата в печени кумжи Salmo trutta и хариуса Thymallus thymallus при действии хлорамина. Результаты исследований авторы [18] объяснили значительной ролью аминотрансфераз и лактат-пируватной конверсии в образовании пирувата для энергообеспечения синтетических процессов в гепатоцитах при действии хлорамина [18]. Увеличение активности АСТ и АЛТ в печени радужной форели (Oncorhynchus mykiss) было также показано при вирусной инфекции IPNV [2].

В то же время активность АЛТ достоверно выше в печени рыб из бух. Александровской по сравнению с аналогичными показателями рыб из бух. Стрелецкой (табл. 2), а содержание продуктов ПОЛ и ОМБ в их тканях имело неоднозначный характер (табл. 1). Уровень ТБК-активных продуктов в печени рыб из этих акваторий не показал достоверных различий, но был выше у рыб из бух. Стрелецкой. Содержание окисленных форм белков при всех длинах волн было выше в печени рыб из бух. Александровской, однако достоверные изменения установлены только для альдегидопроизводных основного характера. Согласно данным [2], активность АЛТ в печени радужной форели увеличивалась в большей степени, чем активность АСТ с 5-го по 22-й день после инфицирования рыб вирусом IPNV, что авторы объяснили разной локализацией ферментов в клетке. При повреждении гепатоцитов АЛТ поступает, в первую очередь, в кровяное русло, инициируя компенсаторное увеличение активности этого фермента в печени [2]. Таким образом, увеличение активности АЛТ и содержания альдегидопроизводных основного характера в печени морского ерша из бух. Александровской по сравнению с соответствующими показателями ершей из близкой по уровню комплексного загрязнения бух. Стрелецкой, вероятно, может свидетельствовать о менее экологически благополучном состоянии первой акватории.

Как и активность АСТ, активность ЩФ в печени ерша из бухт Стрелецкой и Александровской была достоверно выше по сравнению с таковой у рыб из бух. Казачьей (табл. 2). При важной роли ферментов фосфорно-кальциевого обмена (ЩФ) в процессах созревания гонад и роста гидробионтов [21] выявленная особенность может свидетельствовать о компенсаторном увеличении активности ЩФ в печени нерестящихся самок морского ерша из наиболее загрязненных акваторий (бухты Александровская, Стрелецкая). Компенсаторное увеличение активности ЩФ в печени тиляпии (Tilapia guinensis) было также показано при действии тяжелых металлов (Pb 2.65 мг/л, Fe 0.85 мг/л) [19].

ВЫВОДЫ

Сравнительный анализ комплекса биохимических показателей печени морского ерша из тестируемых акваторий г. Севастополя позволил выявить определенные отличия и характеризовать экологическое состояние районов исследования. Достоверное увеличение содержания продуктов ОМБ, ПОЛ и активности аминотрансфераз и ЩФ в печени ершей из более загрязненных акваторий – бухт Стрелецкой и Александровской по сравнению с аналогичными показателями рыб из бух. Казачьей свидетельствует об окислительном повреждении гепатоцитов, перестройке белкового метаболизма и менее экологически благоприятном состоянии первых двух акваторий. Установленное авторами ранее отсутствие достоверных различий между размерно-массовыми характеристиками морского ерша из трех тестируемых акваторий [6] свидетельствует об устойчивости данного вида к наблюдаемой степени комплексного загрязнения бухт Стрелецкой и Александровской в результате перестройки биохимических процессов.

Вышеперечисленные биомаркеры печени морского ерша информативны для оценки качества морских прибрежных акваторий и могут быть использованы при проведении биоиндикационных исследований на всем побережье Черного моря и в других водоемах естественного обитания данного вида.

Список литературы

  1. Высоцкая Р.У., Немова Н.Н. Лизосомальные ферменты у рыб. М.: Наука, 2008. 282 с.

  2. Драган Л.П., Майстренко М.И., Любченко А.А., Рудь Ю.П., Бучацкий Л.П. Активность аминотрансфераз в печени радужной форели (Oncorhynchus mykiss) под влиянием вирусной инфекции // Рибогосподарська Наука України. 2015. № 3 (33). С. 99–106.

  3. Дубинина Е.Е., Бурмистов С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы мед. химии. 1995. № 1. С. 24–26.

