БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 10, с. 1513 - 1530

УДК 577.25

РАННЯЯ ИНДУКЦИЯ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОТРОФИНОВ

И микроРНК В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ МЫШЕЙ

ПОСЛЕ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛ!ИНДУЦИРОВАННОЙ

НЕРВНОЙ АКТИВНОСТИ

A.A. Шмакова^1,2, К.Д. Рысенкова^1,2, О.И. Ивашкина^3,4,5, А.М. Груздева³,

П.С. Климович^1,2, В.С. Попов¹, К.А. Рубина¹, К.В. Анохин^3,4,

В.А. Ткачук^1,2, Е.В. Семина^1,2*

¹ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет фундаментальной медицины,

119192 Москва, Россия; электронная почта: e'semina@yandex.ru

² Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии

Министерства Здравоохранения Российской Федерации, 121552 Москва, Россия

³ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Институт перспективных

исследований мозга, 119192 Москва, Россия; электронная почта: k.anokhin@gmail.com

⁴ Научно'исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина, 125315 Москва, Россия

⁵ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 123182 Москва, Россия

Поступила в редакцию 23.11.2020

После доработки 21.06.2021

Принята к публикации 30.06.2021

Рецепторы нейротрофинов, взаимодействуя со своими лигандами, регулируют в головном мозге выживае

мость нервных клеток, формирование нейронных связей и синаптическую пластичность. В данном иссле

довании был проведён анализ ранних изменений экспрессии генов рецепторов нейротрофинов Ntk1 (TrkA),

Ntrk2 (TrkB), Ntrk3 (TrkC), Ngfr (p75NTR) и контролирующих их микроРНК в структурах головного мозга

мыши после индукции судорожной нервной активности введением пентилентетразола. Полученные ре

зультаты показывают, что экспрессия Ntrk3 и Ngfr возрастает в коре и гиппокампе через 1-3 ч после судо

рог, экспрессия Ntrk2 возрастает в передней коре через 3-6 ч, а в гиппокампе наблюдается индукция

экспрессии через 1 и 6 ч. При этом в передней и задней коре, но не в гиппокампе, повышается соотноше

ние сигнальных белков Bcl 2/Bax, отражающее активацию анти апоптотической сигнализации. Одновре

менно с этим в гиппокампе через 3 ч после введения пентилентетразола возрастает экспрессия микроРНК 9

и микроРНК 29а, предсказанной мишенью которых является мРНК Ntrk3. Таким образом, можно сделать

вывод о том, что в состав раннего клеточного ответа на судорожную нервную активность в головном мозге

входит активация экспрессии генов рецепторов Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr, микроРНК 9 и микроРНК 29а, а также

сигнальный путь с участием белков Bcl 2 и Bax, что может характеризовать их как важных посредников в

регуляции адаптации и выживаемости нейронов в условиях генерализованной нервной активности.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рецепторы нейротрофинов TrkA, TrkB, TrkC, и p75NTR, микроРНК, микроРНК 9 и

микроРНК 29а, гены раннего ответа, активация нейронов, апоптоз.

DOI: 10.31857/S0320972521100080

ВВЕДЕНИЕ

в норме и при патологии. Помимо непосред

ственно трофической роли, нейротрофины и их

Нейротрофины и их рецепторы являются

рецепторы координируют нейритогенез, на

важными регуляторами пролиферации, диффе

правленный рост нейритов, образование синап

ренцировки и выживания нейрональных клеток

тических структур, высвобождение нейротранс

миттеров и синаптическую пластичность [1].

Принятые сокращения: BDNF - brain derived neu

Внутриклеточная сигнализация нейротрофинов

rotrophic factor, мозговой нейротрофический фактор;

осуществляется за счёт связывания с рецептора

GO:BP - Gene ontology: biological processes, генная онтоло

ми двух типов: низкоаффинного рецептора

гия: биологические процессы; NGF - фактор роста нер

p75NTR (ген Ngfr), относящегося к семейству

вов; p75NTR - нейротрофиновый рецептор p75; PTZ -

рецепторов, содержащих «домен смерти» (су

пентилентетразол; tPA - тканевой активатор плазминоге

на; Trk - тропомиозин рецепторные киназы; uPAR - уро

персемейство рецепторов факторов некроза

киназный рецептор.

опухоли TNFR); и высокоаффинных рецептор

* Адресат для корреспонденции.

ных тирозинкиназ (тропомиозин рецепторные

1513

1514

ШМАКОВА и др.

киназы, Trk). В то время как p75NTR активиру

способствовать более глубокому пониманию

ется всеми четырьмя нейротрофинами, рецеп

молекулярных и клеточных механизмов выжи

торы Trk более селективны к лигандам: фактор

вания и адаптивной пластичности нейронов в

роста нервов (NGF) преимущественно связыва

норме и при патологии.

ется с TrkA (ген Ntrk1), нейротрофический фак

В связи с этим целью данной работы было

тор головного мозга (BDNF) и нейротрофин

исследовать экспрессию генов рецепторов ней

4/5 (NT 4/5) - c TrkB (ген Ntrk2), нейротрофин

ротрофинов Ntrk1, Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr в структу

3 (NT 3) - c TrkC (ген Ntrk3) [2]. Секретируемые

рах головного мозга мышей на ранних сроках

пронейротрофины имеют бóльшую аффинность

после вызванной введением пентилентетразо

к рецептору p75NTR, чем зрелые формы [3].

ла (PTZ) генерализованной нервной активнос

Сигналинг нейротрофинов через p75NTR свя

ти. Структуры головного мозга (передняя и зад

зан с индукцией апоптоза, а активация Trk, нап

няя кора полушарий головного мозга и гиппо

ротив, стимулирует выживание и дифференци

камп) и сроки анализа (1, 3 и 6 ч) были выбраны

ровку нейронов [2, 4, 5]. Мембранная представ

на основе наших предыдущих данных об индук

ленность рецепторов p75NTR и Trk может изме

ции в этих условиях гена Plaur [21]. С помощью

няться при возбуждении или повреждении ней

биоинформатического поиска нами также были

рональных клеток [6-8], что координирует ме

найдены конкретные микроРНК, мишенями

ханизмы клеточного ответа и определяет функ

которых являются рецепторы нейротрофинов, и

циональный эффект действия нейротрофинов.

проверена зависимость их экспрессии от PTZ

Наши недавние исследования показали воз

индуцированной судорожной активности. На

можную связь экспрессии рецепторов нейро

конец, поскольку введение PTZ служит и мо

трофинов с функционированием урокиназной

делью повреждения нейронов головного моз

системы: CRISPR/Cas9n опосредованный но

га [31, 32], мы провели оценку в исследованных

каут гена Plaur, кодирующего урокиназный ре

структурах белков Bax и Bcl 2, как сигнальных

цептор (uPAR), снижал экспрессию полнораз

посредников апоптоза. Полученные данные

мерной формы рецептора TrkC и подавлял TrkC

позволяют сделать вывод о том, что в головном

зависимую внутриклеточную сигнализацию в

мозге на ранних сроках после введения PTZ

клетках нейробластомы Neuro2a [9]. Урокиназ

происходит активация экспрессии генов рецеп

ная система является частью системы активато

торов Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr, микроРНК 9 и мик

ров плазминогена, в состав которой входит уро

роРНК 29а, а также активация сигнального пу

киназа (uPA) и ее рецептор (uPAR), тканевой ак

ти с участием белков Bcl 2 и Bax, что может ха

тиватор плазминогена (tPA) и ингибиторы акти

рактеризовать их, как важных молекулярных

ваторов плазминогена (PAI 1 и PAI 2) [10].

посредников в регуляции выживаемости и адап

В наших работах и в исследованиях других авто

тации нейронов в условиях генерализованной

ров была показана важная роль системы актива

судорожной активности.

торов плазминогена в регуляции таких процес

сов в нервной системе, как формирование го

ловного мозга в эмбриогенезе [11-13], регене

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

рация периферических нервов [14-17], нейри

тогенез [18, 19], регуляция направленного роста

Работа с лабораторными животными и индук!

аксонов [18, 20], ответ на генерализованные су

ция генерализованных судорог. В исследовании

дороги и эпилептогенез [21-24], ответ на трав

были использованы взрослые самцы мы

мы и повреждения головного мозга [25-27].

шей C57BL/6J в возрасте 12-14 недель весом

Нами также было установлено, что в голов

28,2 ± 3,7 г, полученные из питомника ЦКП

ном мозге взрослых животных экспрессия uPAR

«SPF виварий» ИЦиГ СО РАН (Новосибирск,

может регулироваться нервной активностью,

Россия). Мышей содержали при стандартном

уровни его мРНК многократно возрастают в

12 часовом цикле свет/темнота, постоянной

ранние сроки после судорог, вызванных введе

температуре (22 ± 1 °C) и влажности (50-60%).

нием пентилентетразола; при этом Plaur функ

Вода и еда были доступны без ограничений. Ис

ционирует в этих условиях в качестве непосред

следования планировали и проводили в соответ

ственного раннего гена [21]. Так как регуляция

ствии с руководством PREPARE Guideline [33].

генов рецепторов нейротрофинов также изме

Всего было использовано 120 животных, кото

няется под влиянием судорог [6-8, 28-30], изу

рых распределяли в экспериментальные (1, 3,

чение их экспрессии после генерализованной

6 ч) и контрольную (0 ч) группы случайным об

нервной активности в структурах мозга, где в

разом (по 4-6 мышей в группу). Генерализован

это время была обнаружена активация ге

ные судороги вызывали введением PTZ

на Plaur, представляет большой интерес и может

(«Sigma», США) внутрибрюшинно, как описано

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1515

ранее [34]. Доза PTZ составила 75 мг/кг массы

токолом производителя. Количество тотальной

тела, что вызывало максимальную (6 и выше

РНК измеряли с помощью спектрофотометра

баллов по модифицированной для мышей шка

NanoDrop1000

(«Thermo Fisher Scientific»,

ле Рацина [35]) выраженность судорог у боль

США). Качество тотальной РНК и представлен

шинства особей. Выделение мозга и дальней

ность фракции малых РНК оценивали с по

ший анализ полученных образцов проводили

мощью электрофореза в 1% ном агарозном геле.

