Российские нанотехнологии, 2022, T. 17, № 6, стр. 791-798

ВВЕДЕНИЕ

Гидроксиапатит (ГА) – минеральный компонент костной ткани – широко используется при создании материалов для регенеративной медицины [1]. В случае небиодеградируемых имплантов ГА наносят в качестве покрытия для улучшения остеоинтеграции материала, а при формовании биодеградируемых материалов для тканевой инженерии его вводят в качестве наполнителя [2–6]. Наноразмерная форма гидроксиапатита во многих случаях наиболее удобна и с точки зрения формования материалов, и с точки зрения его биосовместимости [2]. Благодаря широкому спектру методов синтеза ГА можно получать его наночастицы с различной морфологией и размером [7–9].

При создании нанонаполненных биодеградируемых материалов важную роль играет этап диспергирования наноразмерного ГА в полимерной матрице [10]. В качестве полимерной матрицы широко используют сложные полиэфиры (полилактид, поликапролактон и т.д.) [4, 11], природные высокомолекулярные соединения и их модификации − белки (коллаген, фиброин, желатин и т.д.) и полисахариды (хитозан, гиалуроновая кислота, альгинаты и т.д.) [12–16]. В случае наполнения термопластов широко применяют экструзионные технологии [11, 17], в том числе совмещенные с предварительным смешением в мельницах шарового типа [4]. Природные полимеры, как правило, растворяются в водных средах, и наночастицы гидроксиапатита (нГА) диспергируют в них с использованием ультразвуковой (УЗ) обработки [18, 19]. Одним из наиболее интересных биополимеров для применения в регенеративной медицине является гиалуроновая кислота (ГК), которая находится в составе внеклеточного матрикса многих тканей человека [20]. ГК широко используется в косметологии в качестве дермальных филлеров [21], а в медицине в качестве раневых повязок [22] или для получения матриксов для тканевой инженерии, т.е. имплантируемых биодеградируемых материалов, которые могут служить в качестве временной подложки для адгезии и роста клеток и замещаться здоровой тканью [20]. Одной из областей применения матриксов на ее основе также является стоматология, что обусловлено наличием ГК в пародонтальных тканях и существенной ролью в противовоспалительных процессах [23]. Гидрогели на основе ГК были предложены для регенерации пульпы [24, 25]. Создание гибридных материалов из ГК, наполненных нГА, является перспективным для регенерации костных тканей, но требует предварительного исследования процесса диспергирования и стабилизации минеральных наночастиц в полимерной матрице. В [26] предложен метод получения стабильных дисперсий путем синтеза наноразмерного ГА в активной среде гиалуроната.

Целью работы являются исследование процесса УЗ-диспергирования нГА в растворах гиалуроната натрия, изучение стабильности полученных дисперсий и оценка эффективности диспергирования при получении материалов на их основе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Натриевую соль ГК бактериального происхождения с молекулярной массой (ММ) 1 × 10⁶ (Shiseido Co., Ltd Kakegawa Factory, Япония) и нГА (Aldrich 677418, размер частиц <200 нм) использовали без дополнительной очистки.

Растворы ГК в дистиллированной воде готовили перемешиванием на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 2–4 ч. Суспензии нГА в растворе ГК получали добавлением в раствор навески ГА с последующим перемешиванием на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 1–1.5 ч. Затем суспензию диспергировали с помощью УЗ в течение 15 мин. Взвесь нГА в чистой воде также диспергировали с помощью УЗ в течение 15 мин.

Для УЗ-обработки применяли УЗ-ванну производства ПСБ-Галс (г. Москва) модели ПСБ-4035-05 (частота 35 кГц). Измерение размера частиц методом динамического рассеяния света (ДРС) проводили на приборе Zetatrac (Microtrac, США) при угле рассеяния 180° с использованием программы MicrotracV 10.5.3.

Динамическую вязкость растворов измеряли на вибрационном вискозиметре SV-10А производства AND (Япония) в открытой ячейке при заданной температуре. Перед измерениями вискозиметр был откалиброван по воде при 25.0°С, точность измерений – 0.1 мПа · с. Представленные величины рассчитаны путем усреднения данных трех независимых экспериментов, величина отклонения не превышала ±10%.

Спектральное распределение коэффициента ослабления измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV 2501 PC в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см и 2 мм. Для обработки полученных результатов из спектров поглощения растворов вычитали спектр поглощения растворителя – дистиллированной воды. При анализе проб с нГА на седиментацию раствор между измерениями оставался в кювете и не перемешивался.

Пленки из ГК, в том числе наполненные нГА в концентрациях 1, 5 и 10 мас. %, получали из водных растворов натриевой соли ГК с концентрацией 1 мас. % методом полива на чашки Петри из полистирола. Все суспензии предварительно обрабатывали в УЗ-ванне в течение 15 мин. Пленки сушили в беспылевом шкафу до полного испарения растворителя. Толщина пленок составляла ∼50 мкм. Распределение нГА в пленочных образцах исследовали с помощью оптической микроскопии (Leica Microsystems, Германия) и УФ-спектрофотометрии.

Исследование морфологии и химической структуры поверхности пленок из ГК, наполненных нГА в разных соотношениях, проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС) с использованием Phenom ProX (Thermo Fisher Scientific, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние УЗ-обработки на вязкость растворов гиалуроната натрия. Для равномерного распределения нГА в растворе ГК использовали УЗ-обработку, которая согласно данным [27] также может приводить к частичной деструкции ГК. Влияние УЗ-обработки на характеристики ненаполненного раствора ГК с концентрацией 0.25 мас. % исследовали вискозиметрически. Как видно из рис. 1, величина вязкости η снижается практически линейно до восьми минут обработки, а затем изменяется незначительно, понижаясь примерно в 1.5 раза по сравнению с исходным значением. В [27] снижение ММ полимера тоже происходило в первые минуты обработки, и это связывают с тем, что молекулы с большей ММ сильнее подвержены деструкции цепей полимера при УЗ-обработке, чем молекулы меньшего размера. В этой же работе отмечена предельная ММ гиалуроновой кислоты (около 50 кДа), при достижении которой дальнейшая деструкция практически не протекает даже при длительном озвучивании. В настоящей работе для получения воспроизводимых результатов выбрано время УЗ-обработки 15 мин.

Влияние концентрации растворов гиалуроната натрия на стабильность суспензии нГА. Гидроксиапатит в воде образует неустойчивую суспензию, которая быстро оседает. Спектральное распределение коэффициента ослабления света указывает на рассеяние света крупными частицами (рис. 2). В диапазоне длин волн 300–700 нм интенсивность рассеяния хорошо описывается зависимостью $I\sim 1{\text{/}}{{\lambda }^{p}}$, где p = 1.3–1.5. Такая величина показателя степени характерна для крупных частиц диаметром 0.5–1 мкм [28]. Средний диаметр частиц по данным ДРС составил 750 ± 300 нм. В [6] при УЗ-обработке такого же ГА в воде было получено широкое полимодальное распределение размеров частиц: от 100 нм до нескольких микрон, причем имелась фракция, близкая по размерам к представленной на рис. 2. Различие заключается в использовании в [6] УЗ-диспергатора погружного типа, в котором получаемая на единицу объема мощность превышает аналогичный показатель использованной нами УЗ-ванны.

Влияние концентрации ГК на стабильность суспензии ГА исследовали при постоянной концентрации нГА (0.01 мас. %), варьируя концентрацию ГК (0–0.25 мас. %). Верхний концентрационный предел для гиалуроната натрия связан с высокой вязкостью раствора полимера данной ММ даже после УЗ-обработки. Стабильность суспензии оценивали по спектру ослабления света, который по форме близок к показанному на рис. 2, при этом поглощение исходного гиалуроната натрия находится в области длин волн короче 300 нм, а рассеяние практически отсутствует. Для анализа стабильности суспензий нГА была выбрана область спектра 350–650 нм, в которой наблюдается только рассеяние света.