  4. Егоров В.Н. Нормирование потоков антропогенного загрязнения черноморских регионов по биогеохимическим критериям // Экология моря. 2001. Вып. 57. С. 75–84.

  5. Кондрашова М.Н. Взаимодействие процессов переаминирования и окисления карбоновых кислот при разных функциональных состояниях ткани // Биохимия. 1991. Т. 56. Вып. 3. С. 388–403.

  6. Куцын Д.Н., Скуратовская Е.Н., Чеснокова И.И. Возраст и рост морского ерша Scorpaena porcus (Scorpaenidae) Черного моря в условиях антропогенного пресса // Вопросы ихтиологии. 2019. Т. 59. № 3. С. 292–299.

  7. Малахова Л.В., Скуратовская Е.Н., Малахова Т.В., Болтачев А.Р., Лобко В.В. Хлорорганические соединения в ерше Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 в акватории Cевастополя (Черное море): пространственное распределение и биологический отклик на уровень накопления загрязнителей // Морской биол. журнал. 2018. Т. 3. № 4. С. 51–63.

  8. Немова Н.Н., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука, 2004. 214 с.

  9. Руднева И.И. Использование биомаркеров рыб для оценки экологического состояния морских акваторий // Наук. зап. Тернопольский нац. пед. ун-ту. Сер. Біол. 2013. № 2 (55). С. 68–73.

  10. Санитарно-биологические исследования прибрежных акваторий юго-западного Крыма в начале ХХI века / Под ред. О.Г. Миронова, С.В. Алёмова. Симферополь: ИТ “АРИАЛ”, 2018. 276 с.

  11. Соловьева О.В., Тихонова Е.А., Вотинова Т.В. Органические вещества донных отложений в условиях урбанизации побережья (на примере бухты Казачьей, Черное море) // Океанология. 2019. Т. 59. № 2. С. 234–242.

  12. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 66–68.

  13. Тихонова Е.А., Котельянец Е.А., Волков Е.Г. Характеристика загрязнения донных отложений прибрежной акватории Севастополя на примере Стрелецкой бухты (Черное море) // Экологическая безопасность прибрежной и шельфовой зон моря. 2018. № 1. С. 74–80.

  14. Экотоксикологичесие исследования прибрежной черноморской ихтиофауны в районе Севастополя / Под ред. И.И. Рудневой. М.: ГЕОС, 2016. 360 с.

  15. de Moura F.R., Brentegani K.R., Gemelli A., Sinhorin A.P., Sinhorin V.D.G. Oxidative stress in the hybrid fish jundiara (Leiarius marmoratus × Pseudoplatystoma reticulatum) exposed to Roundup Original // Chemosph. 2017. V. 185. P. 445–451.

  16. Recabarren-Villalón T., Ronda A.C., Arias A.H. Polycyclic aromatic hydrocarbons levels and potential biomarkers in a native South American marine fish // Reg. Studies in Marine Sci. 2019. V. 29. P. 1–11.

  17. Stoliar O.B., Lushchak V.I. Environmental Pollution and Oxidative Stress in Fish. In Oxidative Stress – Environmental Induction and Dietary Antioxidants / Ed. V. Lushchak. 2012. P. 131–166. https://doi.org/10.5772/38094

  18. Tkachenko H., Kurhaluk N., Grudniewska J. Effects of chloramine-T exposure on oxidative stress biomarkers and liver biochemistry of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), brown trout, Salmo trutta (L.), and grayling, Thymallus thymallus (L.) // Arch. Pol. Fish. 2013. V. 21. P. 41–51.

  19. Udotong J.I.R. Assessment of Diagnostic Enzymes as Indices of Heavy Metal Pollution in Tilapia Fish // World Acad. Sci. Engineering Technol. Int. J. Biotechnol. Bioengineering. 2015. V. 9. № 6. P. 670–674.

  20. van der Oost R., Beyer J., Vermeulen N.P.E. Fish Bioaccumulation and Biomarkers in Environmental Risk assessment: a Review // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2003. V. 13. Is. 2. P. 57–149.

  21. Zikic R.V., Stajn S., Pavlovic Z., Ognjanovic B.I., Saicic Z.S. Activities of superoxide dismutase and catalase in erythrocytes and plasma transaminases of goldfish (Carassius auratus gibelio Bloch.) exposed to cadmium // Physiol. Res. 2001. V. 50 (1). P. 105–111.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Водные ресурсы

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал