Химия высоких энергий, 2020, T. 54, № 5, стр. 399-404

Радиолитическая инактивация Cochlodinium polykrikoides и Alexandrium catenella при низких поглощенных дозах

Ю. Ким a, А. В. Пономарев b*

a EB Tech Co., Ltd. 170-9, Techno 2-ro Yuseong-gu Daejeon
34028 Republic of Korea

b Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской Академии наук
119071 Москва, Ленинский просп., 31, стр. 4, Россия

* E-mail: ponomarev@ipc.rssi.ru

Поступила в редакцию 26.03.2020
После доработки 26.03.2020
Принята к публикации 20.04.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследовано воздействие электронного пучка на токсичные микроводоросли Cochlodinium polykrikoides и Alexandrium catenella, участвующие в явлении цветения морской воды, известном как красные приливы. Это ежегодное бедствие вызывает массовую интоксикацию и гибель морских обитателей. Облучение электронным пучком при поглощенной дозе до 1 кГр приводит к инактивации свыше 2/3 популяции микроводорослей за счет нарушения целостности клеточных стенок, повреждения хлоропластов и агрегации клеток. Радиолиз разрушает паралитические токсины, включая наиболее опасные из них. Благодаря низким дозам и простоте облучения, электронно-лучевая обработка воды может стать перспективным методом инактивации и детоксикации фитопланктона, участвующего в красных приливах.

Ключевые слова: электронный пучок, Cochlodinium polykrikoides, Alexandrium catenella, инактивация, детоксикация, хлорофилл-а

Явления, известные как “эвтрофикация” (насыщение водоeма биогенными элементами, сопровождающееся ростом его биологической продуктивности) и “красные приливы” (цветение морской воды) относятся к глобальным причинам массовой гибели морских рыб и животных [13]. Эти сезонные явления возникают во всем мире, и их значимость стремительно растет по мере урбанизации и глобального потепления. Несбалансированная эвтрофикация провоцирует бурное развитие фитопланктона и появление в воде цианобактерий, выделяющих токсины, способные вызывать отравление живых организмов. Потребление человеком морепродуктов, отравленных этими токсинами, приводит даже к летальному исходу. Избыточные скопления микроводорослей при красных приливах препятствуют проникновению солнечных лучей вглубь воды и, как следствие, ослабляет фотосинтез у донных растений, а значит и выработку кислорода. Каждый раз эти явления приносят колоссальные убытки рыбным хозяйствам [4, 5].

В мире были разработаны и опробованы различные методы [3], позволяющие ограничивать распространение красных приливов, включая флотационные, реагентные, ультразвуковые, СВЧ, фильтрационные, плазмохимические и др. Эти методы дают возможность частичного управления либо фитопланктоном, либо вторичными загрязнениями, но не предоставляют возможности для простого и удобного решения комплекса возникающих проблем. Настоящая работа посвящена исследованию влияния низкой дозы ионизирующего излучения на развитие и свойства микроводорослей, участвующих в явлении красных приливов в Тихоокеанском бассейне.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микроводоросли и их инкубация

Исследовали две разновидности микроводорослей, наносящих в последние годы наибольший ущерб рыбоводческим хозяйствам на южном побережье Республики Корея и на Дальнем Востоке России: Cochlodinium polykrikoides и Alexandrium catenella [4]. Эти микроводоросли обусловливают отравление рыбы и моллюсков нейротоксинами, главным образом сакситоксином, ответственным за паралитическое отравление морских животных и людей [6, 7]. Образцы водорослей были собраны в период красных приливов и далее выращивались в лабораторных условиях в Национальном институте исследований и разработок в области рыбного хозяйства Республики Корея. Культуральную среду готовили на морской воде с двойной фильтрацией. В экспериментах использовали Cochlodinium polykrikoides в среде f/2-Si и Alexandrium catenella в среде SWII [8, 9]. Чтобы обеспечить корректность сравнений, микроводоросли после облучения культивировались в тех же условиях, что и исходные.

Облучение

Радиолиз осуществляли с помощью ускорителя ЭЛВ в EB Tech Co., Ltd. пучком электронов с энергией 2.5 МэВ при токе пучка от 2.0 до 13.0 мА и скорости раствора 1.2 дм3/мин. Схема установки для облучения воды в струйном режиме представлена на рис. 1. Для дозиметрии использовали пленки сополимера с феназиновым красителем СО ПД(Ф)Р-5/50 (ГСО 7865-2000) [10].

Рис. 1.

Схема лабораторной установки для облучения морской воды в струйном режиме.

Тестирование инактивации и детоксикации микроводорослей

Радикалы, генерируемые в воде под действием ионизирующего излучения, реагируют с материалом клеточных стенок, что может вызывать разрушение стенок и гибель микроводорослей [11]. Радиолитическое повреждение клеток нередко изменяет кинетику роста и гибели микроводорослей, а также провоцирует выделение внутриклеточного вещества в воду. Исходные образцы содержали 5000–7000 особей микроводорослей в см3 воды. Показателями гибели клеток служит уменьшение их количества и нарушение фотосинтеза из-за разрушения хлоропластов [12]. В работе регистрировалось изменение концентрации хлорофилла-а с помощью флуоресцентной спектрометрии. За морфологическими изменениями микроводорослей вследствие облучения следили с помощью просвечивающего электронного микроскопа (модель JEM-1010). Токсины, порождаемые фитопланктоном, легко сорбируются жабрами рыб, вызывая удушение последних [7, 13]. Вместе с потребляемыми рыбой и молюсками, биотоксины могут попадать в человека и вызывать его отравление. В процессе культивирования облученных микроводорослей следили за изменением рН, динамики их гибели, содержанием хлорофилла-а, токсинов, растворимого белка, растворимых углеводов и показателя общего химического потребления кислорода растворенными продуктами (ХПКр) [14, 15]. Для анализа растворимых карбогидратов и протеинов использовали методы Антрона (Anthron) и Лоури (Lowery), соответственно [14, 15].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Физико-химические показатели

Рисунок 2 демонстрирует изменение показателей рН, щелочности и содержания растворенных соединений в образцах Cochlodinium polykrikoides и Alexandrium catenella, обусловленное ростом поглощенной дозы. Наблюдается снижение рН с 8.0 до 7.6 и щелочности со 105 до 75 мг/дм3, что может быть обусловлено, с одной стороны, небольшим радиолитическим подкислением воды [10], а с другой стороны, радиолитическим разрушением фитопланктона с выделением кислотных компонентов цитоплазмы. Метаболиты в клетках водорослей представлены в основном углеводами и белками. Показатель ХПКр является наглядной характеристикой выделения растворимой фракции этих веществ в воду. Так по мере роста поглощенной дозы до 0.3 кГр, ХПКр в растворе Сochlodinium polykrikoides увеличивается в 1.47 раз, а в растворе Alexandrium catenella – в 1.96 раз. В свою очередь при дозе 1 кГр значения ХПКр в этих растворах в 1.72 и 3.16 раз выше, чем в соответствующих необлученных образцах.

Рис. 2.

Изменение щелочности, химического потребления кислорода растворенными соединениями (ХПКр), содержания растворенных белков и углеводов в зависимости от поглощенной дозы.

Изменение жизнеспособности микроводорослей

Исходное количество особей водорослей варьируется в зависимости от их природы и условий выращивания. Однако общие закономерности влияния облучения на гибель микроводорослей поддаются надежной оценке посредством камеры Седжвика−Рафтера (рис. 3а). В образцах Cochlo-dinium polykrikoides смертность популяции составила в среднем 53.2% при дозе 0.3 кГр и 79.0% при дозе 1 кГр. В этих же условиях смертность популяции Alexandrium catenella достигала 21.2 и 82.0% соответственно. Обе исследованные разновидности микроводорослей содержат хлоропласты и, соответственно, способны к фотосинтезу. Повреждение хлоропластов и хлорофилла-а может рассматриваться как косвенный показатель гибели микроводорослей. Оценка этого показателя может быть проведена на основе измерения эффективности фотосинтеза [14, 15] посредством флуоресцентной спектроскопии (рис. 3б). Судя по концентрации хлорофилла-а, облучение при дозе 1 кГр приводит к повреждению около 86% Cochlodinium polykrikoides и около 70% Alexandrium catenella. Более того, культивирование микроводорослей, выживших после облучения, выявляет гибель еще около 60% из них в течение 24 ч, так что смертность популяции может достигать не менее 90%. По сравнению с необлученными образцами, в ходе культивирования облученных водорослей наблюдается снижение концентрации хлорофилла-а и повышение содержания растворенных белков до 3 раз. К тому же, происходит образование и осаждение агрегатов микроводорослей, как ранее наблюдалось в [11]. Несомненно, столь высокая результативность привлекает внимание к электронно-лучевой обработке как к весьма перспективному методу контроля микроводорослей, бурно размножающихся каждое лето во всех тихоокеанских прибрежных водах.