В процессе осаждения нГА из суспензий спектр ослабления света “проседает”. С целью повышения точности наблюдений ослабление света измеряли не в одной точке, а во всем выбранном диапазоне, т.е.

где S_t – интегральное рассеяние света в момент времени $t$, D(λ) – оптическая плотность по длине волны λ.

Затем рассчитывали относительное интегральное рассеяние света k:

где S₀ – интегральное рассеяние света в момент времени $t$ = 0.

На рис. 3 представлено изменение относительного интегрального рассеяния света для суспензий нГА с разным содержанием ГК.

В растворах с концентрацией ГК 0.01 и 0.05 мас. % нГА лучше удерживается в объеме по сравнению с дистиллированной водой (рис. 3). Однако с течением времени наблюдается его седиментация, что сопровождается ростом показателя степени p в зависимости $I\sim 1{\text{/}}{{\lambda }^{p}}$ от 1.4 до 2.1 и указывает на снижение размера частиц ГА, остающихся в растворе. Очевидно, что первыми оседают более крупные частицы/агрегаты.

При увеличении концентрации гиалуроната натрия до 0.1 мас. % также наблюдается небольшое снижение величины относительного интегрального рассеяния, а при использовании раствора ГК с концентрацией 0.25 мас. %, наоборот, отмечается его рост. Вероятнее всего это связано с флуктуациями оптической плотности в образце и возможностью агрегации ГА без его седиментации. О последнем из перечисленных предположений свидетельствует снижение показателя степени p в зависимости $I\sim 1{\text{/}}{{\lambda }^{p}}$ с 1.4 до 1.0. Аналогичный рост интенсивности рассеяния наблюдался ранее на золях BaSO₄ при увеличении размеров частиц с сохранением концентрации [28]. В эксперименте с концентрацией 0.25 мас. % ГК седиментации нГА практически не наблюдается в течение 24 ч.

Увеличение концентрации ГК в растворе ожидаемо сопровождается увеличением вязкости (табл. 1). После УЗ-обработки вязкость растворов понижается в 1.5–2 раза.

Увеличение вязкости раствора ГК, согласно закону Стокса, приводит к снижению скорости оседания частиц ГА. Также в [26] было показано, что гиалуронат стабилизирует дисперсию нГА путем адсорбции на частицах со связыванием их в трехмерную сетку.

Таким образом, стабильность суспензии нГА в воде повышается при увеличении концентрации ГК.

Определение предельного соотношения гиалуроната натрия и нГА. Описанный выше эксперимент проводили при низком содержании нГА в растворе (0.01 мас. %). Для получения материалов обычно требуются более высоконаполненные суспензии, поэтому необходимо было оценить максимальную концентрацию нГА, который удерживается в растворе ГК.

Для оценки оптимального соотношения компонентов были приготовлены суспензии, содержащие 0.25 мас. % ГК и нГА в концентрации 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 и 0.5 мас. %. Для всех растворов измеряли относительное интегральное рассеяние света (рис. 4), как описано выше. Из данных, приведенных на рис. 4, следует, что седиментация ГА практически не наблюдается в течение 8 ч до его содержания 0.3 мас. %, т.е. до содержания 120% нГА от массы ГК. При содержании ГА 0.5 мас. % (200% от массы ГК) наблюдается седиментация. В суспензиях, содержащих 0.01–0.1 мас. % нГА, показатель степени p в зависимости $I\sim 1{\text{/}}{{\lambda }^{p}}$ с течением времени снижается от 1.3–1.4 до 1, а в содержащих 0.2 и 0.3 мас. % нГА, – остается практически постоянным (1.26 и 1.2 соответственно). Это показывает, что в исследуемых суспензиях происходит агрегация частиц нГА без их седиментации. В суспензии с содержанием 0.5 мас. % нГА определить величину показателя степени p затруднительно.

Вискозиметрические измерения суспензий показали, что присутствие частиц ГА при УЗ-обработке понижает вязкость системы по сравнению с чистой ГК (табл. 2). По-видимому, механические частицы при озвучивании усиливают деструкцию ГК. Вязкость полученных суспензий практически не зависит от содержания нГА.