только у тех мышей, у которых наблюдались по

1,5 мкг тотальной РНК подвергали обратной

добные максимально выраженные судороги.

транскрипции с использованием олиго(dT) и

Препарат растворяли в 0,9% ном растворе NaCl.

случайных (dN)₁₀ праймеров с помощью набора

Мышей, которым вводили физиологический

MMLV RT («Евроген», Россия). ПЦР проводили

раствор, использовали в качестве контроля (0 ч).

с использованием qPCRmix HS SYBR («Евро

В качестве временных точек для анализа были

ген») на приборе для ПЦР в реальном времени

выбраны 1, 3 и 6 ч после судорог, как наиболее

CFX96 («Bio Rad», США). Использованные в

релевантные для изучения раннего ответа, со

работе праймеры кДНК мыши («Евроген») при

гласно нашим данным [21]. Мышей умерщвля

ведены в табл. 1 [9].

ли путём цервикальной дислокации через соот

Условия проведения ПЦР включали предде

ветствующие промежутки времени после начала

натурацию при 95 °С 15 мин, далее 40 циклов

судорог, далее декапитировали и выделяли го

амплификации (денатурация 15 с при 95 °С, от

ловной мозг. Передняя кора, задняя кора, гип

жиг с праймерами 15 с при 62 °С и элонгация

покамп и стриатум были выделены, как описано

20 с при 72 °С). ПЦР для каждого образца про

ранее [36]. В качестве передней коры выделяли

водили в дубликатах (технические повторнос

отделы до уровня 0 относительно точки Брегма,

ти). Относительный уровень транскрипта рас

в качестве задней - отделы от уровня -2 мм от

считывали с использованием метода 2-ΔΔCt с ге

носительно точки Брегма, согласно стандартно

ном β актина в качестве гена сравнения, «гена

му стереотаксическому атласу мозга мыши [37].

домашнего хозяйства»; нормализацию проводи

Образцы быстро замораживали в жидком азоте

ли, принимая за единицу средний уровень каж

и хранили при -80 °C до выделения РНК и

дого транскрипта в контроле (контрольные мы

белка.

ши без введения PTZ).

Чтобы исключить влияние мРНК клеток

Анализ экспрессии зрелых микроРНК. Ана

крови в образцах мозга, мы собирали цельную

лиз экспрессии зрелых микроРНК проводили

кровь подопытных мышей через 3 и 6 ч после

инъекции PTZ, а также контрольных мышей в

Таблица 1. Последовательности праймеров, использован

аналогичные сроки. Для каждой временной точ

ных в работе

ки в группу входили 4 мыши. Приблизительно

500 мкл мышиной крови отбирали методом кар

Название праймера

Последовательность праймеров

диальной пункции с помощью инсулинового

(5′-3′)

шприца на 1 мл, кровь немедленно помещали в

пробирки на 15 мл, содержащие 5 мкл 0,5 М ЭДТА,

β актин for

AGTGTGACGTTGACATCCGTA

и тщательно перемешивали с 2 мл реагента

β актин rev

GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT

Trizol. Тотальную РНК выделяли методом, опи

TrkA for

GCCTAACCATCGTGAAGAGTG

санным ниже.

TrkA rev

CCAACGCATTGGAGGACAGAT

Культивирование эукариотических клеток.

Первичная культура эндотелиальных клеток

TrkB for

TGGGACGTTGGGAATTTGGT

мыши была любезно предоставлена В.Ю. Сысо

TrkB rev

AGTTGGCGCAAAATGCACAG

евой (лаборатория морфогенеза и репарации

TrkC for

AGCCACGTCAACCTGACTG

тканей, МГУ имени М.В. Ломоносова). Клетки

TrkC rev

CCTCGCTCGTCACGTTCAC

культивировали в среде EGM 2

(«Lonza»,

p75NTR for

ACCCTGCCTGGACAGTGTTA

Швейцария). Для оценки влияния PTZ на

экспрессию Ntrk1, Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr клетки

p75NTR rev

AGAACACGAGTCCTGAGCCC

мышиного эндотелия инкубировали с PTZ в ко

mmu mir 128 3p for

AACAAGCAGTGAACCGGTCTCT

нечной концентрации 20 мM [38, 39] в тече

AACAAGTAGCACCATCTGA

mmu mir 29a 3p for

ние 1, 3 и 6 ч.

AACAAGTCACAGTGGCTAAGT

mmu mir 27a 3p for

Выделение РНК, обратная транскрипция и

mmu mir 381 3p for

AACAAGACAAGGGCAAGCT

ПЦР в реальном времени. Тотальную РНК выде

ляли из замороженной ткани мозга, крови и эн

mmu mir 9 5p for

AACAAGGGTTATCTAGCTGT

дотелиальных клеток с помощью реагента

SNORD68 for

AACACGCTGATGACATTCTCCG

Trizol («Invitrogen», США) в соответствии с про

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1516

ШМАКОВА и др.

с помощью планшета

«Mouse Neurological

дерегулированных микроРНК по базе данных

Development & Disease» ТМ («Qiagen», США),

miRTarBase, по функциональной принадлеж

который позволяет анализировать 84 дифферен

ности (генная онтология биологические про

циально экспрессируемых микроРНК в процес

цессы (Gene ontology:biological processes,

се развития нейронов или в ходе прогрессии

GO:BP) и пути KEGG (Киото энциклопедия ге

неврологических заболеваний. Расположение

нов и геномов)), проводился с использованием

анализируемых микроРНК на планшете пред

онлайн инструмента g:Profiler (https://biit.cs.

ставлено на рис. 1 в Приложении. В качестве

ut.ee/gprofiler/gost) [41]. Анализ обогащения по

матрицы использовали тотальную РНК из об

транскрипционным факторам осуществляли с

разцов ткани гиппокампа контрольной мыши и

использованием программы GSEA 4.1.0 [42] и

мыши через 3 ч после введения PTZ. Для обрат

базы данных, полученной из TransMiR v2.0

ной транскрипции использовали 2 мкг тоталь

(http://www.cuilab.cn/transmir) [43]. Поиск мик

ной РНК и набор miScript II RT kit («Qiagen»).

роРНК, регулирующих нейротрофины, рецеп

Условия проведения ПЦР включали преддена

торы нейротрофинов, Bcl 2 и Bax, осуществля

турацию при 95 °С 15 мин, далее 40 циклов ам

ли по базам данных miRTarBase (http://mirtar

плификации (денатурация 15 с при 94 °С, отжиг

base.cuhk.edu.cn/)

[44], miRDB (http://www.

с праймерами 15 с при 55 °С и элонгация 30 с

mirdb.org/mining.html) [45] и TargetScanMouse

при 70 °С). Относительный уровень транскрип

(http://www.targetscan.org/mmu_72/) [46].

та рассчитывали с использованием мето

Приготовление лизатов ткани мозга, электро!

да 2-ΔΔCt, рассчитывая геометрическое среднее

форез в полиакриламидном геле и Вестерн!блот!

по четырём малым ядрышковым РНК, выступа

тинг. Ткань мозга лизировали в ледяном буфере

ющим в качестве референсных (SNORD68,

для лизиса RIPA (150 мМ NaCl, 25 мМ Tris HCl,

SNORD72, SNORD95, SNORD96).

0,5% дезоксихолата натрия, 1% Nonidet P 40,

Экспрессию выбранных микроРНК подтвер

0,1% SDS, pH 7,4), содержащем коктейль инги

ждали дополнительно с помощью ПЦР в реаль

биторов протеаз («Thermo Fisher Scientific»). Для

ном времени. В качестве матрицы использовали

лизирования 10 мг ткани мозга использовали

тотальную РНК из образцов ткани гиппокампа

100 мкл буфера RIPA. Ткань мозга гомогенизи

4 х контрольных мышей и 4 х мышей через 3 ч

ровали путём ручного измельчения холодным

после введения PTZ. Обратную транскрипцию

пестиком и пропускания 10 раз через иглу 27G

проводили, как описано ранее. Условия прове

инсулинового шприца. Лизаты инкубировали

дения ПЦР включали предденатурацию при

20 мин на льду, периодически перемешивая, да

95 °С 15 мин, далее 40 циклов амплификации

лее центрифугировали при +4 °С в течение

(денатурация 15 с при 94 °С, отжиг с праймера

20 мин при 16 000 g. Супернатант переносили в

ми 15 с при 51-58 °С в зависимости от пары

новую предварительно охлажденную пробирку,

праймеров и элонгация 30 с при 70 °С). Исполь

осадок клеток выбрасывали. 5 мкл супернатан

зованные в работе праймеры к микроРНК мы

та, разведенного 1/1000, использовали для коли

ши («Евроген») приведены в табл. 1. В качестве

чественной оценки концентрации белка по ме

обратных праймеров мы использовали коммер

тоду Бредфорда («BioRad»), после чего образцы

чески доступные праймеры 10x miScript universal

смешивали с равным объемом 2 кратного буфе

primer из набора miScript SYBR® Green PCR

ра Лэммли, содержащего 10% меркаптоэтанолa,

Kit («Qiagen»). Относительный уровень тран

и нагревали при 95 °C в течение 10 мин. Бел

скрипта рассчитывали с использованием мето

ки (40 мкг/дорожка) разделяли в 10% ном SDS

да 2-ΔΔCt, с SNORD68 в качестве референса; нор

PAGE и переносили на PVDF мембрану («GE

мализацию проводили, принимая за единицу

Healthcare», США) в буфере для перено

средний уровень каждого транскрипта в кон

са (1,92 М Tris/глициновый буфер, 0.1% SDS,

троле.

20% метанол). Неспецифическое связывание бло

Анализ обогащения мишеней дерегулиро

кировали в 5% ном обезжиренном сухом молоке

ванных микроРНК проводился с использовани

в фосфатно солевом буфере PBS, («Sigma Aldrich»,

ем инструмента MIENTURNET (http://userver.

