Зоологический журнал, 2023, T. 102, № 12, стр. 1389-1397

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Отбор проб. В работе использовали выборку из трех половозрелых диплоидных самок Polypterus senegalus Cuvier 1829, в возрасте 2+.

Исследованные особи (общая длина (TL): 13.02 ± 1.29 см ($\bar {x} \pm std$), масса (TM): 13.78 ± 0.61 г ($\bar {x} \pm std$)) были приобретены у специалистов по разведению многопёра. В Россию рыбу доставляли из республики Нигер. Транспортировка осуществлялась в специальных контейнерах с принудительной аэрацией, температура воды составляла 23 ± 0.5°С.

Получение серийных срезов. Рыбы проходили акклимацию в аэрируемых, проточных стационарных аквариумах, объемом 200 л, с температурой воды 23 ± 0.5°С. Ежедневное кормление проводили крупным мотылем (ООО “Любимчик”, Россия).

Перед разрушением мозга каждой особи вводили анестетик – бензокаин (Merck Life Science LLC, Германия). После чего проводили измерение длины и массы тела. Далее рассекали дорсальную поверхность тела рыб и иссекали мезонефрос.

Образцы фиксировали в 2.5% глутаральдегиде в 0.1 М фосфатном буфере (Servicebio Technology, Ltd, Китай). Далее для дегидратации проводили пробы через серию спиртов (АО “ЭКОС-1”, Россия). Дегидратированные пробы помещали в ксилол (АО “ЭКОС-1”, Россия), а впоследствии в парафин (ГК “Биовитрум”, Россия) в соответствии со стандартной методологией (Тимакова и др., 2014).

Для реконструкции орган разделен на 5 сегментальных частей (I, II – краниальные; III – медиальная; IV, V – каудальные), нумерация частей начинается от участка мезонефроса, расположенного у жаберных дуг (краниальная часть), и заканчивается участком мезонефроса, расположенным в каудальной части тела. Такое разделение почки позволило эффективно описывать “горизонтальное (кранио-каудальное) количественное распределение” описываемых структур (рис. 1).

Рис. 1.

Схема разделения мезонефроса на сегментальные части и фронтальные слои. Номера фронтальных слоев соответствуют номерам в табл. 1.

Тонкие срезы (7 нм) изготовлены с помощью микротома Slide 2003 PFM medical (PFM Medical, Германия). Серийные срезы сегментальных частей выполнены во фронтальной плоскости. Всего было получено 526 срезов для каждого отобранного органа. Срезы размещены на предметных стеклах, депарафинизированы и окрашены Гематоксилином-эозином (ООО “Кемикал Лайн”, Россия) (Тимакова и др., 2014). При помощи светового микроскопа Micromed-6 (ООО “Микромед”, России) с цифровой камерой (видеоокуляром) Toup Cam 5.1 (ООО “Микромед”, Россия) для каждого среза получена серия цифровых фотографий. Морфометрический анализ проводился с помощью ПО JMicroVision v1.2.7 Copyright © 2002–2008 (Roduit, 2005).

По каждой исследуемой части мезонефроса получены вертикальные серии срезов. Для удобства анализа и сравнения результатов для каждой части почки серии срезов разделены на шесть фронтальных слоев. Нумерация слоев начинается от дорсальной к вентральной части мезонефроса (рис. 1). Данное разделение позволяет описывать вертикальное количественное распределение структур мезонефроса.

Измеряли площадь кроветворной и нефрогенной тканей, диаметр почечных телец и расстояние между соседними капсулами. Проводили подсчет количества почечных телец на каждом слое мезонефроса.

На серийных срезах выявили срезы наибольшего диаметра почечного тельца, включающего гломерулус и капсулу Шумлянского–Боумена. Далее с помощью стандартной формулы площади поверхности шара рассчитали площадь внешней поверхности почечных телец, допуская, что форма почечного тельца приближена к форме сферы. На серийных срезах измеряли расстояние между соседними капсулами, учитывали количество почечных телец на каждом фронтальном слое мезонефроса. Плотность почечных телец рассчитывали как отношение количества почечных телец к общей площади среза.

Трехмерную реконструкцию взаимного расположения сосудистого русла и почечных телец проводили с помощью программы Reconstruct (Nicolas Roduit). Для этого использовали серии цифровых фотографий срезов от дорсального к вентральному полюсу органа, выделяли нужные структуры и формировали изображение.

Статистический анализ. В работе результаты представлены в виде средних значений и их ошибок ($\bar {x} \pm \sigma $) по каждому сектору мезонефроса. Сектора мезонефроса выделяли на основе положения исследуемого участка во фронтальном слое и сегментальной части. Между секторами проводили попарное исследование статистической значимости различий средних значений описываемых структур мезонефроса.

Статистическую значимость оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Для проверки нулевой гипотезы об отсутствии влияния факторов (сегментальных частей и фронтальных слоев) на целевые переменные использовали параметрический двухфакторный дисперсионный анализ. Для проведения множественных апостериорных сравнений средних значений переменных применяли критерий Тьюки. Для проверки нулевой гипотезы о нормальности распределения остатков дисперсионного анализа применяли критерий Шапиро–Уилка.

Для оценки статистической значимости корреляционной связи исследуемых признаков при наличии нормального распределения применяли критерий Пирсона, а при отсутствии нормального распределении – критерий Спирмена. При этом нулевая гипотеза указывала на отсутствие статистически значимой связи между переменными. Для оценки нормальности применяли критерий Шапиро–Уилка. Адекватность результатов, полученных с помощью корреляционных тестов, оценивали с использованием попарных диаграмм рассеивания.

Критический уровень значимости при использовании всех вышеуказанных тестов принимался равным α ≤ 0.05. Для обработки результатов применяли следующее программное обеспечение: MS Excel 2016, IPython 7.19.0, Python 3.8.5, Statistica TIBCO Software 2017. Version 13.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Архитектоника мезонефроса. Строма мезонефроса P. senegalus состоит из ретикулярной ткани, в которой располагаются клетки крови, образуя интерстиций органа. Интерстиций окружает сосуды и нефроны. В латеральных зонах во всех сегментах органа были обнаружены участки кроветворной ткани без нефрогенных структур, такие участки условно были названы “островковой кроветворной тканью” (рис. 2). В кранио-каудальном направлении в первом слое островковая ткань выявлена лишь в первом сегменте почки. В остальных фронтальных слоях наблюдалось уменьшение доли островковой кроветворной ткани от краниальной части мезонефроса к медиальной части с последующим увеличением в каудальных частях. Наибольшая доля островковой кроветворной ткани выявлена в I краниальной части (табл. 1).

Рис. 2.

Микроанатомия почки. Основные структурные единицы: 1 – эстраорганный магистральный сосуд, 2 – почечное тельце, 3 – проксимальный каналец, 4 – дистальный каналец, 5 – почечный интерстиций, 6 – островковая кроветворная ткань.

В дорсовентральном направлении не выявлено закономерности послойного распределения островковой гемопоэтической ткани, наибольшая ее доля обнаружена в 6 фронтальном слое (табл. 1).

Общее количество почечных телец в мезонефросе P. senegalus составляет 19861 ± 739 шт. Наименьшее количество почечных телец наблюдается в I сегментальной части (1793 ± 37 шт.). Наибольшее количество отмечено в V сегментальной части (4794 ± 187 шт.). Для всех сегментов мезонефроса характерна кластеризация почечных телец численностью от 2 до 4 единиц (рис. 3). В кранио-каудальном направлении количество кластеров, в которых встречалось четыре почечных тельца, возрастает в медиальной и каудальных частях мезонефроса.

Рис. 3.

Схема строения почки. Основные структурные единицы: 1 – экстраорганный магистральный сосуд; 2 – интрамуральные сосуды, снабжающие кровью гломерулусы почечных телец; 3 – почечное тельце; 4 – каудальный край почки; 5 – краниальный край почки.

Количество почечных телец в кранио-каудальном направлении в зависимости от слоя изменяется разнонаправлено. В 1, 2 и 6 слоях количество почечных телец возрастает от I к III сегментальной части, затем, от III к V части происходит снижение данного показателя. В 3 и 5 слое количество почечных телец увеличивается от I к V сегментальной части. В 4 слое зарегистрировано более чем двукратное увеличение количества почечных телец во II и V частях по сравнению с другими частями.

Вертикальное распределение характеризуется увеличением количества почечных телец от латеральных к медиальным слоям. Наименьшее среднее количество почечных телец приходится на дорсальный (1) фронтальный слой. Наибольшее количество почечных телец наблюдается во II и V частях 4 слоя (табл. 2).

Площадь поверхности почечных телец в мезонефросе P. senegalus составляет 0.0209 ± 0.007 мм². Как в кранио-каудальном, так и дорсовентральном направлениях мезонефроса площадь поверхности почечных телец уменьшается неравномерно. Отмечено, что в I сегментальной части мезонефроса локализуются почечные тельца с наибольшей, по сравнению с другими частями, площадью поверхности (табл. 3).

