Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 806-814

ВВЕДЕНИЕ

Дисульфидная связь – один из структурообразующих элементов в молекулах многих биологически активных пептидов – таких пептидных гормонов, как Окситоцин, Вазопрессин, Соматостатин, Инсулин [1, 2], нейромедиаторов, факторов роста и др. Дисульфидные мостики играют важную роль в реализации биологического эффекта многих пептидных лекарств [3]. Примеры таких соединений – агонисты вазопрессиновых и соматостатиновых рецепторов, такие как Терлипрессин, Фелипрессин, Десмопрессин, Орнипрессин, Октреотид, Ланреотид и Пасиреотид. Данные пептиды содержат одну дисульфидную связь и производятся в промышленных масштабах [4–7]. К настоящему времени существует лишь один клинически используемый антагонист окситоциновых рецепторов – Атозибан, который применяется для предотвращения преждевременных родов и также производится в промышленных масштабах [8, 9]. Такие пептидные лекарства, как Линаклотид и Плеканатид, выступают агонистами гуанилатциклазы, содержат в своей структуре три и две S–S-связи соответственно [10].

В настоящее время существует достаточно большое количество способов создания дисульфидных мостиков в пептидах. При окислении тиольных предшественников используются кислород воздуха, феррицианид калия, диметилсульфоксид, перекись водорода [11]. При синтезе сложных пептидов применяют буферы, имитирующие физиологические условия, как правило, с использованием глутатионовой системы, содержащей 5 мМ восстановленный и 0.1 мМ окисленный глутатион в различных соотношениях [12]. При синтезе природных пептидов, содержащих несколько дисульфидных связей в молекуле, успешно применяют спонтанное замыкание S–S-мостиков с использованием мягких окислителей. Так, в работе по синтезу конотоксинов с двумя дисульфидными мостиками спонтанная циклизация тиольных предшественников кислородом воздуха приводила к преимущественному образованию природного дисульфидного изомера [13]. Альтернативный подход – прямая конверсия защищенных (Trt, Acm, Tmob, Mob и др.) линейных предшественников пептидов в циклические дисульфиды. Для этой цели наиболее часто используют иод в различных растворителях [14], реже применяют трифторацетат таллия(III) [15] или сульфоксиды в присутствии хлорсиланов [16].

Синтез природных пептидов или их аналогов, содержащих внутримолекулярные дисульфидные мостики, – до сих пор достаточно сложная задача [17]. Это обусловлено тем, что, независимо от способа (классического или твердофазного) получения соответствующего линейного предшественника, на стадии замыкания внутримолекулярного дисульфидного мостика в пептиде, во избежание межмолекулярной агрегации и образования побочных дисульфидных димеров и олигомеров, приходится работать в условиях высокого разбавления. Рабочие концентрации пептидов при циклизации, как правило, составляют 10^–4–10^–5 М (т.е. 0.1–1.0 мг/мл) [14]. Концентрирование реакционных смесей циклизации перед выделением целевого продукта – довольно длительный процесс, в ходе которого также возможно образование побочных продуктов, в частности из-за наличия в смеси остаточных количеств окислителя, приводящих к образованию продуктов более глубокого окисления серы (соответствующих сульфоксидов), а также несоблюдения рН или температурного режима. Атозибан разрешен к практическому применению в нашей стране в качестве лекарственного препарата, что диктует необходимость разработки именно крупномасштабной схемы его получения. При синтезе Атозибана мы столкнулись с рядом проблем на стадии создания дисульфидной связи.

Цель данного исследования – разработка оптимальной методики получения Атозибана в укрупненном масштабе, сравнение различных условий замыкания S–S-связи и изучение примесей, образующихся в ходе как твердофазного синтеза, так и синтеза в растворе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Атозибан (I) имеет следующую структуру – Mpa¹-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys⁶-Pro-Orn-Gly-NH₂ циклический 1,6-дисульфид. Данный антагонист был получен заменой четырех аминокислотных остатков в молекуле Окситоцина. Тирозин был заменен на алкилированный аналог D-Tyr(OEt), цистеин – на дезаминоцистеин (Mpa), лейцин – на орнитин, глутамин – на треонин. Такие модификации были проведены для получения аналога – антагониста окситоциновых рецепторов – и увеличения его протеолитической устойчивости [3].

