Зоологический журнал, 2020, T. 99, № 1, стр. 39-44

Впервые вид Chironomus sp. Ya3 (Kiknadze, Istomina et Salova 1996) был обнаружен в нескольких водоемах близ пос. Усть-Нера, Оймяконского р-на, Республика Саха (Якутия), в зоне вечномерзлых грунтов (Кикнадзе и др., 1996). Вид относится к примитивной группе riihimakiensis. Эта группа состоит из нескольких видов-двойников, встречающихся в Скандинавии и Сибири (Kiknadze et al., 1994). Благодаря освоению природных ресурсов удаленных и труднодоступных северных регионов, у нас появляется возможность детальнее изучить фауну, населяющую биотопы с уникальными природными условиями. Особый интерес представляют водоемы дельты реки Печора, находящейся за полярным кругом в зоне вечной мерзлоты. Именно в таких суровых условиях, на значительном расстоянии от первой находки нами был обнаружен исследуемый вид.

Считается, что способность хирономид заселять разнообразные водоемы обеспечивается их высокой морфологической, хромосомной (Кикнадзе и др., 1991, 1996) и биохимической изменчивостью (Bolshakov, Andreeva, 2012). Было установлено, что структура их кариотипа в большей степени зависит от условий в водоеме, чем от его географического положения (Шобанов, 1994; Gunderina et al., 1999; Shobanov, Bolshakov, 2011; Большаков, Шобанов, 2017). Кроме этого, в гемолимфе некоторых хирономид содержится уникальный, низкомолекулярный и при этом внеклеточный гемоглобин (Osmulski, Leyko, 1986; Bolshakov, Andreeva, 2012), обладающий высоким сродством к кислороду (Weber, Vinogradov, 2001). Несмотря на это, запасенного кислорода личинкам хватает приблизительно на 9 мин (Walshe, 1950), поэтому, вероятно, он может принимать участие в поддержании осмотического гомеостаза внутренней среды при неблагоприятных условиях (Шобанов, 2004).

Цель работы – изучить особенности кариотипа Ch. sp. Ya3 из устья р. Печора и провести его сравнение с обнаруженным ранее; изучить электрофоретический спектр гемоглобинов.

Материалом для работы послужили личинки Chironomus sp. Ya3, собранные 8 августа 2016 г. из водоема на острове в протоке Большой Гусинец дельты р. Печора. Координаты точки сбора: 68°10′282″ с.ш., 53°39′368″ в.д. Водоем представлял собой небольшое озерко, зарастающее осокой и сообщающееся с рекой в период половодья, площадью около 200 × 20 м², глубиной около 1 м. В период сбора материала температура воды составляла 17.5°C, pH 8.04.

Процесс обнаружения личинок имел свои особенности. Проба донного субстрата (смесь ила с песком) из водоема была доставлена в лабораторию и хранилась без фиксации герметично упакованная в пластиковый пакет в холодильнике при температуре +4°C до января 2017 г. При просмотре пробы в январе 2017 г. в ней были обнаружены живые личинки хирономид размером 3–5 мм. Личинки были отсажены в отдельную чашку Петри для доращивания по методике, описанной ранее (Bolshakov, 2015). Затем 4 февраля 2017 г. у трех наиболее крупных личинок была отобрана гемолимфа, а сами они зафиксированы в 96% этаноле. Для кариологического анализа оказались пригодными две особи.

Препараты политенных хромосом окрашивали орсеином (Merck, Германия) по стандартной методике (Демин, 1989). Фотографирование препаратов хромосом проводили на микроскопе “МикМед-6C” (ЛОМО, Россия) видеоокуляром “ToupCam5.1” (Китай), при увеличении ×1000. При видовой идентификации по кариотипу использовали цитофотокарты из монографии “Кариофонды хирономид криолитозоны Якутии: Триба Chironomini” (Кикнадзе и др., 1996) и “Karyotypes of Palearctic and Holarctic species of the genus Chironomus” (Kiknadze, 2016). Картирование хромосомных плеч A, E и F проведено по Кейлу (Keyl, 1962), а для плеч C и D – по Деваи с соавторами (Dévai et al., 1989).

Собранную гемолимфу немедленно замораживали и хранили при –25°С. Разделение белков проводили как в нативных условиях диск-электрофореза 10-% ПААГ (Maurer, 1971), так и в денатурирующих в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по Леммли (Laemmli, 1970; Bolshakov, Andreeva, 2012). В качестве контрольного вида был использован хорошо изученный массовый вид Ch. plumosus (L. 1758) из Рыбинского водохранилища.

Белки гемолимфы окрашивали Coomassie R-250 (Merck, Германия). Для определения молекулярной массы (ММ) денатурированных белков использовали набор PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas, США). Результаты обрабатывали статистически с помощью специализированного программного пакета “OneDScan”.