США), содержащем 0,1% (v/v) Tween 20 при

bio.uniroma1.it/apps/mienturnet/) [40] (база дан

+4 °C в течение ночи. Мембраны инкубировали

ных miRTarBase, в которую включены экспери

в течение 2 ч при комнатной температуре со сле

ментально подтверждённые мишени мик

дующими первичными антителами (все разведе

роРНК) c порогом минимального количества

ния 1/1000): мышиные анти Bax («Santa Cruz»,

взаимодействий микроРНК-ген мишень - 2 и

США) и мышиные анти Bcl 2 («Santa Cruz»).

порогом для скорректированного значения

Мембраны промывали PBS, содержащим

p (метод FDR) - 0,05. Анализ обогащения набо

0,1% (v/v) Tween 20, и инкубировали с соответ

ра генов, являющихся мишенями минимум двух

ствующими вторичными антителами («Imtek»,

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1517

Россия), конъюгированными с пероксидазой, в

F_3,12 = 11,10, p = 0,0039 и p = 0,0113 соответ

разведении 1/10 000 при комнатной температуре

ственно). В задней коре в исследуемых проме

в течение 1,5 ч с последующей промывкой в

жутках времени после индукции судорог уро

PBS, содержащем 0,1% (v/v) Tween 20. Белки

вень экспрессии Ntrk2 не изменялся (рис. 1, б,

визуализировали с использованием хемилюми

F_3,13 = 2,027). В гиппокампе наблюдалось двух

несцентного субстрата SuperSignal West

фазное повышение мРНК Ntrk2 через 1 и 6 ч

Dura («Thermo Fisher Scientific») и системы

после индукции судорожной активнос

ChemiDoc™ XRS+ («Bio Rad»). Денситометри

ти (рис. 1, в, F_3,17 = 9,927, p = 0,0073 и p = 0,0028

ческий анализ блотов проводили в ImageJ.

соответственно).

Статистический анализ. Данные анализиро

Было обнаружено, что экспрессия

вали с помощью программного обеспечения

мРНК Ntrk3 (TrkС) активировалась через 1, 3 и

GraphPad Prism 8.4.3 (GraphPad Software Inc.,

6 ч после введения PTZ, при этом характер его

США). Данные представлены как среднее зна

активации различался в исследуемых областях

чение ± стандартная ошибка среднего (SEM).

мозга - передняя кора, задняя кора, гиппо

Непарный t тест Стьюдента с нулевой гипоте

камп (рис. 2). В передней коре и гиппокампе по

зой о равных средних в двух выборках использо

вышение мРНК Ntrk3 наблюдалось через 3 ч

вался для сравнения данных между двумя груп

после индукции судорожной активнос

пами. Различия между несколькими группами

ти (рис. 2, а, F_3,16 = 14,66, p = 0,0009; рис. 2, в,

определяли, используя односторонний диспер

F_3,17 = 14,36, p < 0,0001 соответственно). В зад

сионный анализ (ANOVA) с нулевой гипотезой

ней коре уровень экспрессии гена Ntrk3 возрас

о равных средних между группами. Тест исполь

тал уже через 1 ч после индукции судорожной

зует распределение Фишера-Снедекора (F рас

активности (рис. 2, б, F_3,17 = 10,24, p = 0,0017 и

пределение), и когда значение F было критичес

F_3,16 = 3,439, p = 0,0334 соответственно) и оста

ким (уровень значимости p < 0,05), сравнения

вался повышенным спустя 3 ч (p = 0,0014 и

каждой экспериментальной группы с контролем

p = 0,0434 соответственно) и 6 ч после судо

дополнительно анализировали с использовани

рог (p = 0,0003).

ем апостериорного теста Даннета для анализа

Экспрессия мРНК Ngfr (p75NTR) также бы

множественных сравнений. В тексте приведены

ла активирована в те же сроки в передней коре,

значения F, межгрупповое и внутригрупповое

задней коре и гиппокампе (рис. 3). Профиль

число степеней свободы и уровень значимости p

экспрессии мРНК Ngfr различался между иссле

апостериорных тестов. Сравнение экспрессии

дованными областями мозга. В передней коре и

Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr в отделах головного мозга

в гиппокампе экспрессия гена Ngfr индуцирова

проводили с помощью двухфакторного диспер

лась через 3 ч после индукции судорожной ак

сионного анализа (2 way ANOVA) с использова

тивности (рис. 3, а, F_3,14 = 8,948, p = 0,0179 и

нием апостериорного теста Тьюки (для сравне

рис. 3, в, F_3,15 = 19,52, p < 0,0001 соответствен

ния нескольких групп). Соотношение Bcl 2/Bax

но). Ранняя активация наблюдалась в задней

сравнивали с помощью 2 way ANOVA с исполь

коре головного мозга через 1 ч после индукции

зованием апостериорного теста Холма-Сида

судорожной активности (рис. 3, б, F_3,17 = 9,859,

ка (для сравнения двух групп). Критическим

p = 0,0441), экспрессия оставалась повышенной

уровнем значимости считали p < 0,05.

через 3 ч (p = 0,0006) и через 6 ч (p = 0,0005) пос

ле введения PTZ.

Значимых изменений в экспрессии

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

мРНК Ntrk1 (TrkA) в передней коре (F_3,16 =

= 0,3484) и задней коре (F_3,17 = 3,839, апостериор

Пространственный и временной профиль

ный тест Даннета p > 0,05) в течение 1-6 ч после

экспрессии мРНК Ntrk1, Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr в го!

индукции судорожной активности нейронов не

ловном мозге мышей при индукции судорожной

наблюдалось (рис. 4). Экспрессия мРНК Ntrk1 в

активности. Оценка экспрессии мРНК рецепто

гиппокампе была на нерепрезентативно низком

ров нейротрофинов (TrkA, TrkB, TrkC, p75NTR)

уровне, в связи с чем данные не приводятся.

была проведена на ранних сроках после индук

Чтобы подтвердить, что изменения в

ции судорог (1, 3 и 6 ч после введения PTZ), так

экспрессии генов Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr не обуслов

как ранее на этой модели нами было показано,

лены клетками крови и клетками сосудов голов

что пик ранней активации генов происходит че

ного мозга, а соответствуют ткани мозга, мы

рез 3 ч после судорог [21].

проанализировали уровень экспрессии тех же

Было обнаружено, что экспрессия мРНК

генов в крови и мышином эндотелии в соответ

Ntrk2 существенно возрастает через 3 и 6 ч после

ствующие моменты времени. Экспрессия Ntrk3

введения PTZ в передней коре (рис. 1, а,

и Ngfr в крови мышей не изменялась через 3-6 ч

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1518

ШМАКОВА и др.

Рис. 1. Изменения экспрессии мРНК Ntrk2 (TrkB) после введения пентилентетразола (PTZ): в передней коре (а), в задней

коре (б), в гиппокампе (в). 0 ч - контрольные мыши. ANOVA, апостериорный тест Даннета * p < 0,05, ** p < 0,01. Данные

представлены как среднее значение экспрессии ± стандартная ошибка среднего (SEM), точки отражают индивидуальные

независимые биологические повторности (разные животные)

после PTZ индуцированных судорог (F_2,9 = 1,036

шей степени происходила индукция Ngfr, регу

и F2,10 = 3,701, рис. 2, а и b соответственно

лирующего гибель (2 way ANOVA, 3 и 6 ч Ntrk3

в Приложении). Обработка первичной культуры

против Ngfr и Ntrk2 против Ngfr, p < 0,0001)

клеток мышиного эндотелия PTZ также не вли

(рис. 5). В гиппокампе основная волна индук

яла на экспрессию Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr

ции экспрессии рецепторов нейротрофинов бы

(рис. 2, c-e соответственно в Приложении).

ла короче и приходилась на 3 ч, где возрастала

В связи с этим мы имеем основания полагать,

экспрессия как Ntrk3, так и Ngfr (2 way ANOVA,

что увеличение экспрессии Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr

3 ч Ntrk3 против Ntrk2 и Ngfr против Ntrk2,

происходит непосредственно в ткани мозга.

p < 0,0001). Чтобы понять, коррелируют ли на

Таким образом, мы показали, что в достаточ

блюдаемые нами изменения экспрессии рецеп

но короткие сроки (1-6 ч) после введения PTZ в

торов нейротрофинов с соответствующей кле

передней, задней коре головного мозга и гиппо

точной сигнализацией в разных отделах голов

кампе мышей индуцируется экспрессия генов

ного мозга в те же сроки (3 и 6 ч), мы далее про

рецепторов нейротрофинов Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr,

вели анализ экспрессии белков Bcl 2 и Bax -

что отражает их участие в регуляции функцио

внутриклеточных сигнальных эффекторов вы

нирования нервной ткани в ответ на стимулиро

живаемости и гибели клеток.

ванную активность. Примечательно, что дина

Оценка сигнального пути с участием белков

мика изменения экспрессии рецепторов ней

апоптоза Bcl!2 и Bax в головном мозге после ин!

ротрофинов различалась между исследуемыми

дукции судорожной активности. В процессах,

отделами головного мозга: если в передней коре

опосредующих пластические реакции и выжи

через 3-6 ч в большей степени происходила ин

ваемость нейронов, внутриклеточная сигнали

дукция Ntrk2 (2 way ANOVA, 3 и 6 ч Ntrk2 против

зация через TrkB и TrkC сопряжена, в частнос

Ntrk3 и Ntrk2 против Ngfr, p < 0,0001), описанной

ти, с увеличением экспрессии анти апоптоти

функцией которого является регуляция выжи

ческого белка Bcl 2 и/или увеличением соотно

ваемости, то в задней коре через 3-6 ч в боль

шения Bcl 2/Bax [47-49]. Напротив, снижение

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1519

соотношения Bcl 2/Bax отражает запуск нейро

Мы также проанализировали соотношение

нальной гибели, что характерно для сигнализа

Bcl 2/Bax, которое может определять выживае

ции p75NTR [50]. Поэтому далее мы оценили

мость клеток [48, 51, 52]. Оказалось, что это со

изменение содержания Bcl 2 и его адаптерного

отношение возрастает в передней и задней коре

про апоптотического белка Bax в передней,

после индукции генерализованной судорожной

задней коре и в гиппокампе через 3 и 6 ч после

активности (2 way ANOVA 0 ч, 3 ч: фактор вре

PTZ индуцированных судорог (рис. 6). Через

мени F_1,8 = 36,73; фактор зоны головного мозга

3 ч после индукции экспрессия Bcl 2 в трёх ана

F_2,8 = 31,58; взаимодействие F_2,8 = 10,34; тест

лизируемых отделах головного мозга практи

Холма-Сидака 0 ч против 3 ч передняя кора

чески не изменялась (рис. 6, а; рис. 3, а в При

p = 0,0019, задняя кора p = 0,0019, гиппокамп

ложении). Экспрессия Bax, напротив, снижа

p = 0,8777), что отражает сдвиг к сигналу о «вы

лась через 3 ч в передней и задней коре, но не в

живании», но практически не изменяется в гип

гиппокампе, по сравнению с контролем

покампе (рис. 6, б и г).

