1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 47, № 6, 2021

Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 849-852

Конформационно-фиксированный 5-бензилиден-4Н-имидазолтион как флуорогенный краситель

И. Н. Мяснянко 1, 2, М. А. Сычева 1, А. С. Гавриков 1, Н. С. Балеева 1, 2, *, М. С. Баранов 1, 2

1 ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия

2 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова
117997 Москва, ул. Островитянова, 1, Россия

* E-mail: nsbaleeva@gmail.com

Поступила в редакцию 22.03.2021
После доработки 10.04.2021
Принята к публикации 12.04.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Синтезирован конформационно-фиксированный 5-(4-(диэтиламино)бензилиден)-2,3-диметил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-тион. Установлено, что производное хромофоров флуоресцентных белков, содержащее серу вместо кислорода в имидазолоновом фрагменте, характеризуется смещенными в длинноволновую область спектра поглощением и испусканием и более высоким коэффициентом экстинкции в сравнении с соответствующим производным, содержащим атом кислорода. Показано, что данное соединение может быть использовано во флуоресцентной микроскопии в качестве флуорогенного красителя для флуороген-активирующих белков на основе липокалина.

Ключевые слова: GFP, хромофоры, флуорогенные красители, флуоресценция

ВВЕДЕНИЕ

Производные хромофоров флуоресцентных белков – перспективная основа для разработки систем флуоресцентного мечения. Удобные методы синтеза и модификаций позволяют получать вещества с самой разной окраской и разными оптическими свойствами. Такие соединения могут быть использованы для визуализации в качестве флуорогенных лигандов для РНК и белков [1–3], а также для окрашивания отдельных клеточных органелл [4, 5].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами было показано, что конформационно-фиксированный аминный аналог хромофора GFP (соединение (I), схема 1 ) может быть использован в качестве флуорогенного красителя для некоторых мутантных форм белка Blc семейства липокалинов [6]. Позднее мы также синтезировали ряд аналогов этого соединения, характеризующихся смещенными в длинноволновую область спектра поглощением и испусканием [7]. Разработка таких красителей – важная задача, т.к. поглощение света биологическими объектами в области 700–900 нм минимально. Настоящая работа – продолжение этого исследования. Известно, что введение в молекулу красителя атомов серы может привести к смещению спектральных максимумов в длинноволновую область [8, 9]. Мы исследовали эффективность такой модификации на примере аминопроизводного хромофора GFP (I). С помощью известного тионирующего реагента Лавессона мы синтезировали тиопроизводное (II) (схема 1 ).

Схема 1 . Схема синтеза производного (II). LR – реагент Лавессона (Lawesson’s Reagent), PhMe – толуол, THF – тетрагидрофуран.

Исследование оптических свойств полученного соединения (II) и сравнение их со свойствами предшественника (I) показало, что замена кислорода на серу привела к заметным изменениям. Наблюдается батохромный сдвиг спектральных максимумов на 80–120 нм (рис. 1). Величина квантового выхода флуоресценции соединения (II) варьирует в диапазоне ~10–20% и в меньшей степени зависит от используемого растворителя (табл. 1). Также было обнаружено двух-трехкратное увеличение коэффициента экстинкции (табл. 1).

Рис. 1.

Спектры абсорбции (пунктир) и эмиссии (сплошная) соединений (I) (черный) и (II) (оранжевый) в ацетонитриле.

Таблица 1.

Оптические свойства соединений (I) и (II) в разных растворителях

Растворитель Соединение Максимум абсорбции, нм Коэффициент экстинкции, M–1 см–1 Максимум эмиссии, нм Квантовый выход флуоресценции, %
Вода (I) 520 54 000 563 3
(II) 611 98 000 627 9
Метанол (I) 505 48 000 557 22
(II) 613 137 000 630 8
Ацетонитрил (I) 494 46 000 554 31
(II) 614 114 000 632 10
Этилацетат (I) 492 47 000 538 63
(II) 609 105 000 631 16
Диоксан (I) 497 51 000 538 72
(II) 610 98 000 630 23

Примечание: данные для соединения (I) взяты из статьи Baranov et al. [10].

На следующем этапе работы мы продемонстрировали, что новое тиопроизводное (II) может быть использовано как лиганд для мутанта Blc-A36C/L141N (названного ранее DiB1) [7] для окрашивания живых клеток линии HeLa Kyoto, трансфицированных конструкцией H2B-TagBFP-DiB1. Использование такой конструкции позволило не только оценить возможность применения соединения (II) в качестве флуорогена белка DiB1, но и исследовать селективность окрашивания этой метки. Так, при добавлении тиопроизводного (II) в клеточную среду наблюдалось появление флуоресцентного сигнала в красном канале (от пары DiB1–соединение (II)), который полностью соответствовал сигналу в синем канале (от белка BFP) (рис. 2), что говорит о селективности окрашивания предложенной нами пары белок–флуороген и отсутствии нецелевого окрашивания.

Рис. 2.

Флуоресцентная микроскопия живых клеток HeLa Kyoto, временно трансфицированных конструкцией, кодирующей H2B-TagBFP-DiB1, в синем (а) и красном (б) каналах. Конечная концентрация соединения (II) в растворе – 5 мкМ. Масштабный отрезок – 10 мкм.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оборудование. Спектры ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) регистрировали на приборе Fourier 300 (300 МГц; Bruker, США) при 303 K в CDCl3 (внутренний стандарт – Me4Si), спектры поглощения – на спектрофотометре Cary 100 Bio (Varian, США), спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США). Температуры плавления определяли на приборе SMP 30 (Stuart Scientific, Великобритания) и не исправляли. Масс-спектры высокого разрешения записывали на приборе micrOTOF II (Bruker, США), ионизация электрораспылением.