Рис. 3.

Изменение количества клеток (а) и содержания хлорофилла-а (б) в зависимости от поглощенной дозы.

Разрушение клеток

Рисунок 4а показывает, что в исходной Cochlodinium polykrikoides, органеллы располагаются в строгой последовательности и заполняют внутренность клетки. Однако в результате облучения, клеточная стенка микроводоросли повреждается и содержимое распространяется за пределы клетки (рис. 4б). Это явление хорошо согласуется с вышеуказанным изменением ХПКр (рис. 2), свидетельствующем о существенном повышении концентрации растворенных соединений в облученных образцах.

Рис. 4.

Сравнение Cochlodinium polykrikoides до (а) и после (б) воздействия облучения с дозой 1 кГр. Просвечивающая электронная микроскопия с кратностью увеличения: а – 2000, б – 2750.

В результате метаболизма и разложения, клетки высвобождают высокомолекулярные соединения, относящиеся к полисахаридам, нуклеиновым кислотам, белкам и т.д. Эти внеклеточные биополимеры играют роль коллагена, объединяющего клетки в агрегаты и увеличивающего вязкость раствора между ними. Рисунок 3 (нижняя часть) показывает изменение содержания внеклеточных биополимеров в воде вследствие облучения. Видно, что в образцах и Cochlodinium polykrikoides и Alexandrium catenella при дозе 1 кГр содержание растворенного белка возрастает почти в 2.5 раза, а углеводов – примерно в 1.5 раза. Это является еще одним подтверждением нарушения целостности клеточных стенок микроводорослей вследствие радиолиза.

Изменение токсичности

В процессе размножения Alexandrium catenella порождает спящие споры, прорастание которых происходит не сразу. В споровой форме микроводоросли могут переноситься морскими течениями, попадать в судовые балластные воды, поглощаться морскими обитателями и, таким образом распространяться по большим пространствам. Как известно, Alexandrium catenella обусловливает выработку сильнодействующих природных токсинов – сакситоксинов – паралитических ядов у моллюсков, и, соответственно, влияние облучения на Alexandrium catenella вызывает повышенный интерес. Основными токсинами, обнаруживаемыми в пробах Alexandrium catenella являются карбаматные (гониатоксины GTX 1, GTX 3, GTX 4 и NEO) и сульфокарбамоильные (С1 и C2) токсины [16, 17]. Содержание основных токсинов в облученных и необлученных пробах показано на рис. 5.

Рис. 5.

Изменение содержания основных токсинов в образце Alexandrium catenella в зависимости от поглощенной дозы.

Общее содержание токсичных соединений в исходной культуре Alexandrium catenella составляет 41.34 фмоль/клетку. В свою очередь, при поглощенной дозе 0.3 кГр их содержание уменьшается до 16.21 фмоль/клетку, т.е. на 68%. При этом, снижение концентрации непосредственно биотоксинов составляет около 50%. При поглощенной дозе 1 кГр, общее содержание токсичных продуктов снижается до 9.8 фмоль/клетку, т.е. на 76%. Содержание сакситоксина neo-STX, относящегося к наиболее токсичным, за время облучения снижается с 9.0 до 2.95 фмоль/клетку при дозе 0.3 кГр, т.е. на 67%. В свою очередь, поглощенная доза 1 кГр обеспечивает снижение содержания neo-STX на 84%, что почти на 8% выше, чем общее снижение содержания токсичных соединений. Таким образом, электронно-лучевая обработка образцов Alexandrium catenella приводит к весьма эффективному разрушению структуры паралитических ядов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено исследование радиационной стойкости двух видов микроводорослей, Cochlodinium polykrikoides и Alexandrium catenella, участвующих в красных приливах и типичных для прибрежных вод Республики Корея и Дальнего востока России. С целью моделирования практических методов контроля быстрорастущих токсичных микроводорослей в морской воде, в исследованиях использовался промышленный ускоритель, пригодный для крупномасштабного облучения больших расходов воды. Различными методами была выявлена пригодность малых поглощенных доз (до 1 кГр) вызывать повреждения у 86% особей и приводить к гибели почти 80% популяции микроводорослей. Методом просвечивающей микроскопии на примере представителей Cochlodinium polykrikoides показано разрушение клеточных стенок микроводоросли, сопровождающееся элюированием органелл и потерей жизнеспособности клеток. При дозе 1 кГр высвобождение растворимых белков и углеводов увеличивается в 2.5 и 1.5 раза, соответственно. Важным результатом электронно-лучевой обработки микроводорослей является разрушение химической структуры паралитических токсинов с эффективностью детоксикации около 84% при поглощенной дозе 1 кГр.

Электронно-лучевая обработка воды может быть реализована в крупнотоннажном режиме с пропускной способностью 200 000 м3 в сутки и даже более [18]. С учетом низкой дозы, необходимой для подавления жизнедеятельности микроводорослей, электронно-лучевая обработка выглядит весьма перспективным методом регулирования численности токсичного фитопланктона в прибрежных водах.

Список литературы

  1. Chislock M.F., Doster E., Zitomer R.A., Wilson A.E. // Nature Education Knowledge. 2013. T. 4. № 4. C. 10.

  2. Matthijs H. C. P., Jan$\mathop c\limits^ \vee $ula D., Visser P.M., Mar$\mathop s\limits^ \vee $álek B. // Aquat. Ecol. 2016. T. 50. C. 443.

  3. Stroom J., Kardinaal W.E.A. // Aquat. Ecol. 2016. T. 50. C. 541.

  4. Anton A., Teoh P.L., Mohd-Shaleh S.R., Mohammad Noor N. // Harmful Algae. 2008. T. 7. № 3. C. 331.

  5. Shimizu Y. Chemistry and mechanism of action. Seafood and freshwater toxins. Ed. by L. M. Botana. New York, Marcel Dekker. 2000. C. 151.

  6. Han M.S., Jeon J.K., Kim Y.O. // J. Plankton Res., 1992. T. 14. C. 1067.

  7. Botana L.M., Hess Ph., Munday R., Nathalie A., DeGrasse S.L., Feeley M., Suzuki T., Berg van den M., Fattori V., Gamarro E. G., Tritscher A., Nakagawa R., Karunasagar I. // Trends in Food Science & Technology. 2017. T. 59. C. 15.

  8. Pachiappan P., Prasath B.B., Perumal S., Ananth S., Devi A.S., Kumar S.D., Jeyanthi S. In: Perumal S., A.R. T., Pachiappan P. (eds.) Advances in Marine and Brackishwater Aquaculture. Springer, New Delhi. 2015.

  9. Algal Culturing Techniques. 1st Edition. Andersen R.A. (ed.). Academic Press. San Diego, United States. 2005.

  10. Woods R.J., Pikaev A.K. Appled Radiation Chemistry Radiation Processing. Wiley Inter Science, 1994.

  11. Chulkov V.N., Bludenko A.V., Ponomarev A.V. // High Energy Chem. 2018. T. 52. № 5. C. 449.

  12. Luckas B., Hummert C., Oshima Y. Analytical methods for paralytic shellfish poisons. In: Manual on Harmful Marine Microalgae. Hallegraeff, G.M., D.M. Anderson and A.K. Cembella (eds.), Intergovernmental Oceanigraphic Commission, UNESCO, France., 2003. C. 191.

  13. Sekiguchi K., Sato S., Kaga S., Ogata T., Kodama M. // Fisheries science. 2001. T. 67. C. 301.

  14. Plummer M., Plummer D.T. An Introduction to Practical Biochemistry, Tata McGraw Hill Publishing Company, N.Y. 2001.

  15. Waterborg J.H. The Lowry Method for Protein Quantitation. In: Walker J.M. (eds.) The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. Humana Press, Totowa, N.J. 2009.

  16. Pearson L., Mihali T., Moffitt M., Kellmann R., Neilan B. // Mar. Drugs. 2010. T. 8. C. 1650.

  17. Daranas A.H., Norte M., Fernández J.J. // Toxicon. 2001. T. 39. № 8. C. 1101.

  18. Ponomarev A.V. // Radiat. Phys. Chem. 2020. T. 172. C. 108812.

Дополнительные материалы отсутствуют.