Известны различные методы промышленного получения Атозибана и, судя по литературным данным, предпочтение отдается синтезу в растворе [9, 18]. В данной работе для синтеза этого пептида был выбран твердофазный метод, т.к., по нашему мнению, он более технологичен. В сочетании с N^α-Fmoc-защитой для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот использовали кислотолабильные защитные группы: Bu^t – для треонина, Вос – для орнитина, Trt – для аспарагина. При синтезе пептидов остаток цистеина защищали Acm- или Trt-группой, остаток меркаптопропионовой кислоты – Trt-группой. Для отщепления Fmoc-защит использовали раствор 5% 4-MePip/2% DBU/DMF [19]. Для создания пептидной связи применяли DIC/HOBt-метод. В результате твердофазного синтеза был получен линейный предшественник Атозибана – Mpa-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH₂ – с чистотой 76% по данным ВЭЖХ. Основополагающая стадия в синтезе Атозибана – циклизация, поэтому замыкание дисульфидного мостика изучалось нами как в растворе, так и на полимере.

Замыкание S–S-мостика в растворе. В литературе имеются отдельные упоминания о том, что введение органических растворителей в состав реакционных смесей на стадии циклизации способствует образованию внутримолекулярных дисульфидов [20]. Наши собственные данные по синтезу Октреотида [21] показывают, что в этом случае циклизация тиольного предшественника с концентрацией 10–20 мг/мл без образования заметных количеств димеров проходит в метаноле. Мы провели серию экспериментов по получению Атозибана в водных или водно-органических растворах (H₂O/изопропиловый спирт, H₂O/диоксан, H₂O/изопропиловый спирт/CH₃CN) с использованием нарастающих концентраций линейного SH-пептида (1.0–20.0 мг/мл) при рН 7.0–8.0 (табл. 1). Для контроля полноты протекания циклизации параллельно применяли ВЭЖХ и тест Эллмана [22]. Введение органических растворителей в состав реакционной смеси при циклизации позволило нам увеличить концентрацию исходного дитиола (II).

Как видно из табл. 1 и рис. 1, в использованных для циклизации условиях нам не удалось избежать образования продуктов с межмолекулярными S–S-связями – параллельных и антипараллельных димеров (III) и (IV), структура которых после выделения из реакционной смеси с помощью ВЭЖХ была подтверждена методом масс-спектрометрии. В спектре ESI (+) фракции, содержащей смесь пептидов (III) и (IV), наблюдался единственный пик молекулярного иона (1988.6), соответствующий массе димерных продуктов. В дальнейшем при оценке результатов циклизации нами учитывалось суммарное количество пептидов (III) и (IV). При этом в интервале концентраций исходного SH-соединения 1–10 мг/мл содержание побочных продуктов практически не менялось и составляло ~10–14% (табл. 1). При повышении концентрации исходного соединения (II) до 20 мг/мл количество дисульфидных димеров (III) и (IV) возрастало до 18.2% (табл. 1). Как оказалось, димеры имеют более низкую растворимость, чем Атозибан, и существенно осложняют выделение целевого продукта. Лучшие результаты при замыкании S–S-мостика в растворе были получены в следующих условиях: H₂O/изопропиловый спирт при концентрации пептида 10 мг/мл. Окисление происходило в течение 15 мин. По завершении реакции рН реакционной смеси доводили до 4 с помощью уксусной кислоты, и целевой пептид, имеющий чистоту по ВЭЖХ 73.7%, выделяли с помощью препаративной ВЭЖХ.

Рис. 1.

Профиль аналитической ВЭЖХ и спектры ESI (+) продуктов при замыкании S–S-мостика в Атозибане в растворе в течение 15 мин действием H₂O₂ в смеси H₂O/i-PrOH (1 : 1): (I) – Атозибан, (II) – линейный SH-предшественник Атозибана, (III–V) – димеры.

Стоит отметить, что на стадии подкисления реакционной смеси нельзя применять трифторуксусную кислоту, т.к. наличие остаточных количеств H₂O₂ может привести к образованию cоответствующего сульфоксида. Такие побочные продукты были нами выделены. В масс-спектре ESI (+) наблюдается пик молекулярного иона (1010), соответствующий сульфоксиду Атозибана. Выход Атозибана-ацетата при замыкании дисульфидной связи в растворе составил 31.5% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю. Полученные результаты побудили нас продолжить поиски оптимальной методики и перейти к экспериментам замыкания дисульфидной связи на полимерном носителе.

Замыкание S–S-мостика на твердой фазе. Важный аспект замыкания S–S-мостика на твердой фазе – эффект псевдоразбавления, за счет которого при набухании пептидил-полимера в определенном растворителе расстояние между соседними пептидными цепями увеличивается, и взаимодействие между ними становится минимальным, что может имитировать разбавление в растворе. Поэтому мы предполагали, что циклизация Атозибана на полимере поможет нам обойти проблему высоких разбавлений, наблюдающихся при окислении в растворе, и сократить образование побочных продуктов, а также упростить процедуру выделения продукта. Как правило, для замыкания S–S-мостика в различных пептидах требуется подбор специальных условий [11].

