Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 1, стр. 22-31

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Штаммы RmlP001^T и RmlP026^T рода Lichenibacterium выделены ранее (Pankratov et al., 2020) из отмытых от эпифитной микрофлоры гомогенатов лишайника Ramalina pollinaria (Westr.) Ach. и охарактеризованы как два новых вида – L. ramalinae и L. minor. Талломы лишайника были собраны со стволов березы (Betula pubescens Ehrh.) на территории Беломорской биологической станции МГУ им. М.В. Ломоносова (66.549970, 33.113218) в 2016 г.

Анализ геномов. Аннотированные в GenBank геномные сборки анализировали с использованием программ Unipro UGENE 38.1 (Okonechnikov et al., 2012) и BIOEDIT v. 7.0.5.3 (Hall, 1999). Выравнивание амнокислотных и нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритма MUSCLE в программе MEGA X (Kumar et al., 2018). Филогененетический анализ и построение деревьев осуществляли с использованием программ MEGA X, Unipro UGENE 38.1, сервиса IQ Tree (http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/) (Trifinopoulos et al., 2016) и FigTree 1.4.4 с использованием конкатенированных аминокислотных последовательностей целевых белков. Для поиска ортологичных генов использовали базу данных COG (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog) (Tatusov et al., 1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Белки систем нодуляции. В ходе анализа геномов двух видов Lichenibacterium белки, близкие по первичной структуре nod белкам бактерий группы ‘rhizobia’ обнаружены не были. Таким образом, следует исключить вероятность присутствия сходного с ризобиальными бактериями механизма инвазии в хозяйский организм. Несмотря на то, что группы генов nod в геномах изученных бактерий отсутствуют, у L. ramalinae был обнаружен ген, кодирующий белок TIGR02302 (https:// www.uniprot.org/uniprot/A0A068SVH1). У мутантов Azorhizobium caulinodans, нокаутированных по этому гену, была показана утрата способности к инфицированию хозяйского растения и чрезмерной продукции экзополисахарида (Sato et al., 2016). Этот же белок найден у Brucella suis, паразита, вызывающего бруцеллез свиней и Sinorhizobium meliloti, мутуалистической бактерии люцерны. Белки этого типа обладают высоким генетическим полиморфизмом, так как даже у одного вида, например Bartonella quintana (патоген, вызывающий окопную лихорадку), доля нуклеотидных замен может возрастать до уровня 2.5%. Потенциально, белки этого типа могут рассматриваться как факторы инвазии в лишайниковый таллом. Эволюционный филогенетический анализ белков TIGR02302 у L. ramalinae и L. minor показал (рис. 1), что у обоих штаммов этот ген формирует отдельный кластер в пределах ветви, в которую входят как выделенные из небиологических субстратов бактерии Chelatococcus reniformis, Alsobacter soli (Gu et al., 2016; Sun et al., 2018), так и эпифит растений Methylobacterium haplocladii (Tani, Sahin, 2013) или клубеньковые симбионты Methylobacterium nodulans (Jourand et al., 2004). Учитывая, что среди аннотированных в базе NCBI последовательностей этого гена, большая часть ассоциирована с эпифитными бактериями или бактериями симбионтами растений, мы можем предположить, что бактерии Lichenibacterium в лишайниках потенциально могут быть ассоциированы с зелеными водорослями, а не с грибами.

Рис. 1.

Эволюционный анализ филогении гена TIGR02302 методом максимального правдоподобия. Эволюционная история была определена с помощью метода максимального правдоподобия и модели Jones et al. w/freq. Показано дерево с наибольшим логарифмическим правдоподобием (–36249.81). Процент деревьев, в которых соответствующие таксоны кластеризуются вместе, показан рядом с ветвями. Исходные деревья для эвристического поиска были получены автоматически путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице парных расстояний, оцененных с помощью модели JTT, а затем выбора топологии с наибольшим значением логарифмического правдоподобия. Дерево нарисовано в масштабе, длина ветвей измеряется в количестве замен на сайт. В данном анализе участвовали 39 аминокислотных последовательностей. Всего в окончательном наборе данных было 1052 позиции.

