Химия высоких энергий, 2021, T. 55, № 2, стр. 155-165

ВВЕДЕНИЕ

Лучевая терапия является одним из основных методов лечения онкологических заболеваний. Однако некоторые виды новообразований, обладающие пониженным парциальным давлением кислорода, то есть развивающиеся в условиях аноксии или гипоксии из-за особенностей своего метаболизма, морфологии или бурного роста, имеют низкую радиобиологическую чувствительность в отношении ионизирующих излучений [1]. Более того, такие опухоли, как правило, устойчивы и к химиотерапевтическим препаратам, что сильно ограничивает возможности лечения пациентов с гипоксическими новообразованиями. Применяющиеся в клинической практике радиосенсибилизаторы обладают высокой токсичностью, в частности, поражают периферическую нервную систему, почки и мочеполовую систему, вызывают аллергические реакции [2, 3]. Кроме того, механизм их радиационно-индуцированных превращений in vivo не изучен надлежащим образом.

Мы полагаем, что новые малотоксичные радиосенсибилизаторы могут быть найдены среди модифицированных физиологически активных природных соединений. Например, имидазольный цикл, присутствующий в составе используемых в клинической практике нитроазолов, присутствует также в L-гистидине. Эта протеиногенная α-аминокислота входит в состав большого количества ферментов человека, играет важную роль в метаболизме белков, в синтезе гистамина, фолиевой кислоты, нуклеиновых кислот, гемоглобина [4–6]. Потому радиосенсибилизаторы на основе нитропроизводных L-гистидина могут потенциально обладать приемлемым уровнем токсичности.

Ранее было установлено, что под действием ионизирующего излучения на различные фосфолипиды происходит элиминирование фосфатидных кислот [7, 8], которые стимулируют пролиферацию клеток [9]. Причем дефосфорилирование наиболее интенсивно происходит именно в отсутствие кислорода [8]. Мы полагаем, что радиационно-индуцированная фрагментация фосфолипидов в биомембранах гипоксических опухолей может ускорять пост-радиационную пролиферацию раковых клеток. Это может быть одной из причин низкой эффективности лучевой терапии в отношении гипоксических злокачественных новообразований.

Наиболее удобной моделью для исследования способности веществ ингибировать радиационно-индуцированные процессы фрагментации гидроксилсодержащих фосфорорганических соединений, в частности, глицерофосфолипидов, является радиолиз разбавленных водных растворов глицеро-1-фосфата [10]. Для установления механизма взаимодействия веществ с α-гидроксилсодержащими углеродцентрированными радикалами, которые играют важную роль в свободнорадикальных превращениях гидроксилсодержащих органических соединений, можно использовать радиолиз водных растворов этанола [11, 12].

В настоящей работе методом стационарного радиолиза было исследовано взаимодействие гистидина, его нитропроизводных, а также гистамина, имидазола и радиосенсибилизатора метронидазола, применяющегося при лучевой терапии онкологических заболеваний, с гидроксилсодержащими углеродцентрированными радикалами, образующимися в ходе радиационно-индуцированных превращений деаэрированных водных растворов глицеро-1-фосфата и этанола.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Структурные формулы тестируемых в работе производных имидазола (I-VI) приведены в табл. 1. Без предварительной очистки использовали коммерчески доступные глицеро-1-фосфат; KH₂PO₄, FeSO₄ ⋅ 7H₂O, (NH₄)₂MoO_4, этанол, бутандиол‑2,3, имидазол (I), L-гистидин (II), гистамина гидрохлорид (III), метронидазол (VI). Высокоочищенный ацетальдегид получали по методике [13].

Таблица 1.  