(рис. 6, а; рис. 3, а в Приложении). Через 6 ч

Эти данные указывают на то, что прямой

после активации нейронов наблюдалась боль

корреляции между экспрессией мРНК рецепто

шая вариативность между образцами нервной

ров нейротрофинов и сигнализацией выживае

ткани. Но в среднем экспрессия Bcl 2 возраста

мости в ранние сроки не прослеживается. В пе

ла в передней и задней коре и практически не

редней коре происходит существенная и преи

изменялась в гиппокампе; экспрессия Bax через

мущественная индукция Ntrk2, что согласуется

6 ч практически не изменялась в трёх анализи

со значительным увеличением соотношения

руемых отделах головного мозга (рис. 6, в;

Bcl 2/Bax. В задней коре в большей степени воз

рис. 3, b в Приложении).

растает экспрессия Ngfr, однако происходит

Рис. 2. Изменения экспрессии мРНК Ntrk3 (TrkС) после введения пентилентетразола (PTZ): в передней коре (а), в задней

коре (б), в гиппокампе (в). 0 ч - контрольные мыши. ANOVA, апостериорный тест Даннета ** p < 0,01, *** p < 0,001,

**** p < 0,0001. Данные представлены как среднее значение экспрессии ± стандартная ошибка среднего (SEM), точки от

ражают индивидуальные независимые биологические повторности (разные животные)

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1522

ШМАКОВА и др.

также увеличение экспрессии Ntrk3, который,

релаксина (рис. 7, в). Семейство релаксина

предположительно, может быть функционально

включает разные активные сигнальные пепти

значимым и способствует активации соответ

ды, синтезируемые в разных органах, в частнос

ствующего сигналинга, что выражается в повы

ти, релаксин 3 синтезируется в нейронах и мо

шении соотношения Bcl 2/Bax. Напротив, в

дулирует стресс ответ, метаболизм и поведен

гиппокампе через 3 ч одинаково индуцируют

ческие реакции [55].

ся Ntrk3 и Ngfr, но конечное соотношение Bcl 2/

Мы также проанализировали обогащение по

Bax не изменяется, что может говорить о том,

транскрипционным факторам и выявили 22 по

что сигналы от Ntrk3 и Ngfr «уравновешивают»

тенциальных транскрипционных фактора, ко

друг друга, либо их индукция не является функ

торые могут регулировать экспрессию мик

ционально значимой, либо в регуляцию клеточ

роРНК на раннем этапе нейрональной актив

ного ответа гиппокампа вовлечены другие меха

ности (рис. 7, г; рис. 5 в Приложении).

низмы. Так как известно, что микроРНК могут

Известно, что микроРНК могут служить

участвовать в пост транскрипционной регуля

своеобразными буферами, уравновешиваю

ции экспрессии генов [53], в том числе генов ре

щими скачки активации транскрипции генов

цепторов нейротрофинов [54], мы предположи

[56], поэтому их ранняя индукция при судорож

ли, что в гиппокампе могут быть задействованы

ной активности может быть важна для гомеоста

дополнительные механизмы регуляции нейро

тического контроля экспрессии индуцируемых

нального ответа на возбуждение и повреждение,

генов. В связи с этим мы предположили, что

связанные с микроРНК. Поэтому далее мы про

нейротрофины и рецепторы нейротрофинов,

анализировали экспрессию микроРНК в норме

экспрессия которых возрастает через 1-3 ч и да

и через 3 ч после судорожной активации нейро

лее падает до первоначального уровня к 6 ч в

нов в гиппокампе.

гиппокампе после введения PTZ, могут быть

Оценка профиля экспрессии микроРНК в гип!

мишенями этих микроРНК. В результате поиска

покампе мышей при судорожной активности. Для

в базах данных мишеней микроРНК мы обнару

анализа экспрессии микроРНК мы выбрали

жили, что TrkB и TrkC могут быть мишенью 8 де

временной интервал 3 ч и зону гиппокампа, где

регулированных микроРНК, p75NTR - 2 мик

наблюдалась значительная индукция экспрес

роРНК, NGF - 3 микроРНК, BDNF - 6 мик

сии Ntrk3 и Ngfr. Мы проанализировали

роРНК, Bcl 2 - 5 микроРНК, Bax - 1 мик

экспрессию 84 микроРНК, наиболее изученных

роРНК (табл. 2). TrkA, нейротрофины NT 3

в контексте нейробиологии (рис. 1 в Приложе

и NT 4/5 не были обнаружены в качестве мише

нии). Мы обнаружили, что через 3 ч после PTZ

ней индуцированных микроРНК. Таким обра

индуцированной активации нейронов происхо

зом, в гиппокампе ранняя волна индукции

дит индукция экспрессии основной части ис

экспрессии генов TrkB (через 1 ч), TrkC и

следуемых микроРНК (рис. 7, а). Из 84 проана

p75NTR (через 3 ч) коррелирует с индукцией ря

лизированных микроРНК экспрессия 43 (51%)

да микроРНК, нацеленных на подавление этих

повышалась как минимум в 2 раза, и экспрессия

генов, что может объяснять последующее сни

только одной микроРНК снизилась более чем в

жение уровня транскрипции этих генов до их

2 раза (рис. 7, б).

базовых значений и отсутствие значимого изме

Анализ обогащения мишеней микроРНК

нения соотношения Bcl 2/Bax. Это может отра

выявил 105 генов, являющихся мишенями как

жать механизм «уравновешивания» генного от

минимум двух дерегулированных микроРНК, и

вета. Базы данных, являющиеся источником

64 гена, являющихся мишенями трёх и более де

указанных взаимодействий микроРНК-ми

регулированных микроРНК (рис. 4 в Приложе

шень, и их предсказательные оценки указаны в

нии). Анализ обогащения этих генов по функ

таблице в Приложении.

циональным и метаболическим характеристи

Для подтверждения полученных результатов

кам показал высокую представленность таких

и нашей гипотезы о ко индукции микроРНК и

биологических процессов (GO:BP), как: сиг

генов мишеней, мы проанализировали в гиппо

нальный путь рецепторных тирозинкиназ, акти

кампе экспрессию микроРНК, мишенями кото

вируемых коллагеном; ангиогенез; организация

рых могут быть TrkB (mmu miR 128 3p),

внеклеточного матрикса; дифференцировка

TrkC (mmu miR 29a 3p, mmu miR 9 5p, mmu

клеток; клеточный стресс ответ на кислотные

miR 128 3p, mmu miR 381 3p) и p75NTR

химические вещества. Анализ обогащения этих

(mmu miR 128 3p, mmu miR 27a 3p) (рис. 8).

генов по KEGG путям показал перепредстав

Нами было обнаружено достоверное увеличе

ленность путей фокальной адгезии, взаимодей

ние экспрессии mmu miR 29a 3p (t₆ = 3,599,

ствия рецепторов с внеклеточным матриксом,

p = 0,0114, рис. 8, а) и mmu miR 9 5p (t₆ = 2,711,

сигнального пути PI3K Akt, сигнального пути

p = 0,0351, рис. 8, б) в гиппокампе через 3 ч пос

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1523

Рис. 7. Оценка изменения микроРНК в гиппокампе через 3 ч после индукции судорожной активности. Оценку уровня

экспрессии проводили на планшете «Mouse Neurological Development & Disease» (№ MIMM 107ZA). а - Тепловая карта

уровня экспрессии 84 микроРНК. Красным цветом обозначены микроРНК, экспрессия которых повысилась; зеленым

цветом обозначены микроРНК, экспрессия которых снизилась; серым цветом обозначены микроРНК, экспрессия кото

рых находится на предельно низком уровне как в экспериментальном, так и в контрольном образце (Сt > 35 цикла). Цве

товая градация тепловой карты соответствует изменению уровня экспрессии микроРНК, выраженного как соотношение

нормализованной экспрессии гена в экспериментальном образце к нормализованной экспрессии гена в контрольном об

разце (2-ΔΔCt). б - Список микроРНК, экспрессия которых изменялась более, чем в 2 раза. в - Анализ обогащения генов,

являющихся мишенями как минимум двух дерегулированных микроРНК, относящихся к генам, участвующим в регуля

ции функционального состояния и метаболизма клеток (генная онтология: биологические процессы (Gene ontology: bio

logical processes, GO:BP) и к генам, участвующим в путях базы данных KEGG (Киото энциклопедия генов и геномов)).

г - Анализ обогащения транскрипционных факторов, регулирующих микроРНК

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1524

ШМАКОВА и др.

Таблица 2. Гены мишени для микроРНК, экспрессия которых увеличивается в гиппокампе не менее чем в 2 раза через 3 ч

после введения PTZ

МикроРНК

Уровень увеличения экспрессии

TrkB

TrkC

p75NTR

NGF

BDNF

Bcl 2

Bax

Ntrk2

Ntrk3

Ngfr

Ngf

Bdnf

Bcl2

Bax

mmu miR 101a 3p

9,28

mmu miR 135b 5p

7,24

mmu miR 19b 3p

6,25

mmu miR 22 3p

5,86

mmu miR 140 5p

4,93

mmu miR 381 3p

4,50

mmu miR 15a 5p

4,12

mmu miR 29b 3p

3,82

mmu miR 338 3p

3,46

mmu miR 27a 3p

3,40

mmu miR 29c 3p

3,01

mmu miR 20b 5p

2,87

mmu miR 339 5p

2,49

mmu miR 9 5p

2,47

mmu miR 98 5p

2,47

mmu miR 29a 3p

2,41

mmu miR 24 3p

2,39

mmu miR 30e 5p

2,37

mmu miR 138 5p

2,30

mmu miR 128 3p

2,09

mmu miR 34a 5p

2,03

mmu miR 126a 5p

2,02

mmu miR 195a 5p

2,02

mmu miR 181a 5p

2,00

Примечание. Знаком + обозначены микроРНК, регулирующие соответствующий ген. TrkA, нейротрофины NT 3 и NT

4/5 не были обнаружены в качестве мишеней индуцированных микроРНК. Поиск мишеней микроРНК осуществляли по

базам данных miRTarBase, miRDB и TargetScan.

ле индукции судорог по сравнению с контролем.

гиппокампе мозга мышей. Обнаружено, что

Мы также обнаружили тенденцию к увеличению

экспрессия Ntrk2 возрастает в передней коре че

экспрессии mmu miR 128 3p (t₆

1,463,

рез 3-6 ч, а в гиппокампе индукция экспрессии

= 0,1939, рис.

8, в) и mmu miR 27a 3p

этого гена наблюдается через 1 и 6 ч; экспрес

(t₆ = 1,818, p = 0,1189, рис. 8, г), которая не была

сия Ntrk3 и Ngfr возрастает во всех исследован

статистически значимой ввиду большого раз

ных областях головного мозга через

ч,

броса экспрессии между животными. Мы не об

экспрессия Ntrk1 значимо не изменяется. Такая

наружили значимых изменений в экспрессии

ранняя индукция экспрессии Ntrk2, Ntrk3 и Ngfr

mmu miR 381 3p (t₆ = 1,186, p = 0,2805, рис. 8, д).

характеризует их как гены, входящие в волну

раннего генного ответа на нейрональную актив

ность, что, как правило, связано с вовлечением

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

подобных генов в механизмы нейрональной

пластичности [57].

В настоящей работе был исследован тран

Рецепторы нейротрофинов являются важ

скрипционный ответ генов рецепторов нейро

ным звеном патогенеза в развитии эпилеп

трофинов на PTZ индуцированную судорож

сии [58], однако их функциональная роль в ней

ную активность в передней и задней коре и в

ронах при эпилептических состояниях неодноз

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1525

начна. Об изменении экспрессии рецепторов

активности не происходит изменения экспрес

нейротрофинов после судорог неоднократно со

сии и соотношения Bcl 2/Bax, определяющего

общалось ранее [6-8]. Активация рецепторов

выживаемость нейронов [51]. Не исключено,

Trk связана с выживанием, дифференцировкой

что такое различие может определять более вы

нейронов [4, 5] и снижением предрасположен

сокую предрасположенность нейронов гиппо

ности к судорогам [59, 60]. Напротив, активация

кампа к гибели в результате судорожной актив

низкоаффинного рецептора p75NTR вызывает

ности по сравнению с корковыми нейрона

апоптотическую гибель нейронов [4, 61] и мо

ми [63, 64].

жет приводить к повышенной возбудимости

Падение экспрессии рецепторов нейротро

нейронов, что обусловливает предрасположен

финов в гиппокампе до контрольных значений

ность к судорогам [62]. Экспериментальные до

уже к шести часам после индукции судорог мо

казательства индукции экспрессии TrkC при ге

жет указывать на то, что их экспрессия негатив

нерализованной судорожной активности проти

но регулируется микроРНК, мишенями кото

воречивы: так, в зависимости от различных спо

рых они являются. Кроме того, отсутствие ран

собов индукции судорог динамика экспрессии

него запуска сигнала о «выживании» в гиппо

TrkC в зубчатой извилине гиппокампа может

кампе может также быть связано с индукцией

варьироваться в течение 2-12 ч [28-30]. Наши

микроРНК, мишенями которых являются ней

исследования показали, что экспрессия

ротрофины и их высокоаффинные рецепторы.

мРНК Ntrk3 варьируется между отделами и че

Так как известно, что экспрессия генов нейро

рез 3 ч после индукции судорог достигает мак

трофинового семейства может находиться под

симальных значений в гиппокампе - в 3 раза

контролем микроРНК [54], то далее мы проана

больше по сравнению с интактным мозгом, при

лизировали экспрессию микроРНК в норме и

этом высокие значения Ntrk3 наблюдаются в пе

через 3 ч после PTZ индуцированной актива

риод 1-6 ч после индукции судорог. При этом в

ции нейронов в гиппокампе.

гиппокампе, в отличие от передней и задней ко

При анализе экспрессии 84 микроРНК в

ры, через 3 и 6 ч после индукции судорожной гиппокампе через 3 ч после введения PTZ мы

Рис. 8. Анализ экспрессии выбранных микроРНК после индукции генерализованной судорожной активности в гиппо

кампе. 0 ч - контрольные мыши. * p < 0,05, t тест Стьюдента. Данные представлены как среднее значение экспрес

сии ± стандартная ошибка среднег (SEM), точки отражают индивидуальные независимые биологические повторности

(разные животные)

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1526

ШМАКОВА и др.

наблюдали индукцию 43 микроРНК (повыше

контроле над экспрессией индуцируемых генов

ние экспрессии как минимум в 2 раза), и

(например, обнаруженной нами индукци

экспрессия одной микроРНК снизилась более

ей Ntrk3), что необходимо для тонкой баланси

чем в 2 раза. Примечательно, что значимая ин

ровки процессов транскрипции. В работе

дукция наблюдалась у двух микроРНК - mmu

Fiorenza et al. [80] было показано, что у мышей с

miR 29a 3p и mmu miR 9 5p. Для этих мик

индуцибельным нокаутом Dicer (нуклеаза, отве

роРНК описан целый ряд эффектов в нервной

чающая за образование микроРНК) отмечаются

системе: известно изменение их экспрессии в

большая подверженность индуцированным су

ряде нейродегенеративных заболеваний (бо

дорогам и нейродегенерация. Через 2 ч после су

лезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона, боковой

дорог у Dicer нокаутных мышей уровни мРНК

амиотрофический склероз и др.) [65-68], об

непосредственных ранних генов были гораздо

суждается возможность использования мик

выше, чем у контрольных мышей, что подтвер

роРНК 29а и микроРНК 9 в качестве биомар

ждает гипотезу о том, что ранняя экспрессия

кёров некоторых патологий, например, болезни

микроРНК в ответ на нейрональную активацию

Альцгеймера [69]. Есть работы, указывающие на

важна для «приглушения» транскрипционного

протективную функцию этих микроРНК в го

ответа. Наблюдавшееся нами падение экспрес

ловном мозге: было показано, что экспрессия

сии рецепторов нейротрофинов в гиппокампе

микроРНК 9 подавляет накопление белка про

до контрольных значений уже к 6 ч после индук

герина в нейронах и снижает его токсический

ции судорог может относиться к такому случаю

эффект при синдроме Гетчинсона-Гилфор

регуляции. Помимо этого, известно, что мик

да [70, 71], а потеря экспрессии микроРНК 29а

роРНК могут вызывать репрессию трансляции

в головном мозге мышей вызывает массивную

своих мишеней [81], поэтому индукция мик

апоптотическую гибель клеток в гиппокампе и

роРНК mmu miR 9 5p, предсказанной ми

мозжечке и выраженную атаксию [72]. При этом

шенью которой является tPA, может объяснить

мишенями микроРНК 29 в нейронах могут

ранее отмеченное нами отсутствие изменения

быть как анти апоптотические, так и про апоп

экспрессии тканевого активатора плазминоге

тотические белки семейства Bcl 2 [73]. На моде

на tPA на уровне белка при значительной индук

ли депрессии у крыс показано участие мик

ции его на уровне мРНК [21].

роРНК 9 в снижении соотношения Bcl 2/Bax и

Таким образом, полученные нами данные

апоптозе нейронов [74].

свидетельствуют о том, что судорожная нервная

При судорогах описано изменение уровней

активность способна запускать дифференци

целого ряда микроРНК [75, 76], тем не менее

альную регуляцию генов рецепторов нейротро

информация о микроРНК 29а и микроРНК 9 в

финов и микроРНК, сцепленных с функциями

контексте PTZ индуцированных судорог встре

выживания нейронов и их адаптацией к клеточ

чается редко. Изменение экспрессии mmu

ному стрессу. При этом в клетках коры головно

miR 29a 3p (как увеличение, так и снижение)

го мозга, но не в гиппокампе, происходит за

наблюдалось на модели судорог у мышей и

пуск гомеостатических каскадов выживаемости

крыс в сроки от 6 ч до 1 недели [76-78]. Повы

с участием белков Bcl 2 и Bax, что может обус

шение mmu miR 9 5p было описано только че

ловливать более высокий риск клеточной гибе

рез 3 дня после эпилептического статуса у мы

ли у нейронов гиппокампа по сравнению с ко

шей в зубчатой извилине [78]. Наши данные по

рой. В совокупности результаты нашего иссле

казывают, что индукция этих микроРНК может

дования привлекают большее внимание к регу

происходить в гораздо более ранние сроки (3 ч)

ляции экспрессии генов нейротрофиновых ре

после генерализованной судорожной активнос

цепторов и регуляторных микроРНК на ранних

ти, что указывает на их возможное участие в

сроках после эпизодов нейрональной актива

развитии раннего клеточного ответа на судоро

ции. При этом наблюдавшаяся нами индукция

ги и регуляции процессов нейрональной выжи

экспрессии Ntrk2, Ntk3 и Ngfr как в передней и

ваемости.