Флагеллины и пилины. Особенностью эндолихенобионтов L. ramalinae и L. minor является наличие у них клеточного цикла развития. На ранних этапах роста культуры их клетки подвижны за счёт жгутика. Позднее они утрачивают жгутик и переходят к пленочному или колониальному росту. Такие особенности жизненного цикла предполагают наличие белков, участвующих в формировании жгутика и контроле его активности – флагеллинов, а также белков фиксации на твердой поверхности – пилинов. Большая часть генов белков сборки пилей исследованных бактерий имеют низкий уровень гомологии с большинством бактерий в пределах класса Alphaproteobacteria и только немногие имеют уровень гомологии более 50% (табл. 1).

Низкий уровень гомологии предполагает наличие новых семейств таких белков, что обусловлено селекцией в лишайниковых симбиозах и изоляцией представителей семейства Lichenibacteriaceae как отдельно эволюционирующей ветви порядка Hyphomicrobiales. Несмотря на тесную ассоциацию бактерий рода Lichenibacterium с лишайниками, их пилины имеют более выраженную гомологию с генами корневых симбионтов растений (Ueki et al., 2010; Li et al., 2018), эпифитных (Tani et al., 2012; Madhaiyan, Poonguzhali, 2014) и выделенных из небиологических сред (Urakami et al., 1995; Van Aken et al., 1995; Gallego et al., 2005) представителей класса Alphaproteobacteria. Единственный охарактеризованный на данный момент представитель семейства Lichenihabitantaceae (кластера LAR1), Lichenihabitans psoromatis, изолированный из лишайника (Noh et al., 2019), несмотря на сходство экологических ниш обитания, не имеет пилинов, а гены флагеллинов ограничены motA и тремя генами биосинтеза и экспорта (fliO, fliQ, fliJ).

У обоих видов Lichenibacterium присутствуют полные опероны, включающие все необходимые гены для сборки мотора и жгутика (fliEFGIJKNPQR; flgABCDEFGIJ; motA). Недавно у Caulobacter crescentus показано наличие зависимости адгезии от активности комплекса белков, отвечающих за активное перемещение (Hug et al., 2017). В частности, мутанты ∆fliFG, ∆motA, ∆motB и ∆fliL теряли способность эффективно прикрепляться к поверхности субстрата. Продукты экспрессии этих генов участвовали в механорецепции поверхности и запускали механизм сбрасывания жгутика и перехода к стационарному существованию в виде биопленки на поверхности субстрата. Мутанты, у которых был нокаутирован ген motA, не были способны перейти от планктонной стадии к биопленочному фенотипу. Мы предполагаем, что L. ramalinae и L. minor обладают сходными механизмами фомирования биопленочного фенотипа при внедрении клеток этих бактерий в талломы лишайников.

Белки инвазии локуса B (IalB). Эти белки ассоциированы с комплексом инвазии в эритроциты у Bartonella bacilliformis, эндопаразита семейства Bartonellaceae (Hyphomicrobiales). Ранее было показано (Coleman, Minnick, 2001), что нокаутированные по гену ialB бактерии утрачивали способность к адгезии и последующей инвазии в эритроциты. Гомологи этого белка были также обнаружены в бактериях родов Bradyrhizobium и Rhizobium, ассоциированных с корнями растений. Однако анализа их функции у этих бактерий в литературе найти не удалось. Интересно, что в работе Colleman и Minnick (2003) определение количества белка IalB с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга показало наибольшее количество IalB в кислых условиях или при 20°C, в то время как при 37°C и в основных условиях синтезировалось наименьшее количество этого белка. Известно (Pankratov, 2012), что водные гомогенаты лишайников имеют рН менее 5.0, а оптимальные температуры для роста большинства бактериальных изолятов нетропических лишайников находятся в диапазоне от 15 до 25°С. В настоящее время эти белки обнаружены, согласно базе ортологичных генов COG, главным образом в группах Alphaproteobacteria (109 организмов) и Gammaproteobacteria (19 организмов) и Betaproteobacteria (1 организм). У бактерий L. ramalinae и L. minor эти белки могут потенциально использоваться для адаптации к кислой среде талломов.

Integration host factor (IHF). Эти белки обычны в прокариотах, так как участвуют в регуляции транскрипции, связывая ДНК и придавая ей специфическую структуру. У обоих видов Lichenibacterium они представлены двумя субъединицами, α и β. Несмотря на то, что эти белки не участвуют напрямую, как например белки нодуляции или секреции, в ассоциации с хозяйским организмом, они способны регулировать ряд функций бактериальной клетки, связанной с вирулентностью, а также резистентностью к ряду факторов. Так, например, у E. coli IHF активирует экспрессию определенного набора генов, необходимых для выживания при чрезвычайно низких значениях pH (Bi, Zhang, 2014). Stonehouse и et al. (2008) показали, что инактивация ihfA и ihfB, генов, кодирующих субъединицы IHF, снижает уровни экспрессии двух основных факторов вирулентности tcpA и ctx и предотвращает выработку пилина Vibrio cholerae, регулируемого токсином, и холерного токсина. У Lichenibacterium наиболее близкими гомологами по этим генам оказались Rhabdaerophilum calidifontis, а также представители родов Camelimonas и Microvirga с уровнем гомологии более 74%. Известно, что два вида рода Camelimonas выделены из плаценты и молока теплокровных животных, а среди видов рода Microvirga три являются симбионтами растений (Kämpfer et al., 2012; Rad et al., 2014; Zhang et al., 2015). Rhabdaerophilum calidifontis недавно выделен из осадков горячих источников и описан как представитель нового семейства Rhabdaerophillaceae в порядке Hyphomicrobiales (Ming et al., 2020).

Другие факторы вирулентности. К факторам вирулентности относят ряд белков, участвующих в рецепции сигналов хозяйского организма, рецепции и транспорте сидерофоров и ферменты синтеза антибиотиков.

Сенсорные гистидин киназы. В геномах обоих штаммов Lichenibacterium были найдены гены, кодирующие сенсорные гистидин киназы и гибридные сенсорные гистидин киназы и регуляторы отклика. Эти ферменты регулируют взаимодействие с хозяйским организмом путем контроля передачи сигнала двухкомпонентными системами (TCS) с последующим автофосфорилированием консервативного остатка гистидина в ответ на стимул. Ближайшими гомологами генов гистидин киназ исследуемых бактерий являются гены гистидин киназ родственных бактерий класса Alphaproteobacteria, для которых функции этих белков могут быть предсказаны только на основании имеющихся в литературе данных. Наиболее близкими гомологами оказались гистидиновые киназы бактерий, представляющих семейства Beijerinckiaceae, Methylobacteriaceae и Lichenihabitantaceae (рис. 2). Выявлены различия в составе и количестве ортологичных генов, кодирующих гистидин киназы, у L. ramalinae и L. minor. Так, например, в геноме L. minor найдены два ортологичных гена kdpD, в то время как у L. ramalinae эти гены не найдены (рис. 2г). KdpD в сочетании с KdpABC регулирует калиевый гомеостаз и вирулентность у различных видов бактерий (Dutta et al., 2021). Интересно, что гистидин киназы, содержащие домен HAMP (Histidine kinases, Adenylate cyclases, Methyl accepting proteins and Phosphatases), формируют изолированный кластер семейства Lichenibacteriaceae (рис. 2а, 2б), что может быть использовано как дополнительный инструмент в филогеномном анализе бактерий кластера LAR1 и Hyphomicrobiales. В целом, в геноме L. ramalinae содержится 18 аминокислотных последовательностей различных типов гистидин киназ, а в геноме L. minor – 26. Недавние результаты подтверждают участие гистидиновых киназ в бактериальных сенсорных системах, контролирующих концентрацию кислорода и окиси азота в среде роста (Gondim et al., 2022).

Рис. 2.

Эволюционный анализ филогении генов, кодирующих HAMP-содержащие гистидиновые киназы (а, б), гибридные сенсорные киназы (в) и KdpD-содержащие гистидиновые киназы (г) методом максимального правдоподобия. Эволюционная история была определена с помощью метода максимального правдоподобия и модели Jones et al. w/freq. Исходные деревья для эвристического поиска были получены автоматически путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице парных расстояний, оцененных с помощью модели JTT, а затем выбора топологии с наибольшим значением логарифмического правдоподобия.

Рецепция и транспорт сидерофоров. TonB-зависимые транспортеры (TBDTs) это белки внешней мембраны бактерий, которые связывают и переносят хелаты железа, называемые сидерофорами, а также витамин B12, комплексы никеля и углеводы. Процесс переноса требует энергии в виде протонной двигательной силы и комплекса из трех белков внутренней мембраны, TonB-ExbB-ExbD, для передачи этой энергии на внешнюю мембрану. У обоих штаммов гены, кодирующие эти белки, найдены. TonB рецепторы оказались гомологичным таковым у бактерий Nitrobacter winogradskyi, Archangium violaceum, Cystobacter fuscus с уровнем гомологии 45–50% и величиной Query Cover 97%. Наибольший уровень гомологии характерен для Lichenihabitans psoromatis – 57.64% при величине Query Cover 96%.