Структурные формулы используемых в работе соединений

№	Название	Структура
Ι	Имидазол
ΙΙ	Гистидин
ΙΙΙ	Гистамин
IV	[2-Амино-3-[5-нитро-1H-имидазол-4-ил]пропановая кислота
V	[2-Ацетамидо-3-[5-нитро-1H-имидазол-4-ил]пропановая кислота
VI	Метронидазол

2-Ацетамидо-3-(1Н-имидазол-4-ил)пропионовую кислоту (VII) синтезировали следующим образом. К раствору L-гистидина (II) в ледяной CH₃COOH при комнатной температуре добавляли раствор уксусного ангидрида в ледяной CH₃COOH. Реакционную смесь нагревали до 100°С и выдерживали при этой температуре 2–3 мин, после чего к смеси добавляли 150 мл воды и полученный раствор упаривали в вакууме. К остатку добавляли еще 50 мл воды и вновь упаривали в вакууме. К твердому остатку добавляли 30 мл воды, выдерживали при температуре 0–5°С в течение 48 ч, после чего продукт отфильтровывали и сушили при комнатной температуре до постоянной массы. Выход соединения (VII) составляет 82%.

К раствору 2-ацетамидо-3-(1Н-имидазол-4-ил)пропионовой кислоты (VII) в 20 мл конц. H₂SO₄ медленно (~40 мин) прикапывали HNO₃ (~90%), поддерживая температуру в диапазоне 40–45°С. Реакционную смесь перемешивали 2 ч при этой температуре, после чего охлаждали до комнатной температуры и выливали в 110 мл льда, полученный раствор нейтрализовали Na₂CO₃ до рН ~ 0.4. Образовавшийся осадок немедленно отфильтровали и промыли на фильтре охлажденной водой. После перекристаллизации из воды выход 2-ацетамидо-3-(5-нитро-1Н-имидазол-4-ил)пропионовой кислоты (V) составил 47%.

Для получения 2-амино-3-(5-нитро-1Н-имидазол-4-ил)пропионовой кислоты (IV) к соединению (V) добавляли 40 мл 2 М HCl, потом реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 2 ч. По окончании процесса реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, нейтрализовали раствором NaOH до рН ~ 5. Образовавшийся осадок отфильтровывали и сушили в вакууме при 60°С. Выход 2-амино-3-(5-нитро-1Н-имидазол-4-ил)пропионовой кислоты (IV) составил 49%.

Перед использованием подлинность и чистоту синтезированных веществ подтверждали с использованием хромато-масс-спектрометрии, элементного анализа и ЯМР.

Для радиационно-химического эксперимента использовали деионизированную воду I типа с удельным сопротивлением не менее 15 МОм. Образцы готовили непосредственно перед облучением, для чего точные навески исследуемых соединений (I–VI) растворяли в водных растворах глицеро-1-фосфата с концентрацией 10^–3 моль/л или 10^–1 моль/л, а также водных растворах этанола с концентрацией 1 моль/л. Концентрации производных имидазола (I–VI) во всех растворах составляли 10^–3 моль/л.

Корректировку значений рН водных растворов до 7 ± 0.05 выполняли путем добавления небольших количеств хлорной кислоты или гидроксида калия. Измерение рН проводили на рН-метре Hanna HI 9321. Приготовленные растворы разливали в стеклянные ампулы, деаэрировали аргоном высокой степени очистки по методике [14], после чего запаивали.

Для инициирования радиационно-индуцированных процессов в растворах гидроксилсодержащих органических соединений использовали γ-излучение изотопа ⁶⁰Co. Облучение образцов проводили на установке MPX-γ-25М. Мощность дозы составляла 0.110 ± 0.003 Гр/с. Интервал поглощенных доз – 0.20–1.2 кГр.

Концентрацию неорганического фосфата на фоне глицеро-1-фосфата определяли с использованием реагентно-спектрофотометрической методики, описанной в работе [10]. Концентрацию производных имидазола (I–VI) в растворе измеряли на спектрофотометре Specord S600 (Analytik Jena, Германия). Анализ продуктов радиационно-индуцированных превращений этанола выполняли на газожидкостном хроматографе Shimadzu GC-17A (Япония) с капиллярной колонкой RTX-WAX аналогично [15].