задней коре, так и в гиппокампе, может гово

Идентификация ранних транскрипционных

рить о том, что индукция экспрессии генов ре

факторов, отвечающих за индукцию микроРНК

цепторов нейротрофинов является достаточно

при нейрональной активации, требует дальней

универсальным ранним ответом на нейрональ

шего изучения, т.к. классические ранние тран

ную активность в разных отделах головного

скрипционные факторы c Fos, c Jun, Egr 1 [79]

мозга. Задачи, актуальные в этой области для

не были перепредставлены в нашем анализе

последующего изучения, включают определе

транскрипционных факторов. Ранняя индукция

ние точных сроков начала транскрипции генов

mmu miR 29a 3p и mmu miR 9 5p в ткани гип

рецепторов нейротрофинов после активации

покампа предполагает их возможное участие в

нейронов и зависимость этой индукции от

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1527

de novo синтеза белка, т.е. соответствие этих ге

Соблюдение этических норм. Все примени

нов критериям непосредственных ранних генов

мые международные, национальные и/или ин

в данной ситуации [82-84]. Другим важным

ституциональные принципы ухода и использо

вопросом для будущих исследований будет со

вания животных были соблюдены. Исследова

отношение регуляции нервной активностью ге

ние было проведено в соответствии с Директи

нов нейротрофиновых рецепторов и генов са

вой 2010/63/EU Европейского парламента и Со

мих нейротрофинов, для некоторых из которых

вета Европейского союза по охране животных,

показана индукция в роли непосредственных

используемых в научных целях. Условия содер

ранних генов [85, 86].

жания животных и экспериментальные проце

дуры одобрены Комиссией по биоэтике МГУ

имени М.В. Ломоносова.

Финансирование. Исследование выполнено

Дополнительные материалы. Приложение к

при поддержке Министерства науки и высшего

статье на английском языке опубликовано на

образования Российской Федерации (грант

сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) (http://

№ 075 15 2020 801).

protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) и на сайте изда

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

тельства Springer (www.springer.com/journal/

сутствии конфликта интересов.

10541), том 86, вып. 10, 2021.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Chao, M. V. (2003) Neurotrophins and their receptors: a

генных лигандов в развитии головного мозга и фор

convergence point for many signalling pathways, Nat. Rev.

мировании когнитивных функций, Российский физио'

Neurosci., 4, 299 309, doi: 10.1038/nrn1078.

логический журнал им. И.М.Сеченова, 102, 881 903.

Mitre, M., Mariga, A., and Chao, M. V.

(2017)

12.

Шмакова А. А., Балацкий А. В., Кулебякина М. А., Ша

Neurotrophin signalling: Novel insights into mechanisms

уб Т., Карагяур М. Н., и др. (2021) Гиперэкспрессия ге

and pathophysiology, Clin. Sci., 131, 13 23, doi: 10.1042/

на рецептора урокиназы uPAR в головном мозгу мыши

CS20160044.

стимулирует миграцию нейронов в кору в эмбриогене

Teng, K. K., Felice, S., Kim, T., and Hempstead, B. L.

зе, Онтогенез, 52, 68 79, doi: 10.31857/S0475145021010067.

(2010) Understanding proneurotrophin actions: recent

13.

Eagleson, K. L., Bonnin, A., and Levitt, P. (2005) Region

advances and challenges, Dev. Neurobiol., 70, 350 359,

and age specific deficits in γ aminobutyric acidergic neuron

doi: 10.1002/dneu.20768.

development in the telencephalon of the uPAR^-/- mouse,

Friedman, W. J. (2010) Proneurotrophins, seizures, and neu

J. Compar. Neurol., 489, 449 466, doi: 10.1002/cne.20647.

ronal apoptosis, Neuroscientist, 16, 244 252, doi: 10.1177/

14.

Karagyaur, M., Dyikanov, D., Makarevich, P., Semina, E.,

1073858409349903.

Stambolsky, D., et al. (2015) Non viral transfer of BDNF

Miller, F. D., and Kaplan, D. R. (2001) Neurotrophin sig

and uPA stimulates peripheral nerve regeneration, Biomed.

nalling pathways regulating neuronal apoptosis, Cell. Mol.

Pharmacother.,

74,

6370, doi:

10.1016/j.biopha.

Life Sci., 58, 1045 1053, doi: 10.1007/PL00000919.

2015.07.002.

Unsain, N., Nuñez, N., Anastas a, A., and Mascó, D. H.

15.

Klimovich, P. S., Semina, E. V., Karagyaur, M. N.,

(2008) Status epilepticus induces a TrkB to p75 neu

Rysenkova, K. D., Sysoeva, V. Y., et al. (2020) Urokinase

rotrophin receptor switch and increases brain derived neu

receptor regulates nerve regeneration through its interac

rotrophic factor interaction with p75 neurotrophin recep

tion with α5β1 integrin, Biomed. Pharmacother., 125,

tor: an initial event in neuronal injury induction,

110008, doi: 10.1016/j.biopha.2020.110008.

Neuroscience, 154, 978 993, doi: 10.1016/j.neuroscience.

16.

Karagyaur, M., Rostovtseva, A., Semina, E.,

2008.04.038.

Klimovich, P., Balabanyan, V., et al. (2020) A bicistronic

Kandratavicius, L., Hallak, J. E., Carlotti, C. G., Assirati,

plasmid encoding brain derived neurotrophic factor and

J. A., and Leite, J. P. (2014) Neurotrophin receptors

urokinase plasminogen activator stimulates peripheral

expression in mesial temporal lobe epilepsy with and with

nerve regeneration after injury, J. Pharmacol. Exp. Ther.,

out psychiatric comorbidities and their relation with

372, 248 255, doi: 10.1124/JPET.119.261594.

seizure type and surgical outcome, Acta Neuropathol.

17.

Merino, P., Diaz, A., Jeanneret, V., Wu, F., Torre, E.,

Commun., 2, 81, doi: 10.1186/s40478 014 0081 2.

Cheng, L., and Yepes, M. (2017) Urokinase type plas

Conti, G., Gale, K., and Kondratyev, A.

(2009)

minogen activator (uPA) binding to the uPA receptor

Immunohistochemical evaluation of the protein expression

(uPAR) promotes axonal regeneration in the central ner

of nerve growth factor and its TrkA receptor in rat limbic

vous system, J. Biol. Chem., 292, 2741 2753, doi: 10.1074/

regions following electroshock seizures, Neurosci. Res., 65,

jbc.M116.761650.

201 209, doi: 10.1016/j.neures.2009.07.001.

18.

Semina, E., Rubina, K., Sysoeva, V., Rysenkova, K.,

Rysenkova, K. D., Semina, E. V., Karagyaur, M. N.,

Klimovich, P., et al. (2016) Urokinase and urokinase

Shmakova, A. A., Dyikanov, D. T., et al. (2018) CRISPR/

receptor participate in regulation of neuronal migration,

Cas9 nickase mediated targeting of urokinase receptor gene

axon growth and branching, Eur. J. Cell Biol., 95, 295 310,

inhibits neuroblastoma cell proliferation, Oncotarget, 9,

doi: 10.1016/j.ejcb.2016.05.003.

29414 29430, doi: 10.18632/oncotarget.25647.

19.

Rysenkova, K. D., Klimovich, P. S., Shmakova, A. A.,

10.

Yepes, M. (2018) The plasminogen activation system pro

Karagyaur, M. N., Ivanova, K. A., et al. (2020) Urokinase

motes neurorepair in the ischemic brain, Curr. Drug Targets,

receptor deficiency results in EGFR mediated failure to

20, 953 959, doi: 10.2174/1389450120666181211144550.

transmit signals for cell survival and neurite formation in

11.

Семина Е. В., Рубина К. А., Степанова В. В., Ткачук

mouse neuroblastoma cells, Cell. Signalling, 75, 109741,

В. А. (2016) Участие рецептора урокиназы и его эндо

doi: 10.1016/j.cellsig.2020.109741.

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1528

ШМАКОВА и др.

20.

Klimovich, P. S., and Semina, E. V. (2020) Mechanisms of

35.

Van Erum, J., Van Dam, D., and De Deyn, P. P. (2019)

participation of the urokinase receptor in directed axonal

PTZ induced seizures in mice require a revised Racine

growth, Mol. Biol.,

54,

8998, doi:

10.1134/

scale, Epilepsy Behav., 95, 51 55, doi: 10.1016/j.yebeh.

S0026893320010094.

2019.02.029.

21.

Shmakova, A. A., Rubina, K. A., Rysenkova, K. D.,

36.

Spijker, S. (2011) Dissection of rodent brain regions,

Gruzdeva, A. M., Ivashkina, O. I., et al. (2020) Urokinase

Neuroproteomics, 2, 13 26, doi: 10.1007/978 1 61779 111

receptor and tissue plasminogen activator as immediate

6_1.

early genes in pentylenetetrazole induced seizures in the

37.

Franklin, K., and Paxinos, G. (2008) The Mouse Brain in

mouse brain, Eur. J. Neurosci.,

51,

15591572,

Stereotaxic Coordinates, Compact - 3rd Edition, Academic

doi: 10.1111/ejn.14584.

Press.

22.

Shmakova, A. A., Rubina, K. A., Anokhin, K. V., Tkachuk,

38.

Zhang, S., Liang, F., Wang, B., Le, Y., and Wang, H.

V. A., and Semina, E. V. (2019) The role of plasminogen

(2014) Elevated expression of pleiotrophin in pilocarpine

activators in the pathogenesis of epilepsy, Biochemistry

induced seizures of immature rats and in pentylenetetra

(Moscow), 84, 979 991, doi: 10.1134/S0006297919090013.

zole induced hippocampal astrocytes in vitro, Acta

23.

Yepes, M., Sandkvist, M., Coleman, T. A., Moore, E.,

Histochem., 116, 415420, doi: 10.1016/j.acthis.2013.

Wu, J. Y., et al. (2002) Regulation of seizure spreading by

09.003.

neuroserpin and tissue type plasminogen activator is plas

39.

Kalantaripour, T. P., Esmaeili Mahani, S., Sheibani, V.,

minogen independent, J. Clin. Invest., 109, 1571 1578,

Najafipour, H., and Asadi Shekaari, M. M. (2017) Apelin

doi: 10.1172/JCI14308.

13 protects rat primary cortical glia neuron co culture

24.

Ndode Ekane, X. E., and Pitkänen, A. (2013) Urokinase

against pentylenetetrazole induced toxicity, Biomed.

type plasminogen activator receptor modulates epileptoge

Pharmacother., 87, 661 668, doi: 10.1016/j.biopha.2016.

nesis in mouse model of temporal lobe epilepsy, Mol.

12.131.

Neurobiol., 47, 914 937, doi: 10.1007/s12035 012 8386 2.

40.

Licursi, V., Conte, F., Fiscon, G., and Paci, P. (2019)

25.

Merino, P., and Yepes, M. (2018) Urokinase type plas

MIENTURNET: an interactive web tool for microRNA

minogen activator induces neurorepair in the ischemic

target enrichment and network based analysis, BMC

brain, J. Neurol. Exp. Neurosci., 4, 24 29, doi: 10.17756/

Bioinformatics, 20, 545, doi: 10.1186/s12859 019 3105 x.

jnen.2018 039.

41.

Raudvere, U., Kolberg, L., Kuzmin, I., Arak, T., Adler, P.,

26.

Yepes, M., and Lawrence, D. A. (2004) Neuroserpin: a

et al. (2019) G:Profiler: a web server for functional enrich

selective inhibitor of tissue type plasminogen activator in

ment analysis and conversions of gene lists (2019 update),

the central nervous system, Thromb. Haemost., 91, 457

Nucleic Acids Res., 47, W191 W198, doi: 10.1093/nar/

464, doi: 10.1160/TH03 12 0766.

gkz369.

27.

Merino, P., Diaz, A., Manrique, L. G., Cheng, L., and

42.

Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V. K.,

Yepes, M. (2018) Urokinase type plasminogen activator

Mukherjee, S., Ebert, B. L., et al. (2005) Gene set enrich

(uPA) promotes ezrin mediated reorganization of the

ment analysis: a knowledge based approach for interpret

synaptic cytoskeleton in the ischemic brain, J. Biol. Chem.,

ing genome wide expression profiles, Proc. Natl. Acad. Sci.

293, 9234 9247, doi: 10.1074/jbc.RA118.002534.

USA, 102, 15545 15550, doi: 10.1073/pnas.0506580102.

28.

Mudò, G., Salin, T., Condorelli, D. F., Jiang, X. H.,

43.

Tong, Z., Cui, Q., Wang, J., and Zhou, Y. (2019) TransmiR

Dell’Albani, P., et al. (1995) Seizures increase trkC mRNA

v2.0: an updated transcription factor microRNA regula

expression in the dentate gyrus of rat hippocampus, J. Mol.

tion database, Nucleic Acids Res., 47, D253 D258,

Neurosci., 6, 11 22, doi: 10.1007/BF02736755.

doi: 10.1093/nar/gky1023.

29.

Mudò, G., Jiang, X. H., Timmusk, T., Bindoni, M., and

44.

Chou, C. H., Shrestha, S., Yang, C. D., Chang, N. W., Lin,

Belluardo, N. (1996) Change in neurotrophins and their

Y. L., et al. (2018) MiRTarBase update 2018: a resource for

receptor mRNAs in the rat forebrain after status epilepticus

experimentally validated microRNA target interactions,

induced by pilocarpine, Epilepsia,

37,

198207,

Nucleic Acids Res., 46, D296 D302, doi: 10.1093/nar/

doi: 10.1111/j.1528 1157.1996.tb00012.x.

gkx1067.

30.

Ferencz, I., Kokaia, M., Keep, M., Elmér, E., Metsis, M.,

45.

Chen, Y., and Wang, X. (2020) MiRDB: An online data

et al. (1997) Effects of cholinergic denervation on seizure

base for prediction of functional microRNA targets,

development and neurotrophin messenger RNA regulation

Nucleic Acids Res.,

48, D127 D131, doi:

10.1093/

in rapid hippocampal kindling, Neuroscience, 80, 389 399,

nar/gkz757.

doi: 10.1016/s0306 4522(97)00006 7.

46.

Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., and Bartel, D. P.

31.

Sheng, F., Chen, M., Tan, Y., Xiang, C., Zhang, M., et al.

(2015) Predicting effective microRNA target sites in mam

(2016) Protective effects of Otophylloside N on

malian mRNAs, eLife, 4, e05005, doi: 10.7554/eLife.05005.

Pentylenetetrazol induced neuronal injury in vitro and

47.

Renton, J. P., Xu, N., Clark, J. J., and Hansen, M. R.

in vivo, Front. Pharmacol., 7, 224, doi: 10.3389/fphar.

(2010) Interaction of neurotrophin signaling with Bcl 2

2016.00224.

localized to the mitochondria and endoplasmic reticulum

32.

Ghadiri, T., Gorji, A., Vakilzadeh, G., Hajali, V.,

on spiral ganglion neuron survival and neurite growth,

Khodagholi, F., and Sharifzadeh, M. (2020) Neuronal

J. Neurosci. Res., 88, 2239 2251, doi: 10.1002/jnr.22381.

injury and death following focal mild brain injury: the role

48.

Wu, C. H., Hung, T. H., Chen, C. C., Ke, C. H., Lee, C. Y.,

of network excitability and seizure, Iranian J. Basic Med.

et al. (2014) Post injury treatment with 7,8 dihydroxy

Sci., 23, 63 70, doi: 10.22038/IJBMS.2019.37558.8932.

flavone, a TrkB receptor agonist, protects against experi

33.

Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A.,

mental traumatic brain injury via PI3K/Akt signaling, PLoS

and Brattelid, T. (2018) PREPARE: guidelines for planning

One, 9, 113397, doi: 10.1371/journal.pone.0113397.

animal research and testing, Lab. Animals, 52, 135 141,

49.

Almeida, R. D., Manadas, B. J., Melo, C. V., Gomes,

doi: 10.1177/0023677217724823.

J. R., Mendes, C. S., et al. (2005) Neuroprotection by

34.

Zhu, Y. Y., Zhu Ge, Z. B., Wu, D. C., Wang, S., Liu, L.

BDNF against glutamate induced apoptotic cell death is

Y., et al. (2007) Carnosine inhibits pentylenetetrazol

mediated by ERK and PI3 kinase pathways, Cell Death

induced seizures by histaminergic mechanisms in histidine

Differ., 12, 1329 1343, doi: 10.1038/sj.cdd.4401662.

decarboxylase knock out mice, Neurosci. Lett., 416, 211

50.

Casaccia Bonnefil, P., Kong, H., and Chao, M. V. (1998)

216, doi: 10.1016/J.NEULET.2007.01.075.

Neurotrophins: the biological paradox of survival factors

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

микроРНК И РЕЦЕПТОРЫ НЕЙРОТРОФИНОВ ПРИ СУДОРОГAX

1529

eliciting apoptosis, Cell Death Differ.,

357364,

in Alzheimer’s disease brain and CSF yields putative bio

doi: 10.1038/sj.cdd.4400377.

markers and insights into disease pathways, J. Alzheimer’s

51.

Vekrellis, K., McCarthy, M. J., Watson, A., Whitfield, J.,

Disease, 14, 27 41, doi: 10.3233/JAD 2008 14103.

Rubin, L. L., and Ham, J. (1997) Bax promotes neuronal

67.

Buckley, N. J., Johnson, R., Zuccato, C., Bithell, A., and

cell death and is downregulated during the development of

Cattaneo, E. (2010) The role of REST in transcriptional and

the nervous system, Development, 124, 1239 1249.

epigenetic dysregulation in Huntington’s disease, Neurobiol.

52.

Wu, C. H., Chen, C. C., Hung, T. H., Chuang, Y. C.,

Disease, 39, 28 39, doi: 10.1016/j.nbd.2010.02.003.

Chao, M., et al. (2019) Activation of TrkB/Akt signaling by

68.

Rajgor, D. (2018) Macro roles for microRNAs in neurode

a TrkB receptor agonist improves long term histological

generative diseases, Noncoding RNA Res., 3, 154 159,

and functional outcomes in experimental intracerebral

doi: 10.1016/j.ncrna.2018.07.001.

hemorrhage, J. Biomed. Sci., 26, doi: 10.1186/s12929 019

69.

Müller, M., Jäkel, L., Bruinsma, I. B., Claassen, J. A.,

0543 8.

Kuiperij, H. B., and Verbeek, M. M. (2016) MicroRNA

53.

Semina, E. V., Rysenkova, K. D., Troyanovskiy, K. E.,

29a is a candidate biomarker for Alzheimer’s disease in

Shmakova, A. A., and Rubina, K. A. (2021) MicroRNAs in

cell free cerebrospinal fluid, Mol. Neurobiol., 53, 2894

cancer: from gene expression regulation to the metastatic

2899, doi: 10.1007/s12035 015 9156 8.

niche reprogramming, Biochemistry (Moscow), 86, 785

70.

Nissan, X., Blondel, S., Navarro, C., Maury, Y., Denis, C.,

799, doi: 10.1134/S0006297921070014.

et al. (2012) Unique preservation of neural cells in hutchin

54.

Shi, J. (2014) Regulatory networks between neurotrophins

son gilford progeria syndrome is due to the expression of

and miRNAs in brain diseases and cancers, Acta

the neural specific miR 9 microRNA, Cell Rep., 2, 1 9,

Pharmacol. Sinica, 36, 149 157, doi: 10.1038/aps.2014.135.

doi: 10.1016/j.celrep.2012.05.015.

55.

Ma, S., Smith, C. M., Blasiak, A., and Gundlach, A. L.

71.

Jung, H. J., Coffinier, C., Choe, Y., Beigneux, A. P.,

(2017) Distribution, physiology and pharmacology of

Davies, B. S. J., et al. (2012) Regulation of prelamin A but

relaxin 3/RXFP3 systems in brain, Br. J. Pharmacol., 174,

not lamin C by miR 9, a brain specific microRNA, Proc.

1034 1048, doi: 10.1111/bph.13659.

Natl. Acad. Sci. USA, 109, E423 E431, doi: 10.1073/pnas.

56.

Ebert, M. S., and Sharp, P. A.

(2012) Roles for

1111780109.

MicroRNAs in conferring robustness to biological process

72.

Roshan, R., Shridhar, S., Sarangdhar, M. A., Banik, A.,

es, Cell, 149, 515 524, doi: 10.1016/j.cell.2012.04.005.

Chawla, M., et al. (2014) Brain specific knockdown of

57.

Sommerlandt, F. M. J., Brockmann, A., Rössler, W., and

miR 29 results in neuronal cell death and ataxia in mice,

Spaethe, J. (2019) Immediate early genes in social insects:

RNA, 20, 1287 1297, doi: 10.1261/rna.044008.113.

a tool to identify brain regions involved in complex behav

73.

Ouyang, Y. B., and Giffard, R. G. (2014) MicroRNAs

iors and molecular processes underlying neuroplasticity,

affect BCL 2 family proteins in the setting of cerebral

Cell. Mol. Life Sci., 76, 637 651, doi: 10.1007/s00018 018

ischemia, Neurochem. Int., 77, 2 8, doi: 10.1016/j.neuint.

2948 z.

2013.12.006.

58.

McNamara, J. O., Huang, Y. Z., and Leonard, A. S. (2006)

74.

Xiao, P., Zhang, X., Li, Y., Ma, Z., Si, S., and Gao, X.

Molecular signaling mechanisms underlying epileptogene

(2019) miR 9 inhibition of neuronal apoptosis and expres

sis, Sci. STKE, 356, re12, doi: 10.1126/stke.3562006re12.

sion levels of apoptosis genes Bcl 2 and Bax in depression

59.

Holm, M. M., Nieto Gonzalez, J. L., Vardya, I., Vaegter,

model rats through Notch pathway, Exp. Ther. Med., 19,

C. B., Nykjaer, A., and Jensen, K. (2009) Mature BDNF,

551, doi: 10.3892/etm.2019.8228.

but not proBDNF, reduces excitability of fast spiking

75.

Liu, X., Wu, Y., Huang, Q., Zou, D., Qin, W., and

interneurons in mouse dentate gyrus, J. Neurosci., 29,

Chen, Z. (2015) Grouping pentylenetetrazol induced

12412 12418, doi: 10.1523/JNEUROSCI.2978 09.2009.

epileptic rats according to memory impairment and

60.

Hilborn, M. D., Vaillancourt, R. R., and Rane, S. G.

MicroRNA expression profiles in the hippocampus, PLoS

(1998) Growth factor receptor tyrosine kinases acutely reg

One, 10, e0126123, doi: 10.1371/journal.pone.0126123.

ulate neuronal sodium channels through the src signaling

76.

Kretschmann, A., Danis, B., Andonovic, L., Abnaof, K.,

pathway, J. Neurosci., 18, 590 600, doi: 10.1523/JNEU

van Rikxoort, M., et al. (2015) Different microRNA profiles

ROSCI.18 02 00590.1998.

in chronic epilepsy versus acute seizure mouse models, J. Mol.

61.

Oh, J. D., Chartisathian, K., Chase, T. N., and Butcher,

Neurosci., 55, 466 479, doi: 10.1007/s12031 014 0368 6.

L. L. (2000) Overexpression of neurotrophin receptor p75

77.

Hu, K., Zhang, C., Long, L., Long, X., Feng, L., Li, Y.,

contributes to the excitotoxin induced cholinergic neu

and Xiao, B. (2011) Expression profile of microRNAs in

ronal death in rat basal forebrain, Brain Res., 853, 174 185,

rat hippocampus following lithium pilocarpine induced

doi: 10.1016/s0006 8993(99)02054 5.

status epilepticus, Neurosci. Lett.,

488,

252257,

62.

Porcher, C., Medina, I., and Gaiarsa, J. L.

(2018)

doi: 10.1016/j.neulet.2010.11.040.

Mechanism of BDNF modulation in GABAergic synaptic

78.

Schouten, M., Fratantoni, S. A., Hubens, C. J., Piersma,

transmission in healthy and disease brains, Front. Cell.

S. R., Pham, T. V., et al. (2015) MicroRNA 124 and

137

Neurosci, 12, 273, doi: 10.3389/fncel.2018.00273.

cooperativity controls caspase 3 activity through BCL2L13

63.

Becker, A. J. (2018) Review: animal models of acquired

in hippocampal neural stem cells, Sci. Rep., 5, 12448,

epilepsy: insights into mechanisms of human epileptogen

doi: 10.1038/srep12448.

esis, Neuropathol. Appl. Neurobiol.,

44,

112129,

79.

Okuno, H. (2011) Regulation and function of immediate

doi: 10.1111/nan.12451.

early genes in the brain: Beyond neuronal activity markers,

64.

Bengzon, J., Mohapel, P., Ekdahl, C. T., and Lindvall, O.

Neurosci. Res., 69, 175 186, doi: 10.1016/j.neures.2010.

(2002) Neuronal apoptosis after brief and prolonged

12.007.

seizures, Progr. Brain Res., 135, 111 119, doi: 10.1016/

80.

Fiorenza, A., Lopez Atalaya, J. P., Rovira, V.,

S0079 6123(02)35011 8.

Scandaglia, M., Geijo Barrientos, E., and Barco, A.

65.

Haramati, S., Chapnik, E., Sztainberg, Y., Eilam, R.,

(2016) Blocking miRNA biogenesis in adult forebrain neu

Zwang, R., et al. (2010) miRNA malfunction causes spinal

rons enhances seizure susceptibility, fear memory, and food

motor neuron disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107,

intake by increasing neuronal responsiveness, Cerebral

13111 13116, doi: 10.1073/pnas.1006151107.

Cortex, 26, 1619 1633, doi: 10.1093/cercor/bhu332.

66.

Cogswell, J. P., Ward, J., Taylor, I. A., Waters, M., Shi, Y.,

81.

Iwakawa, H. O., and Tomari, Y. (2015) The functions of

Cannon, B., et al. (2008) Identification of miRNA changes

MicroRNAs: mRNA decay and translational repression,

9 БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021

1530

ШМАКОВА и др.

Trends Cell Biol.,

25, 651 665, doi: 10.1016/j.tcb.2015.

85. Wang, Y., Hameed, M. Q., Rakhade, S. N., Iglesias, A. H.,

07.011.

Muller, P. A., et al. (2014) Hippocampal immediate early

82.

Bahrami, S., and Drabløs, F. (2016) Gene regulation in the

gene transcription in the rat fluid percussion traumatic

immediate early response process, Adv. Biol. Regul., 62,

brain injury model, NeuroReport,

25,

954959,

37 49, doi: 10.1016/j.jbior.2016.05.001.

doi: 10.1097/WNR.0000000000000219.

83.

Flavell, S. W., and Greenberg, M. E. (2008) Signaling mech

86. Lauterborn, J. C., Rivera, S., Stinis, C. T., Hayes, V. Y.,

anisms linking neuronal activity to gene expression and plas

Isackson, P. J., and Gall, C. M. (1996) Differential effects

ticity of the nervous system, Annnu. Rev. Neurosci., 31, 563

of protein synthesis inhibition on the activity dependent

590, doi: 10.1146/annurev.neuro.31.060407.125631.

expression of BDNF transcripts: evidence for immediate

84.

Fowler, T., Sen, R., and Roy, A. L. (2011) Regulation of

early gene responses from specific promoters,

primary response genes, Mol. Cell,

44,

348360,

J. Neurosci., 16, 7428 7436, doi: 10.1523/jneurosci.16

doi: 10.1016/j.molcel.2011.09.014.

23 07428.1996.

EARLY INDUCTION OF NEUROTROPHIN RECEPTOR AND miRNA GENES

IN MOUSE BRAIN AFTER PENTILENTETRAZOLE!INDUCED

NERVOUS ACTIVITY

A. A. Shmakova^1,2, K. D. Rysenkova^1,2, O. I. Ivashkina^3,4,5, A. M. Gruzdeva³, P. S. Klimovich^1,2,

V. S. Popov¹, K. A. Rubina¹, K. V. Anokhin^3,4, V. A. Tkachuk^1,2, and E. V. Semina^1,2*

¹ Faculty of Medicine, Lomonosov Moscow State University, 119192 Moscow, Russia; E'mail: e'semina@yandex.ru

² Institute of Experimental Cardiology, National Cardiology Research Center

of the Ministry of Health of the Russian Federation, 121552 Moscow, Russia

³ Institute for Advanced Brain Studies, Lomonosov Moscow State University,

119192 Moscow, Russian Federation; E'mail: k.anokhin@gmail.com

⁴ Anokhin Research Institute of Normal Physiology, 125315 Moscow, Russian Federation

⁵ National Research Center “Kurchatov Institute”, 123182 Moscow, Russia

Neurotrophin receptors regulate neuronal survival, neural network formation, and synaptic plasticity in the brain via

interaction with their ligands. In the present study we analyzed early changes in the expression of neurotrophin recep

tor genes Ntk1 (TrkA), Ntrk2 (TrkB), Ntrk3 (TrkC), Ngfr (p75NTR) and miRNAs that target them in mouse brain

after the induction of seizure neural activity by pentylenetetrazole injection. The obtained results indicate that the

expression of Ntrk3 and Ngfr is increased in the cortex and hippocampus 1 3 hours after seizures; Ntrk2 expression is

increased in the anterior cortex after 3 6 hours, and after 1 hour and 6 hours in the hippocampus. At the same time,

in the anterior and posterior cortex, but not in the hippocampus, the ratio of signaling proteins Bcl 2 / Bax increas

es, reflecting the activation of anti apoptotic signaling. We also detect the increase in the expression of miRNA 9 and

miRNA 29a, which are predicted to target Ntrk3, in the hippocampus 3 hours after pentylenetetrazole injection.

Thus, it can be concluded that early cellular response to seizure neural activity in the brain includes the induction of

Ntrk2, Ntrk3, Ngfr, miRNA 9 and miRNA 29a expression, as well as the activation of signaling pathways that involve

Bcl 2 and Bax proteins, which may characterize them as important mediators in the regulation of neuronal adapta

tion and survival upon the induction of generalized neural activity.

Keywords: neurotrophin receptors TrkA, TrkB, TrkC, p75NTR, miRNAs, miRNA 9, miRNA 29a, early response

genes, neuronal activation, apoptosis

БИОХИМИЯ том 86 вып. 10 2021