Монооксигеназа синтеза антибиотиков (Abm). У L. ramalinae обнаружено шесть паралогов этого фермента, а у L. minor – пять.

Наиболее филогенетически близкими к генам Abm Lichenibacterium оказались гомологи Lichenihabitans psoromatis (величина сходства 64.29%) и Rhizobium arenae (53.12%). Некоторые ортологи, как например Abm WP_129219385 L. ramalinae, имели высокое сходство с генами эпифитных Methylobacterium, выделенных с поверхности листьев различных растений (величина сходства 70–74%). У L. minor гомологами по гену abm оказываются симбиотические бактерии Aureimonas psammosilene, штаммы группы Mezorhizobium, патоген человека Comamonas testosteroni, а также свободноживущие Hyphomicrobium zavarzinii и Skermanella mucosa (табл 2).

Ферменты этого суперсемейства участвуют в синтезе поликетидных антибиотиков (Grocholski et al., 2012). Недавно показана способность монооксигеназы регулировать инвазию патогенных грибов в ткани растений (Patkar, Naqvi, 2017). В частности, монооксигеназа служит эффекторным пептидом, способствующим последующей колонизации тканей. Интересно, что ортологи Аbm паразитического грибка Magnaporthe oryzae были обнаружены только у нескольких видов симбиотических бактерий, что позволяет предположить, что патогенная линия приобрела Аbm, вероятно, путем горизонтального переноса генов от ризосферных бактерий.

Известно, что наиболее эффективными защитными механизмами растений являются гормоны и гормоноподобные соединения, такие как салициловая кислота, жасмоновая кислота или этилен. Эти же соединения способны выделять и зеленые водоросли (Tarakhovskaya et al., 2007). Так например, Pichler et al. (2020) обнаружили, что индолил уксусная, индолил масляная, абсцизовая, жасмоновая кислоты, гиббереллин A3 (GA3) и GA4 высвобождаются внеклеточно у водорослей рода Trebouxia и Asterochloris (фотобиотны лишайников). Показано, что Abm способны инакивировать жасмоновую кислоту, выделяемую растением в ответ на заражение патогенными грибами (Patkar, Naqvi, 2017). Наличие нескольких копий паралогичных генов этого белка может быть индикатором их функциональности, что позволяет высказать предположение о наличии сходных с вышеприведенным механизмом инвазии Lichenibacterium в лишайниковый таллом.

Таким образом, анализ геномов двух бактериобионтов лишайников L. ramalinae и L. minor обнаружил генные детерминанты, обеспечивающие синтез факторов адгезии, белков пилинов и флагеллинов, способствующие фиксации клеток на грибном мицелии и на клеточных стенках водорослей. Наличие двух фенотипов – планктонного и пленочного позволяют бактериям рода Lichenibacterium мигрировать в формирующиеся подеции лишайников и далее интегрироваться в них, переходя в пленочный фенотип. Значения гомологии отдельных изученных генов, продукты экспрессии которых обеспечивают регуляцию интеграции, адаптации и выживания, позволяют дополнить нашу гипотезу (Pankratov et al., 2022) о более тесной физиологической связи бактерий рода Lichenibacterium с зелеными водорослями, чем с грибами.

Номера доступа DDBJ/ENA/GenBank для последовательностей, проанализированных в этом исследовании, следующие: QYBC000000 (геном штамма RmlP001^T) и QYBB000000 (геном штамма RmlP026^T).

Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит результатов исследований, полученных с использованием животных в качестве объектов.

Конфликт интересов. Автор заявляет, что у него нет конфликта интересов.

Финансирование. Работа финансово поддержана Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Госзадание “Микробиология инновационных биотехнологий”, № 122040800164-6) и, частично, средствами гранта РФФИ (19-04-00297а).

Благодарности. Автор благодарит лихенолога, сотрудника кафедры экологии, ботаники и охраны природы Самарского национального исследовательского университета имени акад. С.П. Королева и Е.С. Корчикова за идентификацию лишайника.