Идентификацию структуры продуктов радиационно-индуцированных превращений имидазола выполняли на газожидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором Shimadzu GCMS-QP2010+ с колонкой “StabilWAX DA” (длина 30 м, внутренний диаметр – 0.25 мм, толщина неподвижной фазы – 0.25 мкм). Условия анализа: газ-носитель – гелий, линейная скорость потока в колонке – 0.365 м/с, программа термостата – нагрев с 40 до 250°С со скоростью 5°С/мин, температура инжектора – 250°С; температура ионного источника и интерфейса – 250°С. В случае гистамина, гистидина и нитропроизводных имидазола использовали жидкостной хроматограф с масс-спектрометрическим квадрупольным детектором Shimadzu LCMS‑2020 [16]. Обработка экспериментальных данных и расчет радиационно-химических выходов (G, молекула/100 эВ) подробно описаны в работе [17].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основным процессом, который происходит при радиолизе деаэрированных водных растворов глицеро-1-фосфата, а также более сложных фосфатов углеводов и гидроксилсодержащих фосфолипидов является свободнорадикальное дефосфорилирование [10]. Ключевой стадией этого процесса является распад α-гидроксилсодержащих углеродцентрированных радикалов (α-ГУР) с константой ~3.5 × × 10⁶ с^–1 [18] по реакции (3) с одновременным разрывом 2 σ-связей в β-положении по отношению к радикальному центру.

Радиационно-индуцированное дефосфорилирование происходит с высокими радиационно-химическими выходами при γ-радиолизе даже разбавленных (с концентрацией 10^–3 моль/л) деаэрированных водных растворов глицеро-1-фосфата. Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что в этих условиях 75–80% от суммарного радиационно-химического выхода окисляющих радикальных продуктов радиолиза воды G_•ОН + G_•Н конвертируется в неорганический фосфат.

(1)

(2)

(3)

Снижение радиационно-химических выходов неорганического фосфата при облучении растворов, содержащих эквимолярные концентрации глицеро-1-фосфата и тестируемых соединений, происходит в основном в результате конкуренции растворенных веществ за радикальные продукты радиолиза воды. Нитропроизводные гистидина (IV) и (V) значительно превосходят исходную аминокислоту (II) по способности подавлять радиационно-индуцированное дефосфорилирование глицеро-1-фосфата, но при этом заметно уступают метронидазолу (VI), используемому в клинической практике для радиосенсибилизации гипоксических опухолей. Необходимо также отметить, что при незначительных отличиях в структуре веществ ${\text{G}}\left( {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{PO}}_{{\text{4}}}^{ - }} \right)$ в присутствии гистамина (III) в 2 раза меньше, чем в присутствии гистидина (II). При этом радиационно-химический выход разложения гистамина (III) в 2.7 раза меньше, чем у гистидина (II), что свидетельствует с одной стороны о высокой реакционной способности гистамина (III) по отношению к радикалам, образующимся в этой системе, а с другой – о возможности регенерации его радикалов до исходного соединения (III) в свободнорадикальных реакциях. Ранее мы показали, что наличие аминоалкильного фрагмента обуславливает высокую антирадикальную активность производных триптофана [15].

Имидазол (I) лишь немного уступал нитропроизводным (IV–VI) и превосходил гисти-дин (II) по способности ингибировать радиационно-индуцированное дефосфорилирование глицеро-1-фосфата в деаэрированных 0.001 М водных растворах. На этом основании можно сделать заключение, что именно азотсодержащий гетероцикл в составе тестируемых соединений обуславливает их реакционную способность по отношению к радикальным продуктам радиолиза воды.

Поскольку величины констант скорости реакции •ОН радикалов с глицеро-1-фосфатом и имидазолсодержащими соединениями примерно равны (см. табл. 3), можно было бы ожидать двукратное снижение радиационно-химического выхода неорганического фосфата в присутствии тестируемых соединений (I–VI), как это наблюдается для гистидина (II). Более сильное ингибирование дефосфорилирования в присутствии соединений (I, III–VI) может быть вызвано их взаимодействием с α-ГУР глицеро-1-фосфата. В частности, высокая активность гистамина (III) может быть связана с наличием в структуре аминоалкильного фрагмента. Большинство ароматических нитросоединений проявляют сильные окислительные свойства в отношении углеродцентрированных радикалов [14, 19]. Поэтому нитропроизводные имидазола (IV–VI) скорее всего также будут окислять α-ГУР глицеро-1-фосфата:

(4)

Имидазол (I) имеет на порядок более высокую константу скорости реакции с гидратированным электроном по сравнению с глицеро-1-фосфатом (см. табл. 3). Образующиеся в реакции (5) анион-радикалы будут проявлять сильные восстановительные свойства в отношении углеродцентрированных радикалов, поэтому можно предположить, что снижение ${\text{G}}\left( {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{PO}}_{{\text{4}}}^{ - }} \right)$ в присутствии имидазола (I) обусловлено в том числе и взаимодействием его анион-радикала с α-ГУР глицеро-1-фосфата по реакции (6).

(5)

(6)

При радиолизе деаэрированного 0.1 М водного раствора глицеро-1-фосфата ${\text{G}}\left( {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{PO}}_{{\text{4}}}^{ - }} \right)$ ≈ ${{{\text{G}}}_{{\centerdot {\text{OH}}}}}$ + + ${{{\text{G}}}_{{\centerdot {\text{H}}}}}$. Поэтому можно констатировать, что, во-первых, окисляющие радикальные продукты радиолиза воды количественно реагируют с органическим фосфатом по реакции (2). Во-вторых, в условиях γ-радиолиза α-ГУР глицеро-1-фосфата не вступают в бирадикальные реакции диспропорционирования и рекомбинации, а расходуются исключительно в монорадикальном процессе – свободнорадикальной фрагментации (3). Следовательно при соотношении субстрат : добавка 100 : 1 подавление дефосфорилирования при введении в систему соединений (I–VI) будет обусловлено их взаимодействием с α-ГУР глицеро-1-фосфата.

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что нитропроизводные имидазола (IV–VI), эффективно подавляют свободнорадикальную фрагментацию глицеро-1-фосфата в деаэрированном 0.1 М водном растворе, снижая ${\text{G}}\left( {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{PO}}_{{\text{4}}}^{ - }} \right)$ в 1.9–2.5 раза. При этом соединения (IV, V) немного уступают по активности метронидазолу (VI), но их радиационно-химические выходы разложения ниже соответственно в 2 и 3 раза по сравнению с радиосенсибилизатором (VI), используемым в клинической практике. Наиболее вероятной причиной высокой активности нитроимидазолов (IV–VI) является их способность окислять α-ГУР глицеро-1-фосфата по реакции (4), предотвращая фрагментацию последних.

С использованием инструментария метода конкурирующих реакций для радиационно-индуцированных процессов [13, 20] можно рассчитать константу скорости реакции окисления α‑ГУР глицеро-1-фосфата нитропроизводными имидазола (IV–VI). Концентрация добавок (IV–VI) в растворе составляет 10^–3 моль/л, а константа монорадикальной фрагментации гидроксилсодержащих органических фосфатов составляет ~3.5 ×  10⁶ с^–1 [18]. Соответственно, искомая константа взаимодействия с α-ГУР для метронидазола (VI) составит 5.1 × 10⁹ л моль^–1 с^–1, для соединения (IV) – 3.1 × 10⁹ л моль^–1 с^–1, для соединения (V) – 3.4 × 10⁹ л моль^–1 с^–1.

Имидазол (I), гистидин (II), гистамин (III) ингибируют радиационно-индуцированное дефосфорилирование глицеро-1-фосфата лишь на ~20%, значительно слабее, чем их нитропроизводные (IV–VI). Поскольку соединения (II) и (III) практически не разлагаются в ходе радиолиза, наблюдаемое в их присутствии снижение ${\text{G}}\left( {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{PO}}_{{\text{4}}}^{ - }} \right)$ может быть обусловлено вовлечением гистидина (II) и гистамина (III) в реакции аналогичные (5) и (6).