Морфологически личинки соответствуют первоописанию (Кикнадзе и др., 1996), за исключением размеров, в длину личинки едва достигали 15 мм, что, вероятно, может быть связано с их выращиванием на искусственном субстрате (Bolshakov, 2015).

В результате кариологического анализа у двух особей были обнаружены одинаковые кариотипы. Сочетание хромосомных плеч AB, CD, EF, G – соответствует цитокомплексу thummi. B-хромосом не обнаружено. В плечах D, E и G отмечены ядрышки. Теломерные диски разделены на хорошо окрашивающиеся глыбки, кроме этого, встречаются эктопические контакты плеч C и F (рис. 1).

Рис. 1.

Кариотип Chironomus sp. Ya3. Ya3A2.2., Ya3B1 и т.д. – генотипические комбинации последовательностей дисков хромосомных плеч; N – ядрышковый организатор; Br – кольцо Бальбиани. Пунктирной линией указан район инверсии в плече B.

Хромосома I

В плече A встречена одна последовательность Ya3A2 в гомозиготном состоянии, отличается от Ya3A1 простой инверсией (Кикнадзе и др., 1996; Kiknadze et al., 2016)

Ya3A2 1a-f.2a-c.3a-g.6c-3h.12c-11d.6e-9e.2d-k.11c-10a.14f-13a.1g-k.14g-19f.

В плече B встречено две последовательности Ya3B1 и Ya3B2, отмеченная впервые. Обе последовательности пока не картированы.

Хромосома II

В плече C отмечена одна последовательность Ya3C1 (Кикнадзе и др., 1996; Kiknadze et al., 2016).

Ya3C1 1a-3c.8a-11c.13a-15e.4a-6b.12d-11d.6gh.17a-16a.7d-a.6f-c.17b-22g.

В плече D одна последовательность Ya3D1 (Кикнадзе и др., 1996; Kiknadze et al., 2016).

Ya3D1 1a-3g.11a-c.16e-12a.8d-4a.10e-9a.17a-24g.

Хромосома III

В плече E обнаружено две последовательности Ya3E1 и Ya3E2.

Ya3E1 1a-i.5a-9b.2a-4h.10a-13g

Ya3E2 1a-i.5a-9d.2a-3d.4h-3e.10a-13g.

В плече F одна последовательность Ya3F1.

Ya3F1 1a-9f.18e-10a.19a-23f.

Хромосома IV

В плече G одна последовательность Ya3G1, не картирована. Гомологи могут быть полностью или частично спарены.

Всего нами было обнаружено 9 последовательностей, при этом последовательность Ya3A2 впервые встречена в гомозиготном состоянии, а последовательность Ya3E2 в виде гетерозиготы отмечена у обеих личинок, хотя ранее она была обнаружена лишь в одном из 69 изученных кариотипов (Кикнадзе и др., 1996).

В результате диск-электрофореза в гемолимфе Ch. sp. Ya3 было обнаружено 9 компонентов с различной электрофоретической подвижностью (Rf) (рис. 2; табл. 1). Для удобства несколько фракций были объединены в блоки, как было описано ранее у Ch. plumosus (Bolshakov, Andreeva, 2012). В итоге, в блоке 0 у Ch. sp. Ya3 была выделена одна фракция с подвижностью 0.33 (относительное содержание 5.5%), в блоке 1 – две фракции 0.43 (5.0%) и 0.50 (4.7%), в блоке 2 – нет фракций, в блоке 3 – две фракции 0.65 (7.7%) и 0.67 (4.0%), в блоке 4 – две фракции 0.73 (14.7%) и 0.78 (8.7%), в блоке 5 – две фракции 0.83 (18.1%) и 0.84 (31.7%).

Рис. 2.

Диск-электрофорез белков гемолимфы Ch. sp. Ya3 (1, 2) и Ch. plumosus (3). Стрелками указаны блоки фракций гемоглобинов (0–5). Вертикальная стрелка указывает направление электрофореза.

В результате SDS-электрофореза в гемолимфе личинок Ch. sp. Ya3 было обнаружено 11 компонентов гемоглобина, представленных субъединицами с ММ от 11.5 до 15.6 kDa. В 2-D SDS-электрофорезе видно, что фракции из блоков 0 и 1 образованы субъединицами со сходными ММ 12.05 kDa (Rf 0.33), 11.7 (0.43), 11.8 (0.50), из 3 блока – из двух типов субъединиц с ММ около 11.5 (0.65) и 12.7 (0.67) kDa, из 4 блока – 11.6 (0.73), 12.9 (0.73) и 12.3 (0.78), из 5 блока – 12.5 (0.83) и 15.6 (0.84), кроме этого, в области 0.84 были обнаружены субъединицы с ММ 12.1 kDa. Как видно, в области фракции с подвижностью 0.73 выделяются субъединицы с разной ММ. Вероятно, в этой области находится два типа гемоглобинов со сходной электрофоретической подвижностью, но состоящих из разных субъединиц. В итоге, на одномерном SDS-электрофорезе близкие по ММ субъединицы объединяются в четыре фракции с ММ около 11.5, 11.96, 12.8 и 15.6 kDa (рис. 3).