Таким образом, максимально возможное содержание нГА в 0.25%-ном растворе ГК составляет 120% от массы полимера. Данные суспензии сохраняют стабильность в течение 8 ч, чего достаточно для формования материалов на их основе с использованием различных методов. Исходя из полученных результатов концентрация ГК в растворе может быть увеличена при сохранении соотношения нГА/ГК 1–1.2. Максимальная концентрация суспензий в данном случае будет определяться визуальной однородностью полученных образцов, поскольку использовать оптические методы для контроля уже невозможно.

Материалы из гиалуроната натрия, наполненные нГА. Получение дисперсии нГА в растворе ГК во многих случаях является только промежуточным этапом при формовании нанонаполненных материалов на основе ГК. Однородность распределения нГА в объемных материалах исследовать затруднительно, это требует более сложных в аппаратурном оформлении методов по сравнению с методом спектрофотометрии. Поэтому для оценки поведения нГА в гиалуронате натрия при удалении растворителя в настоящей работе исследовали однородность распределения нГА в пленках, сформованных методом полива дисперсии нГА в 1 мас. %-ном водном растворе ГК. Концентрацию нГА варьировали от 1 до 10 мас. % по отношению к сухому полимеру, т.е. она не превышала соотношения нГА/ГК, обеспечивающего стабильность наночастиц в растворе полимера. Для полного испарения растворителя и отверждения пленок потребовалось ~72 ч.

На рис. 5 представлены спектры ослабления света в пленках, сформованных из ненаполненого гиалуроната натрия и содержащего нГА. Для полученных пленок характерно рассеяние в исследуемой области, аналогичное рассеянию в растворе нГА в воде (рис. 2). Интегральное рассеяние света в области 350–650 нм, рассчитанное по описанной выше методике, практически линейно зависит от концентрации нГА в пленках (рис. 5, вставка). Это указывает на сохранение заложенного соотношения нГА/ГК при испарении растворителя и достаточно высокую однородность полученных пленочных материалов.

Исследование морфологии пленок методом оптической микроскопии показало (рис. 6), что в пленках, содержащих 1 мас. % нГА, присутствуют в основном отдельные частицы размером 1–1.5 мкм, что близко к данным, полученным для суспензий нГа в растворах ГК. При увеличении концентрации нГА в наполненных пленках наблюдаются агрегаты, количество и размеры которых также увеличиваются с увеличением степени наполнения. В пленочном образце, содержащем 10 мас. % нГА, размер агрегатов достигает 10–15 мкм.

Изучение морфологии поверхности пленок из ГК, наполненных нГА в разных соотношениях, показало, что часть агрегатов выходит на поверхность материала, но в этом случае видно, что они состоят из отдельных частиц (рис. 7). Из данных ЭДС следует, что химический состав поверхности содержит все элементы, характерные для гиалуроната натрия (C, O, N, Na) и ГА (Ca, P, O). СЭМ также показала увеличение числа и размеров агрегатов нГА при увеличении концентрации ГА в полимерной пленке.

Формование пленок методом полива из суспензий является частным случаем с точки зрения проверки устойчивости суспензий. Многие методы получения объемных материалов из ГК (в том числе лиофильная сушка, лазерная стереолитография, электроформование, технология лазерно-индуцированного переноса вещества и т.д.) требуют стабильности в течение ограниченного времени [29–33].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что устойчивость суспензий нГА в водном растворе гиалуроната натрия ожидаемо повышается с увеличением концентрации полимера. УЗ-обработка на использованном оборудовании способствует деструкции гиалуроната и не позволяет получить частицы ГА размером менее 0.5–1 мкм. Минимальная концентрация гиалуроната натрия в растворе, необходимая для получения стабильных суспензий ГА, составляет 0.25 мас. %, а максимальное содержание ГА при этом составляет 120% от массы полимера. Суспензии данного состава стабильны минимум в течение 8 ч, что обеспечивает однородность распределения нГА при получении материалов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (номер темы FFSM-2021-0006) с использованием научного оборудования ЦКП “Центр исследования полимеров” ИСПМ РАН.