Атозибан не содержит в молекуле остатка триптофана, поэтому в качестве окислителя при создании S–S-связи на полимере был выбран I₂, поскольку он хорошо растворим в органических растворителях, обеспечивающих хорошую сольватацию пептидил-полимера, и при его использовании наблюдается прямая конверсия цистеин-защищенного пептида в циклический дисульфид [11]. К настоящему моменту существует довольно большое количество работ по изучению замыкания дисульфидных мостиков на полимерном носителе [14, 23, 24], однако систематических исследований по изучению зависимости количества окислителя, времени проведения циклизации и растворителя на состав образующихся примесей в синтезе Атозибана не проводилось. Мы осуществили серию экспериментов по синтезу Атозибана на твердой фазе, включая стадию образования дисульфидного мостика (табл. 2).

На амидном полимере Ринка с использованием двух различных защит остатка цистеина нами было синтезировано два пептидил-полимера:

Trt-Mpa-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(Bu^t)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-P и Trt-Mpa-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(Bu^t )-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Orn(Boc)-Gly-P.

Конверсию защищенного производного пептида в циклический полупродукт на твердой фазе проводили действием различных избытков иода (3–35 экв.) в таких органических растворителях, как DMF, диоксан и уксусная кислота, при комнатной температуре в течение 1–5 ч (табл. 2).

Наилучшие результаты наблюдаются при использовании в качестве растворителя DMF. При применении же диоксана и уксусной кислоты в одинаковых условиях (10-кратный избыток иода, 1 ч) всегда присутствует большое количество линейного SH-пептида и димеров. Как видно из табл. 2, при увеличении количества окислителя и времени проведения циклизации в реакционной смеси во всех случаях неожиданно нарастает содержание линейного SH-предшественника Атозибана (II) и димеров. При использовании Trt-защиты наиболее полное замыкание S–S-мостика наблюдается при действии трехкратного избытка I₂ в течение 1 ч при комнатной температуре. При этом содержание SH-пептида и димеров составляет менее 7% и не наблюдается других побочных продуктов. Чистота же самого Атозибана составляет более 85%.

Для анализа реакционных смесей получения Атозибана (I) были подобраны условия ВЭЖХ, в которых наблюдалось хорошее разрешение пиков, соответствующих SH-, SS-формам пептида и побочным продуктам (рис. 2). Стоит отметить, что в тех же условиях, но с Acm-защитой на цистеине в реакционной смеси присутствует довольно большое количество SH-пептида (II). Мы идентифицировали продукт (II) (рис. 2), который соответствует направленно полученному SH-предшественнику Атозибана (II). В масс-спектрах ESI (+) наблюдается пик молекулярного иона (997.2), соответствующий SH-пептиду (II). При анализе ¹Н-ЯМР-спектров Атозибана (I) и пептида (II) наиболее заметные изменения наблюдаются у сигналов протонов цистеина. Сигнал амидного протона линейного предшественника Атозибана (I) сместился в более сильное поле по сравнению с сигналом амидного протона Атозибана (I): в пептиде (II) – αNH, Cys (7.94 м.д.), в Атозибане – αNH, Cys (8.44 м.д.). Такая же тенденция наблюдается и для βCH₂-протонов, а именно в пептиде (II) – βCH₂, Cys (2.60; 2.75 м.д.), в Атозибане – βCH₂, Cys (3.02; 2.85 м.д.). Также изменились сигналы амидных протонов тирозина, треонина и орнитина в пептиде (II): в пептиде (II) – αNH, D-Tyr(OEt) (8.15 м.д.), в Атозибане – αNH, D-Tyr(OEt) (8.39 м.д.); в пептиде (II) – αNH, Thr (7.78 м.д.), в Атозибане – αNH, Thr (7.20 м.д.); в пептиде (II) – αNH, Orn (8.17 м.д.), в Атозибане – αNH, Orn (8.08 м.д.). Стоит отметить изменение сигналов протонов при β-углеродном атоме в изолейцине: в пептиде (II) – βCH₂, Ile (1.70 м.д.), в Атозибане – βCH₂, Ile (1.85 м.д.). Таким образом, ¹Н-спектр ЯМР и масс-спектр ESI (+) побочного продукта совпадают со спектрами специально полученного сульфгидрильного производного.

Рис. 2.