Среднее расстояние между ближайшими соседними почечными тельцами во всем мезонефросе P. senegalus составляет 250.04 ± 95.65 мкм. Наибольшее расстояние между соседними почечными тельцами выявлено во всех слоях I сегментальной части. В кранио-каудальном направлении обнаружена отрицательная корреляция между количеством почечных телец и расстоянием между ними (табл. 4).

Трехмерная модель сосудистого русла и почечных телец мезонефроса выглядит следующим образом (рис. 3). В краниальной части наблюдаются сосуды наименьшего диаметра, снабжающие наибольшие почечные тельца и участки почки с наибольшей долей кроветворной ткани. В IV и V сегментальных частях мезонефроса поперечное сечение интрамуральных сосудов достигает максимума. Наибольшее количество интерстиция и островковой кроветворной ткани локализовано в I сегментальной части почки, эта ткань окружает небольшое количество наиболее крупных почечных телец, которые максимально удалены друг от друга по сравнению с остальными сегментальными частями. На дорсальной поверхности кроветворная ткань отсутствует. В каудальной части мезонефроса данный вид ткани развит в меньшей степени, эта ткань окружает наиболее мелкие почечные тельца, плотно расположенные друг относительно друга.

У многопёра в мезонефросе кластеры почечных телец располагаются в медиальной части почки и, как правило, занимают положение, близкое к интерренальным артериям или пространству между ними. Паренхима в латеродорсальном пространстве органа преимущественно сформирована проксимальными и дистальными канальцами нефрона.

Таким образом, срезы структурных элементов всех фронтальных слоев от медиальной части к латеральному краю располагаются следующим образом. На каждом фронтальном слое четко выделена медиальная зона, сформированная срезами почечных телец. К данной зоне с обеих сторон прилегают две медиолатеральные зоны, сформированные, преимущественно, срезами дистальных канальцев нефронов. К ним прилегают латеральные зоны, сформированные, преимущественно, срезами проксимальных канальцев нефронов и островковой кроветворной тканью.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что организация почки представляет собой многочисленную копию одиночных структур нефрона и окружающей его кроветворной ткани (Zeinab et al., 2015). Ряд авторов разделяют мезонефрос костистых рыб на головную и хвостовую часть. Головная часть сформирована паренхимой, включающей в себя гемопотическую, интерренальную и хромафинную ткани (Senarat et al., 2013; Mokhtar, 2021; Bjørgen, Koppang, 2022). Известно, что в мезонефросе развитие кроветворной ткани, по сравнению с развитием других тканей органа, имеет следующую закономерность – в кранио-каудальном направлении происходит уменьшение ее площади (Bjørgen, Koppang, 2022). Подобная закономерность характерна и для мезонефроса P. senegalus, уменьшение площади кроветворной ткани происходит за счет увеличения площади нефрогенной. Показано, что кроветворная ткань мезонефроса P. senegalus фокусируется преимущественно на краниально-вентральном полюсе органа. Процентное соотношение специализированных тканей определяет ключевую функцию исследуемой части органа. Так, преобладающее развитие кроветворной ткани в головной части мезонефроса определяет гемопоэтическую функцию этой части органа (Senarat et al., 2013). Головная часть почки имеет более высокую выраженность гемопоэтической функции и, соответственно, доля кроветворной ткани, по сравнению с остальными частями мезонефроса), здесь больше (Ложниченко и др., 2010; Charmi et al., 2010; Morovvati et al., 2012; Mohammed, AL-Muhanna, 2018).

Таким образом, гистологический анализ показал, что туловищная почка многопёра имеет черты строения, сходные с чертами строения костистых рыб (Ojeda et al., 2006; Dantzler, 2016). Так, у многопёра в мезонефросе почечные тельца располагаются, преимущественно, в медиальной части почки, а ткань в латеродорсальном пространстве органа занята, преимущественно, дистальными и проксимальными канальцами нефрона. Подобное строение можно наблюдать у представителей вида P. dolli (Ojeda et al., 2006).

Почечные тельца играют важную роль в продукции клубочкового фильтрата и поддержании циркуляции плазмы крови в сосудистом русле (Ojeda et al., 2003). Почечные тельца, как правило, находятся близко к интерренальным артериям или занимают пространство между ними (Ojeda et al., 2003; Каплунова, 2015). Как для пресноводного баяда (Bagrus bayad (Forsskål 1775)), так и для солоноватоводной краснобрюхой тилапии (Tilapia zillii (Gervais 1848)) характерна кластерная организация структур мезонефроса – обширная васкуляризация ткани, содержащей крупные почечные тельца (Zeinab et al., 2015). Организация мезонефроса P. senegalus имеет черты, наиболее близкие к организации почек пресноводных рыб.

Второй важной особенностью архитектоники мезонефроса является кластерное расположение почечных телец. Известно, что эти структуры могут образовывать небольшие кластеры (3–4 единицы на кластер) (Morovvati et al., 2012). Почечные тельца пресноводного баяда и солоноватоводной краснобрюхой тилапии объединяются в кластеры по 3–6 единиц. В то же время, для морской японской скумбрии (Scomber japonicus (Houttuyn 1782)) характерно рассеянное расположение почечных телец (Zeinab et al., 2015). Подобное распределение почечных телец было обнаружено у двоякодышащего темного протоптера, близкого по своей экологической нише вида к P. senegalus (Ojeda et al., 2006). Следует отметить, что численность почечных телец, образующих кластер, у многопёра меньше, чем у ранее исследованных пресноводных рыб и составляет 2–4 единицы.

Размер почечных телец имеет большое значение в распределении функциональной нагрузки в мезонефросе. В краниальных частях мезонефроса лучепёрых рыб, например у красноперки (Scardinius erythrophthalmus (Linnaeus 1758)), почечные тельца отсутствуют. Так, для данного вида было описано, что в медиальных частях почки находится малое количество относительно крупных почечных телец. Далее в каудальном направлении количество почечных капсул возрастает, а их относительный размер уменьшается. При этом плотность расположения структур также возрастает в каудальном направлении (Грушко и др., 2021). Паттерн распределения почечных телец у P. senegalus имеет особенности, сходные с подобным распределением у красноперки.

Размер почечных телец играет значительную роль в функционировании нефрона, т.к. он определяет интенсивность массопередачи из сосудистого русла в полость капсулы, что указывает на эффективность образования первичной мочи. При этом важно отметить, что площадь поверхности почечных телец в мезонефросе P. senegalus сопоставима с площадью поверхности почечных телец у сазана (Сyprinus carpio (Linnaeus 1758)) (15 065–23 451 мкм²), карася золотого (Carassius caracus (Linnaeus 1758)) (24 434 мкм²) и темного протоптера (16 277–26 002 мкм²) (AL-Muhanna, 2018; Ojeda et al., 2006; Koval’chuk, Likhacheva, 1990).

Таким образом, мезонефрос P. senegalus имеет черты строения, сходные с чертами строения представителей лучепёрых рыб, но имеет иной паттерн распределения структур нефрона, ответственных за выполнение выделительной функции почки. Отмеченное зонирование характерно для групп лучепёрые и двоякодышащие (Ojeda et al., 2006). Данный факт указывает на начало специализации отдельных участков мезонефроса, которое в ходе эволюционного развития перерастает в высокую специализацию отдельных зон органа.

Вероятно, описанные распределение кроветворной ткани, количество и размер почечных телец связаны с анатомическими особенностями строения мезонефроса P. senegalus и расположением экстраорганного сосудистого русла, снабжающего орган. В краниальной части наблюдаются относительно меньшие по площади поперечного сечения сосуды, снабжающие наиболее крупные почечные тельца и участки почки с наибольшей долей кроветворной ткани. В кранио-каудальном направлении ветвление и поперечное сечение сосудов увеличиваются, т.к. в каудальных частях почки многочисленные небольшие почечные капсулы снабжаются артериями, что приводит к увеличению ветвления сосудов. Расширенное ветвление и наличие значительного количества анастомозов обусловливают демпферный эффект внутри сосудистого русла, что положительно сказывается на выделительной способности небольших почечных капсул. Более плотное (в кластерах) расположение позволяет увеличить васкуляризацию и поддержать высокое артериальное давление в сосудах гломерулуса кластеризованных капсул (Петренко, 2009). Такое строение сосудистого русла и расположение почечных телец необходимо для поддержания водного баланса и реализации эндокринных функций мезонефроса (Каплунова, 2015).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Паттерн распределения структур нефрона и кроветворной ткани мезонефроса P. senegalus имеет черты, сходные с распределением подобных структур у лучепёрых рыб. Наибольшая доля кроветворной ткани локализована в краниально-вентральном полюсе органа. Наибольшее количество почечных телец, наименьшей площади поверхности и наиболее удаленных друг от друга, обнаружено в каудальной части мезонефроса. Такое расположение структурных единиц почки в совокупности с особенностями васкуляризаии органа (положение экстраорганных и множественное ветвление внутриорганных сосудов) позволяет создать достаточное артериальное давление для эффективного выделения первичной мочи, что приближает почку P. senegalus к мезонефросу земноводных. Данные признаки эволюционно закрепились в базальных группах лучепёрых рыб и сохранились в процессе эволюционного развития, проявляясь у эволюционно молодых видов данной группы.