Синтез. Соединение (Z)-5-(4-(диэтиламино)-2-(дифторборанил)бензилиден)-2,3-диметил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-он (I) синтезировали согласно описанной ранее методике [10].

(Z)-5-(4-(Диэтиламино)-2-(дифторборанил) бензилиден)-2,3-диметил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-тион (II). К раствору соединения (I) (150 мг, 0.5 ммоль) в 8 мл смеси толуол–тетрагидрофуран (1 : 1) добавляли 2,4-бис(4-метоксифенил)-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфид (реагент Лавессона) (405 мг, 1 ммоль) и кипятили в течение 10 мин. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали на роторном испарителе. Полученный продукт дополнительно очищали с помощью колоночной хроматографии (элюент хлористый метилен–этанол, 97 : 3). Фиолетовый порошок (85 мг, 50%); т. пл. ~ 250°C с разложением; 1H-ЯМР: 7.78 (с, 1 H), 7.43 (д, J2 8.9, 1 H). 7.13 (с, 1 H), 6.63 (дд, J2 8.9, 2.7, 1 H), 3.62 (с, 3 H), 3.56 (кв, J2 7.0, 4 H), 2.83 (с, 3 H), 1.29 (т, J2 7.0, 6 H); 13C-ЯМР: 177.2, 156.3, 153.1, 137.9, 135.3, 134.4, 124.1, 115.6, 111.9, 45.2, 30.3, 29.7, 12.8; HRMS (ESI) m/z: найдено М 316.1478; рассчитано для C16H20BFN3S+, [M]+ 316.1450.

Флуоресцентная микроскопия. Клеточную линию HeLa Kyoto выращивали в среде DMEM (ПанЭко, Россия) с 50 ед./мл пеницилина, 50 мг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 10% бычьего сывороточного альбумина (HyClone, Thermo Scientific, США) при 37°C и 5% CO2. Для временной трансфекции конструкцией H2B-TagBFP-DiB1 использовали трансфекционный агент FuGENE 6 (Promega, США). Непосредственно перед съемкой среду DMEM заменяли на раствор Хэнкса (ПанЭко, Россия) с 20 мM HEPES (Sigma, США).

Широкопольную флуоресцентную микроскопию проводили с помощью микроскопа Leica 6000 (Leica, Германия) с объективом HCX PL APO 100×/1.40-0.70NA. Микроскоп оснащен камерой Zyla sCMOS (Andor, Oxford Instruments, Великобритания) и источником света CoolLED pE-300. При съемке использовали фильтры BFP и mCherry. Концентрация флуорогена в среде составляла 5 мкМ, мощность облучения – 2 В/см2 в синем канале (фильтр BFP) и 3.4 В/см2 в красном канале (фильтр mCherry).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5-Бензилиден-4H-имидазолтионы – высокоперспективная основа для создания флуорогенных красителей, характеризующаяся смещенными в длинноволновую область спектра поглощением и испусканием. Такие соединения могут быть использованы в качестве лигандов флуороген-активирующих белков для окрашивания живых клеток во флуоресцентной микроскопии.

Список литературы

  1. Paige J.S., Wu K.Y., Jaffrey S.R. // Science. 2011. V. 333. P. 642–646. https://doi.org/10.1126/science.1207339

  2. Filonov G.S., Moon J.D., Svensen N., Jaffrey S.R. // J. Am. Chem. Soc. 2014. V. 136. P. 16299–16308. https://doi.org/10.1021/ja508478x

  3. Myasnyanko I.N., Gavrikov A.S., Zaitseva S.O., Smirnov A.Yu., Zaitseva E.R., Sokolov A.I., Malyshevskaya K.K., Baleeva N.S., Mishin A.S., Bara-nov M.S. // Chem. Eur. J. 2020. V. 27. P. 3986–3990. https://doi.org/10.1002/chem.202004760

  4. Li X., Zhao R., Wang Y., Huang C. // J. Mater. Chem. B. 2018. V. 6. P. 6592–6598. https://doi.org/10.1039/C8TB01885E

  5. Ermakova Y.G., Bogdanova Y.A., Baleeva N.S., Zaitseva S.O., Guglya E.B., Smirnov A.Yu., Zagudaylova M.B., Baranov M.S. // Dyes Pigm. 2019. V. 170. P. 107550. https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2019.107550

  6. Bozhanova N.G., Baranov M.S., Klementieva N.V., Sarkisyan K.S., Gavrikov A.S., Yampolsky I.V., Zagaynova E.V., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Mishin A.S. // Chem. Sci. 2017. V. 8. P. 7138–7142. https://doi.org/10.1039/C7SC01628J

  7. Bozhanova N.G., Baranov M.S., Baleeva N.S., Gavrikov A.S., Mishin A.S. // Int. J. Mol. Sci. 2018. V. 19. P. 3778. https://doi.org/10.3390/ijms19123778

  8. Ohulchanskyy T.Y., Donnelly D.J., Detty M.R., Prasad P.N. // J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. P. 8668–8672. https://doi.org/10.1021/jp0370674

  9. Grimm J.B., Tkachuk A.N., Xie L., Choi H., Mohar B., Falco N., Schaefer K., Patel R., Zheng Qi., Liu Z., Lippincott-Schwartz J., Brown T.A., Lavis L.D. // Nat. Methods. 2020. V. 17. P. 815–821. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0909-6

  10. Baranov M.S., Solntsev K.M., Baleeva N.S., Mishin A.S., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A., Yampolsky I.V. // Chem. Eur. J. 2014. V. 20. P. 13234–13241. https://doi.org/10.1002/chem.201403678

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал