Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 845-848

ВВЕДЕНИЕ

Образование химерного гена NUP98-NSD1 происходит в результате транслокации t(5;11) (q35.2;p15.4), которая встречается при остром миелоидном лейкозе у детей в 3.8% случаев [1]. Данная транслокация – криптическая, пациенты с такой перестройкой, как правило, относятся к группе острого миелоидного лейкоза с нормальным кариотипом [2]. При экспрессии перестроенного гена образуется химерный транскрипт NUP98-NSD1, в котором 12-й экзон гена NUP98 N-концом соединяется с 6-м экзоном C-конца гена NSD1. Образуется химерный белок, в котором одна часть аминокислотной последовательности относится к белку нуклеопорину 98 (NUP98), а другая часть – к белку 1 с доменом SET, связывающим ядерный рецептор (NSD1), который входит в семейство гистоновых метилтрансфераз [3]. Считается, что наличие химерного гена NUP98-NSD1 – неблагоприятный фактор течения заболевания, еще более ухудшает прогноз присутствие реципрокной транслокации NSD1-NUP98 [4].

Сложность обнаружения перестройки t(5;11) NUP98-NSD1 заключается в том, что данная транслокация не может быть выявлена при стандартном цитогенетическом исследовании. Для определения NUP98-NSD1 используют, как правило, молекулярные методы анализа, такие как FISH, обратная транскрипция с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР), ПЦР в реальном времени [5]. Однако данная транслокация – не частое событие, и она, как правило, не входит в число мишеней в диагностических наборах для скрининга транслокаций при лейкозах. В то же время постановка дополнительных индивидуальных реакций ОТ-ПЦР на редкие транслокации, выявляемые у небольшого количества пациентов, требует затрат времени, реагентов и самого образца.

Параллельное выявление множества молекулярных мишеней с помощью гидрогелевых биологических микрочипов показало себя эффективным для анализа 22 наиболее известных клинически значимых хромосомных транслокаций при лейкозах у детей [6]. Поэтому данный подход был применен для определения транслокации NUP98-NSD1 в настоящей работе. Разработанный метод выявления химерного гена NUP98-NSD1 позволит расширить панель анализируемых хромосомных перестроек и повысить специфичность молекулярной диагностики острого миелоидного лейкоза у детей [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для разработки метода использовали контрольные образцы РНК с ранее выявленным химерным транскриптом NUP98-NSD1 (положительный контроль) и образец, не содержащий известных перестроек (отрицательный контроль). Методика анализа включала обратную транскрипцию с праймерами, специфичными для транслокаций, далее кДНК была использована в качестве матрицы в двухэтапной ПЦР. На втором этапе в ПЦР-смесь добавляли Cy5-dUTP и получали флуоресцентно-меченый ПЦР-продукт, который гибридизовали на биочипе с иммобилизованными зондами. Картины гибридизации для различных образцов представлены на рис. 1. Секвенирование ПЦР-продукта показало, что при образовании химерного транскрипта происходит слияние экзона 12 гена NUP98 и экзона 6 гена NSD1 (рис. 2). Это соответствует картине гибридизации на биочипе. Последовательности зондов представлены в табл. 1. Наиболее яркое свечение наблюдается для зондов 2, 5 и 6, в дальнейшем эти зонды будут использованы для включения в расширенную панель для анализа транслокаций при лейкозах у детей.

Рис. 1.

Картины гибридизации на биологическом микрочипе: (а) – образец без транслокации, наблюдаются флуоресцентные сигналы от ячеек, содержащих маркер (М) и зонды для контрольного гена ABL: (б) – образец, содержащий транслокацию NUP98-NSD1, 1, 2 – ячейки с зондом, комплементарным месту слияния двух генов (12-й экзон гена NUP98 и 6-й экзон гена NSD1; 3, 4 и 5, 6 – ячейки с зондами, комплементарными последовательностям генов NUP98 и NSD1 соответственно; номера ячеек соответствуют номерам зондов в табл. 1.

Рис. 2.

Результаты секвенирования химерного ПЦР-продукта NUP98-NSD1. Пунктирной линией обозначено место слияния 12-го экзона гена NUP98 и 6-го экзона гена NSD1. Схематично представлено распределение зондов 1–6 по длине химерного ПЦР-продукта.

Разработанный метод был использован для поиска химерного транскрипта NUP98-NSD1 в образцах пациентов с острым миелоидным лейкозом (всего 36 образцов). Среди них для шести образцов были получены положительные флуоресцентные сигналы c NUP98-NSD1-зондами. Наличие химерного транскрипта также проверяли методом ОТ-ПЦР с последующим электрофорезом в 2%-ном агарозном геле. Длина выявленного продукта в NUP98-NSD1-положительных образцах составила 550 нт, что соответствует расчетной длине химерного ПЦР-продукта, содержащего перестройку NUP98-NSD1.

Для определения аналитической чувствительности метода РНК с NUP98-NSD1 смешивали в пропорциях 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000 с РНК, не содержащей данную перестройку, далее проводили анализ с использованием биочипа. Нижний предел обнаружения специфичных флуоресцентных сигналов для NUP98-NSD1 соответствовал разведению исходной РНК в 1000 раз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали 36 образцов костного мозга пациентов с острым миелоидным лейкозом. Возраст пациентов от 1 года до 18 лет. Фракцию лейкоцитов выделяли в результате гемолиза образцов костного мозга в 0.8%-ном растворе NH₄Cl и центрифугирования при 1500 g в течение 10 мин.

В ходе обратной транскрипции была синтезирована кДНК на матрице мРНК, выделенной из лейкоцитов костного мозга пациентов, с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия). Для получения кДНК химерного гена были подобраны праймеры, комплементарные участку экзона гена, расположенного на 3'-стороне химерного транскрипта. В качестве контроля выделения РНК и прохождения ОТ-ПЦР использовали ген домашнего хозяйства ABL (ABL1), который кодирует белок тирозин-протеинкиназу и экспрессируется во всех клетках. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 25 мкл с использованием набора РЕВЕРТА-L (АмплиСенс, Россия): 10 мкл RT-mix (АмплиСенс, Россия), 10 мкл РНК, 1 мкл ревертазы MMlv (АмплиСенс, Россия), 5 пмоль специфичного праймера и 20 пмоль праймера ABL. Для наработки одноцепочечного меченого фрагмента ДНК для гибридизации на гидрогелевом микрочипе использовали метод “гнездовой” ПЦР в два этапа, как описано ранее [8]. ПЦР проводили в термоциклере T100 (Bio-Rad, США) по следующей программе: 95°С – 5 мин; далее 35 циклов: 95°С – 20 с, 62°С – 20 с, 72°С – 30 с; 72°С – 3 мин. В ходе первого этапа происходила наработка двухцепочечного продукта на основе кДНК, на втором этапе в реакционную смесь добавляли 1 мкл ПЦР-продукта первого этапа и проводили асимметричную ПЦР и флуоресцентное маркирование конечного ПЦР-продукта.

Последовательности праймеров для обратной транскрипции: ABL1_ОТ 5'-GGACACACCATAGACAGT-3', NSD1_OT 5'-CAAGAACTGGAGGC-3'.

Последовательности праймеров ПЦР этапа 1: ABL1_Fex 5'-CAATGCCGCTGAGTATCTGCT-3', NUP98_Fex 5'-GCTTGGTGCAGGAT-3' и ABL1_Rex 5'-GCGTTCCATCTCCCACTTGT-3', NSD1_Rex 5'-GCTAGAAGGCTTTCCTCTTC-3'.

Последовательности праймеров ПЦР этапа 2: ABL1_F 5'-AGCTTCTTGGTGCGTGAGAGT-3', NUP98_F 5'-TGCTGGACAGGCATCT-3' и ABL1_R 5'-GCCACCGTTGAATGATGATGA-3', NSD1_R 5'-CTTACCTTGTGCACCTGCTC-3'.

Флуоресцентно-меченый продукт второго этапа ПЦР гибридизовали на биочипе. Биочипы изготавливали методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля, как описано ранее [6, 8]. Последовательности зондов приведены в табл. 1. Гибридизационная смесь с общим объемом 35 мкл содержала 6× SSPE (Promega, США), 2 М раствор гуанидин-изотиоцианата и амплификат. Гибридизационную смесь полностью денатурировали при 95°С, быстро охлаждали на льду, наносили на биочип и инкубировали в течение 10–12 ч при 37°С. Затем биочип отмывали в растворе 1× SSPE в течение 10 мин при комнатной температуре и высушивали.

Флуоресцентные сигналы регистрировали с помощью анализатора биочипов (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Россия), анализ изображения проводили с помощью программы ImageWare (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Россия). Секвенирование по Сэнгеру проводили на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием ПЦР-продукта первого этапа и праймера NUP98_Fex или NSD1_Rex в концентрации 5 пмоль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод анализа с помощью биологического микрочипа специфично выявляет химерный транскрипт NUP98-NSD1 в образцах костного мозга пациентов с острым миелоидным лейкозом. Чувствительность метода такова, что позволяет обнаруживать одну лейкемическую клетку среди 1000 нормальных клеток, что позволяет проводить не только молекулярно-генетическую диагностику в острый период заболевания, но и мониторинг минимальной остаточной болезни в ходе лечения. Далее планируется включить разработанные наборы праймеров и зондов в состав диагностической тест-системы для определения клинически значимых транслокаций при лейкозах у детей.