Профиль аналитической ВЭЖХ и спектры ESI (+) продуктов при замыкании S–S-мостика в Атозибане (I) на твердой фазе в течение 1 ч с использованием 3 экв. I₂ в DMF: (I) – Атозибан, (II) – линейный SH-предшественник Атозибана, (III–V) – димеры.

При обработке реакционной смеси циклизации H₂O₂ продукт, соответствующий пику пептида (II), переходит в Атозибан (I).

На сегодняшний момент, судя по литературным данным, не существует однозначного представления о механизме замыкания S–S-мостика действием I₂ [17]. Мы предполагаем, что схематически суть происходящего можно объяснить следующим образом (схема 1 ). При взаимодействии защищенного производного пептида с I₂ первоначально образуется моно-иод-производное (Ib), которое с высокой скоростью внутримолекулярно превращается в циклический продукт (Id). Одновременно с учетом избытка иода образуется и некоторое количество ди-иод-производного (Ic). В пользу этого говорит тот факт, что в наших экспериментах (табл. 2) при увеличении молярного количества иода растет и количество линейного продукта со свободными SH-группами (II). При этом, видимо, ди-иод-производное (Ic) не переходит в продукт (Id), иначе мы должны были бы всегда получать главным образом циклический продукт. Из табл. 2 следует, что при 40-кратном избытке I₂ содержание SH-пептида в реакционной смеси составляло 63.73%, при 10-кратном избытке – 43.8%, а при трехкратном – 3.71%. В случае Acm-защитной группы на цистеине ситуация принципиально не меняется (табл. 2). Мы предполагаем, что скорость внутримолекулярного замыкания цикла в случае тритильного производного выше, чем в случае Acm-производного.

Схема 1 . Схема циклизации Атозибана (I) в растворе и на твердой фазе.

Как видно из табл. 2, во всех случаях при циклизации в DMF содержание димеров в реакционной смеси меньше, чем при циклизации в растворе.

Выход Атозибана-ацетата (I) при замыкании дисульфидной связи на полимере составил 50%.

Сравнительная оценка замыкания S–S-мостика на твердой фазе и в растворе. Несмотря на то что время замыкания S–S-мостика в растворе меньше (не более 15 мин) и существует возможность контроля полноты протекания с помощью теста Эллмана и ВЭЖХ, плюсов проведения окисления на твердой фазе оказалось больше: во-первых, отсутствует проблема растворимости; во-вторых, существенно упрощается процесс обработки реакционной массы, путем нескольких промывок пептидил-полимера при обычной фильтрации удается полностью удалить избыток окислителя; в-третьих, нам удалось добиться практически полного отсутствия димеров при циклизации на полимере. Возможно, уменьшение степени замещения смолы при твердофазном синтезе позволит свести к минимуму образование димеров. Главное преимущество циклизации на полимере – увеличение суммарного выхода Атозибана (I) на стартовую аминокислоту (50% по сравнению с 31.5% в растворе).

Разработанная методика была успешно использована для синтеза Атозибана (I) в укрупненном масштабе (10–20 ммоль).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали производные аминокислот L- и D-ряда (Fluka, Швейцария); тритил-3-меркаптопропионовую кислоту (Trt-Mpa), DMF, NMM, HOBt, TBTU, TIS, DTNB – реагент Эллмана, дихлорметан и трифторуксусную кислоту (Fluka, Швейцария); уксусную кислоту, металлический иод, аскорбиновую кислоту (о.с.ч.; Реахим, Россия). Для ВЭЖХ применяли ацетонитрил (CH₃CN; Carl Roth GmbH, Германия).

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе Knauer 1001А (Германия) на колонке (4.6 × × 250 мм) Kromasil 100-5 ODS (Швеция), размер частиц сорбента 5 мкм, размер пор порядка 100 Å. В качестве элюентов использовали буфер А (0.05 М КН₂РО₄, pH 3.0) и буфер Б (70%-ный ацетонитрил в буфере А), элюцию проводили со скоростью 1 мл/мин в градиенте концентрации буфера Б в буфере А (20–80% за 30 мин), детекция при длине волны 220 нм. Препаративную ВЭЖХ Атозибана осуществляли с использованием прибора Knauer 1001 (Германия) на колонке Kromasil 50 × 250 мм с размером частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А (0.01 М водный раствор ацетата аммония, рН 4.5, содержащий 3% ацетонитрила) и буфер Б (70%-ный ацетонитрил в буфере А). Элюцию проводили со скоростью 20 мл/мин от 100% буфера А в градиенте концентраций буфера Б (0.5%/мин). Фракции, соответствующие целевому веществу, объединяли, концентрировали в вакууме и лиофилизировали.

¹Н-ЯМР-спектры регистрировали на спектрометре WH-500 (500 МГц; Bruker, Германия) в DMSO-d₆ при 300 K, концентрация пептидов составляла 2–3 мг/мл, химические сдвиги (δ, м.д.) измеряли относительно тетраметилсилана. Приведены значения химических сдвигов (δ, м.д.). Отнесение сигналов к определенным группам протонов аминокислотных остатков проводили с помощью метода дифференциального двойного резонанса. Масс-спектры регистрировали на приборе Amazon (Bruker, Германия) методом электрораспылительной ионизации (ESI) в режиме регистрации положительных ионов (напряжение на капилляре – 3500 В). Диапазон сканирования масс, m/z – 70–2200. Применяли шприцевый ввод образца, растворенного в смеси CH₃CN–вода. Газ-распылитель – азот, температура интерфейса – 100°C.

Твердофазный синтез Атозибана (I). Получение Trt-Mpa-D-Tyr(OEt)-Ile-Thr(Bu^t)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-полимера (Ia). Синтез пептида проводили в ручном режиме из 8 г (5.44 ммоль) полимера Ринка (Novabiochem, Великобритания) с содержанием аминогрупп 0.68 ммоль/г. Снятие Fmoc-защиты с α-аминогруппы проводили последовательно раствором 5%-ного 4-метилпиперидина и 2%-ного 1,8-диазабицикло[5.4.0.]ундец-7-ена (DBU) в DMF в течение 5 и 10 мин. Аминокислотные цепи удлиняли в соответствии со стандартными процедурами одностадийного цикла, включающего 30-минутную активацию присоединяемой аминокислоты (16.32 ммоль) в присутствии эквимолярных количеств DIC и HOBt в смеси NMP и DMF (1 : 1). Цикл синтеза включал все необходимые промывки пептидилполимера DMF и тест с нингидрином на остаточные аминогруппы [18]. Аликвоты пептидилполимера (Ia), содержание пептида в которых составляло ~0.5 ммоль, использовали для тестовых синтезов Атозибана (I), условия и результаты которых представлены в табл. 1 и 2. Основную часть нонапептидил-полимера (Ia) с содержанием пептида 3.6 ммоль использовали для получения целевого продукта (I). Для оценки качества промежуточного нонапептида образец N^α-свободного пептидилполимера (Ia) обрабатывали деблокирующей смесью TFA/TIS/H₂O (90 : 5 : 5 v/v/v) в течение 1 ч. После осаждения продукта диэтиловым эфиром содержание основного вещества в образце составило 89% по данным ВЭЖХ.

б) Замыкание S–S-связи на твердой фазе. К суспензии 10 г нонапептидил-полимера (Ia) (3.62 ммоль) в 400 мл DMF добавляли 100 мл раствора иода (10.86 ммоль) в DMF и энергично перемешивали в течение 2 ч, пептидил-полимер отфильтровывали, промывали на фильтре DMF (3 × 100 мл). Затем избыток иода удаляли 10%-ным раствором аскорбиновой кислоты в смеси DMF/H₂O 2 : 1 (2 × × 100 мл), пептидил-полимер отфильтровывали, промывали на фильтре DMF (3 × 100 мл), дихлорметаном (3 × 100 мл) и высушивали. Отщепление пептида от полимера проводили в одну стадию путем обработки пептидил-полимера 85 мл смеси (90% TFA, 5% деионизованной воды, 5% TIS) при комнатной температуре в течение 1.5 ч. Полимер отфильтровали, промывали деблокирующей смесью (2 × 40 мл). Фильтрат упаривали до маслообразного состояния, осаждали продукт 85 мл диэтилового эфира, отфильтровывали выпавший осадок, промывали диэтиловым эфиром (2 × 40 мл). Получили 3 г белого порошка. Содержание основного вещества в образце по данным ВЭЖХ составило 85.51%. Сырой продукт растворяли в 150 мл воды, рH реакционной смеси доводили 2.5%-ным раствором аммиака до 6.5–7.5. При перемешивании к гомогенному раствору добавляли 0.6 мл 3%-ной H₂O₂. Полноту образования дисульфидной связи проверяли при помощи реактива Эллмана [18] и ВЭЖХ. К раствору добавляли AcOH до рH 4.0–5.0 и очищали с помощью ВЭЖХ. Выход Атозибана-ацетата составил 1.9 г (50% в расчете на стартовую аминокислоту).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная нами методика позволяет получить технический Атозибан чистотой более 85% с образованием димерных продуктов менее 5%, что открывает возможности внедрения этой методики в промышленное производство.