Рис. 3.

SDS-электрофорез белков гемолимфы: а – Ch. sp. Ya3, б – Ch. plumosus. Слева – 1D-, справа – 2D-SDS-электрофорез. Стрелками указано направление электрофореза.

Количества собранной гемолимфы оказалось недостаточно для проведения электрофореза в градиенте концентраций ПААГ, и установить структурную организацию гемоглобинов из отдельных фракций довольно сложно. Однако, опираясь на характеристики спектров уже изученных нами видов (Bolshakov, Andreeva, 2012), можно предположить, что гемоглобины Ch. sp. Ya3 сложно устроены и могут включать от одной (мономеры) до шести (гексамеры) и более субъединиц.

При первом взгляде на спектры нативных белков из гемолимфы Ch. sp. Ya3 и Ch. plumosus заметно их сходство. Однако подвижность всех фракций с близкими значениями ММ у Ch. sp. Ya3 оказывается несколько выше. То же наблюдается при сравнении спектров денатурированных белков: близкие по значению ММ фракции у Ch. sp. Ya3 примерно на 0.5 kDa легче, чем у Ch. plumosus. При сравнении состава субъединиц Ch. sp. Ya3 оказывается ближе к Ch. riparius (Meigen 1804) (Bolshakov, Andreeva, 2012), в спектре которого также преобладают субъединицы из фракций со средней подвижностью, в отличие от Ch. plumosus, в спектре которого преобладают субъединицы из фракций с высокой подвижностью. Это согласуется с данными работ по установлению филогенетических отношений в роде Chironomus, где Ch. sp. Ya3 оказывается ближе к Ch. riparius и Ch. piger (Strenzke 1959) (Шобанов, Зотов, 2001).

Ранее Шобановым (2004) было высказано предположение, что фракции с высокой, средней и низкой подвижностью обладают разной функциональностью. Быстрые фракции (Rf 0.85 и выше) представляют собой продукты деградации гемоглобина, средние (0.58–0.83), вероятно, обладают высоким сродством к кислороду и обеспечивают его утилизацию при низких концентрациях в окружающей среде, медленные (0.43 и ниже) имеют высокую ММ и выполняют буферную функцию при анаэробиозе (Шобанов, 2004). У Ch. sp. Ya3 в “медленной” области отмечено три фракции с относительным содержанием 15.2%, что может свидетельствовать о его высокой устойчивости в бескислородных (анаэробных) условиях.

Таким образом, специфика местообитания может привести к тому, что у хирономид появляются значительные межпопуляционные различия, в том числе возникают уникальные хромосомные последовательности (Кикнадзе и др., 1996).

Находка Ch. sp. Ya3 в дельте р. Печора является первой для европейской части России и второй с момента его описания. Однако несмотря на расстояние более чем в 3500 км от места первой находки, новые последовательности нами не встречены, что, вероятно, обусловлено некоторым сходством условий обитания личинок. Разница по широте между сравниваемыми точками составляет около 3.5°, что соответствует примерно 380 км. В поселке Усть-Нера, где впервые был обнаружен исследуемый вид, и в устье р. Печора в зимний период регулярно фиксируются значения температуры ниже –40°C, а короткое и прохладное лето, когда температура в течение суток не опускается ниже 10°C, длится до полутора месяцев (Lavrienko et al., 2000). Кроме этого, немногочисленные исследования показывают высокое сходство между фаунами хирономид бассейна р. Печора, озер плато Путорана и бассейна р. Колыма (Nazarova et al., 2015), что также свидетельствует о сходстве условий.

Количества исследованных нами личинок из устья р. Печора недостаточно для оценки внутрипопуляционного хромосомного полиморфизма и его адаптивного значения у Ch. sp. Ya3. Тем не менее в исследуемой популяции имеется ряд особенностей. В результате цитогенетического исследования у личинок Ch. sp. Ya3 было обнаружено 9 известных последовательностей. При этом последовательность Ya3A2 впервые встречена в гомозиготном состоянии, а Ya3E2 с высокой частотой в гетерозиготном состоянии. Анализ спектра нативных гемоглобинов показал его высокое сходство с Ch. plumosus, в то время как по субъединичному составу изученный вид оказался ближе к Ch. riparius. Высокое разнообразие нативных гемоглобинов с разной подвижностью и их субъединиц может свидетельствовать о высокой выносливости вида, что косвенно подтверждается особенностью находки.