Для того, чтобы установить механизм взаимодействия тестируемых соединений (I–VI) с α-ГУР мы изучили их радиационно-индуцированные превращения в деаэрированном 1 М водном растворе этанола, в котором образуются простейшие представители α-ГУР – α-гидроксиэтильные радикалы (α-ГЭР) в результате отщепления атома водорода от этанола под действием •ОН и •Н по реакции (7). В отсутствие добавок α-ГЭР с примерно равной вероятностью расходуются в реакциях диспропорционирования (8) и рекомбинации (9) с образованием, соответственно, ацетальдегида и бутандиола-2,3. В деаэрированных водных растворах под действием гидратированных электронов происходит частичное восстановление ацетальдегида до α-ГЭР по реакции (10), в результате чего в отсутствие добавок радиационно-химический выход бутандиола-2,3 превышает соответствующую величину для ацетальдегида в 10 раз (табл. 4).

(7)

(10)

При введении в систему тестируемых соединений (I–VI) наблюдается кардинальное изменение соотношения радиационно-химических выходов основных молекулярных продуктов радиолиза деаэрированного 1 М водного раствора этанола в пользу ацетальдегида, что свидетельствует о наличии выраженных окислительных свойств у имидазола (I) и его производных (II–VI). В присутствии нитропроизводных гистидина (IV, V) бутандиол-2,3 не детектируется в облученных пробах, а в случае метронидазола (VI) – радиационно-химические выходы этого продукта рекомбинации α-ГЭР близки к нулю. При этом G (CH₃CHO) в присутствии нитроимидазолов (IV–VI) даже превышает ${{{\text{G}}}_{{\centerdot {\text{OH}}}}}$ + ${{{\text{G}}}_{{\centerdot {\text{H}}}}}$. Таким образом, нитропроизводные гистидина (IV, V) и метронидазол (VI) количественно окисляют α-ГЭР по реакции (11), подавляя реакции их рекомбинации (9).

(11)

Можно заметить, что при сходном влиянии на образование основных молекулярных продуктов радиолиза деаэрированного 1 М водного раствора этанола радиационно-химические выходы разложения метронидазола (VI) в 3.2 раза превышают таковые для нитропроизводныx гистидина (IV, V). Аналогичные различия в интенсивностях радиолитического разложения этих добавок мы также наблюдали и при радиолизе деаэрированных водных растворов глицеро-1-фосфата.

По нашему мнению, более высокие радиационно-химические выходы разложения метронидазола (VI) обусловлены наличием метильной группы при С₂ и 2‑гидроксиэтильного фрагмента при N₁-атоме в структуре соединения. Образующийся в реакции (11) радикал метронидазола (VI) может перегруппировываться в углеродцентрированный радикал (VIII) по схеме (12) , который в силу наличия заместителя при N₁ не способен вступать в реакции диспропорционирования. Радикал (VIII) может превращаться в молекулярный продукт только в результате восстановления или рекомбинации с углеродцентрированными радикалами, в частности, с α-ГЭР по реакции (13). Продукты присоединения α-ГЭР к метронидазолу (VI) в водно-этанольных растворах были идентифицированы нами методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии.

(12)

(13)

В отличие от метронидазола (VI), нитропроизводные гистидина (IV, V) имеют только один заместитель в положении С₄ имидазольного кольца. Поэтому продукты их одноэлектронного восстановления, образующиеся в реакции (11), будут в основном гибнуть в реакциях диспропорционирования, с образованием нитрозосоединений (14) или продуктов восстановления кратной углерод-углеродной связи в имидазольном цикле, например, по реакции (15):

При облучении имидазола (I), гистидина (II), гистамина (III) в деаэрированном 1 М водном растворе этанола радиационно-химический выход бутандиола-2,3 снижается примерно в 10 раз по сравнению с контролем, что указывает на высокую реакционную способность соединений (I–III) по отношению к α-ГЭР. Не обладая функциональными фрагментами с выраженными окислительными свойствами имидазол (I), гистидин (II) и гистамин (III) увеличивают радиационно-химические выходы ацетальдегида до величин, которые не могут быть объяснены только лишь акцептированием гидратированных электронов добавками (I–III) по реакции (5).

В результате присоединения α-ГЭР по кратным связям имидазола (I) и его производных (II, III) по реакции (16) могут образовываться радикал-аддукты двух типов. Наличие объемного заместителя в положении С₄ имидазольного кольца затрудняет присоединение радикалов по –С₄=С₅–, в результате чего основным продуктом реакции (16) в случае гистидина (II) и гистамина (III) будет азотцентрированный радикал (IX), проявляющий окислительные свойства. В случае имидазола (I) присоединение α-ГЭР будет в основном приводить к образованию более термодинамически стабильного углеродцентрированного радикала (X).

(16)

Методом газовой хромато-масс-спектрометрии мы идентифицировали два типа продуктов радиолиза имидазола (I) с массами молекулярного иона m/z = 112 = M(имидазола) + M(α-ГЭР) – 1, а также m/z = 114 = M(имидазола) + M(α-ГЭР) + 1, причем концентрация аддуктов первого типа была значительно выше, чем второго. То есть для углеродцентрированных радикалов (X) имидазола (I) более выгодно окислиться по реакции (17) с восстановлением псевдоароматической системы имидазольного кольца, чем присоединить атом водорода (18):

Разные направления присоединения α-ГЭР по кратным связям в структуре имидазола (I) с одной стороны, а также гистидина (II) и гистамина (III) с другой, являются причиной значительных различий в величинах радиационно-химических выходов ацетальдегида, наблюдаемых при радиолизе этих соединений (I, II, III) в деаэрированном 1 М водном растворе этанола.

Выявленные в работе закономерности радиационно-индуцированных превращений имидазолсодержащих соединений (I–VI) могут иметь важное значение для понимания молекулярных механизмов, ответственных за формирование радиосенсибилизирующих свойств метронидазола (VI). Нитропроизводные гистидина (IV, V) проявили себя эффективными окислителями α-ГУР, способными подавлять свободнорадикальную фрагментацию гидроксилсодержащих органических фосфатов. Поэтому целесообразно продолжить тестирование этих соединений (IV, V) на клеточных культурах и экспериментальных животных в качестве перспективных радиосенсибилизирующих агентов для радиотерапии опухолей.

ВЫВОДЫ

Методом стационарного радиолиза исследовано взаимодействие имидазола, гистамина, гистидина и их нитропроизводных с α-гидроксилсодержащими углеродцентрированными радикалами, образующимися в ходе радиационно-индуцированных превращений глицеро-1-фосфата и этанола в деаэрированных водных растворах при pH 7. Установлено, что в эквимолярных с глицеро-1-фосфатом концентрациях исследуемые вещества ингибируют радиационно-индуцированное дефосфорилирование за счет акцептирования радикальных продуктов радиолиза воды. При радиолизе деаэрированных 0.1 М водных растворов глицеро-1-фосфата, когда соотношениe добавка : : субстрат составляет 1 : 100, нитропроизводные гистидина, а также метронидазол эффективно ингибируют радиационно-индуцированное дефосфорилирование за счет взаимодействия с α-гидроксилсодержащими углеродцентрированными радикалами глицеро-1-фосфата. В тоже время, имидазол, гистамин и гистидин в этих условиях снижают радиационно-химический выход неорганического фосфата лишь на 20%. Рассчитанные с использованием инструментария метода конкурирующих реакций величины констант скорости реакции 5-нитроимидазолов с радикалами глицеро-1-фосфата составляют 5.1 × 10⁹ л моль^–1 с^–1 для метронидазола и (3.1–3.4) × 10⁹ л моль^–1 с^–1 для нитропроизводных гистидина. С использованием радиолиза 1 М водного раствора этанола было продемонстрировано, что 5-нитроимидазолы количественно окисляют α-гидроксиэтильные радикалы, что проявляется в отсутствии бутандиола-2,3 среди продуктов радиолиза и ~20-ти кратном увеличении выхода ацетальдегида по сравнению с контролем. Методом хромато-масс-спектрометрии были идентифицированы соединения, образующиеся в ходе радиолиза в результате присоединения α-гидроксиэтильных радикалов по кратным связям имидазола и его производных, для 5‑нитроимидазолов были также зарегистрированы продукты восстановления нитрогруппы. Таким образом, метронидазол и нитропроизводные гистидина способны подавлять радиационно-индуцированное дефосфорилирование глицеро-1-фосфата и, вероятно, глицерофосфолипидов за счет окисления их α-гидроксилсодержащих углеродцентрированных радикалов.