Нейрохимия, 2023, T. 40, № 1, стр. 75-85

ВВЕДЕНИЕ

В послеродовой период организм матери претерпевает огромные физиологические и поведенческие изменения, направленные на поддержание и заботу о потомстве. Материнство является социально мотивированным поведением и предполагает пластичность многих нейромодуляторных систем мозга (серотонина (5-HT), дофамина, гамма-аминомасляной кислоты и норадреналина). Однако прямое действие серотонина недооценивается, и в настоящее время не хватает данных, подтверждающих роль этого нейротрансмиттера на таких этапах жизни, как беременность и материнство. Вопрос о взаимосвязи передачи негативного эффекта от депрессивной матери к потомству является одним из приоритетных в современной психиатрии. Известно, что при проявлении депрессивных расстройств наблюдаются нарушения в серонергической инервации. Поскольку серотонин (5-HT) является нейромедиатором и нейромодулятором мозга, он также участвует в регуляции широкого спектра основных физиологических функций, включая процессы развития, синаптическую пластичность, метаболический гомеостаз, нейроэндокринную функцию, аппетит, затраты энергии, частоту дыхания и сон [1–4].

Распространенность депрессивных заболеваний среди беременных и послеродовых женщин составляет примерно 10–20% [2]. Часто материнская психопатология очень динамична и может протекать в субклинической форме, что затрудняет диагностику психических расстройств. Исходя из этого, возникает проблема: как можно изучать аномальное материнское поведение и последующее развитие детей? Существующие экспериментальные данные о функциональной роли серотонинергической нейромодуляции показывают большую вариабельность, в основном в концентрации 5-HT в мозге, которая зависит от вида и времени взятия биопробы [1].

Для изучения уровня 5-HT в мозге был разработан ряд моделей животных с мутациями в генах, участвующих в передаче 5-HT и формировании серотонинергических нейронов. Одной из высокоточных моделей являются мыши-нокауты триптофан гидроксилазы-2 (TPH2), которая кодирует одноименный фермент и отвечает за скорость синтеза 5-HT из триптофана с использованием кислорода и тетрагидробиоптерина (BH4) в качестве субстратов и железа в качестве кофактора [5, 6]. Фермент TPH2 экспрессируется нейронами в ядре шва головного мозга и играет роль в когнитивной деятельности и проявлении обсессивно-компульсивного расстройства [7].

Поскольку необходимым условием репродуктивного успеха у млекопитающих и незаменимым компонентом выживания и развития потомства является проявление инстинкта материнской заботы, в данной работе мы рассмотрели, как фенотип TPH2-дефицитных мышей влияет на развитие постнатальных нейроповеденческих рефлексов у потомства. В настоящее время фенотипический профиль гомозиготных TPH2-нокаутных мышей с полным отсутствием серотонина в мозге изучен достаточно полно, и доказано, что отсутствие этого гена приводит к проявлению сопутствующих нарушений при депрессивном расстройстве, таких как дисбаланс эмоциональной регуляции, тревожность и импульсивность. Для гетерозиготного TPH2 также достаточно изучен молекулярный цикл серотонина в мозге, показано, что его содержание снижено на 10–20% [8, 9]. В предыдущих исследованиях поведенческий профиль гетерозиготных нокаутных TPH2 мышей был изучен недостаточно, однако были опубликованы данные, свидетельствующие о появлении у мышей повышенной импульсивности и чрезмерной агрессии в условиях стресса [9, 10]. Ранее было показано, что материнский стресс негативно влияет на развитие мозга плода, приводя к неблагоприятным когнитивным, поведенческим и психосоциальным последствиям в младенчестве и взрослом возрасте [11].

В данной работе мы рассмотрели, как частичный недостаток серотонина в мозге матери у гетерозиготных особей влияет на постнатальное развитие рефлексов у потомства, что дополнит характеристику пенетрантности гена TPH2 и расширят область применения мышей TPH2 для исследования депрессии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Эксперимент проводился в Экспериментальной клинике-лаборатории биологически активных веществ животного происхождения (Федеральный исследовательский центр пищевых систем им. В.М. Горбатова). Родительский штамм гетерозиготных мышей TPH2, содержащий последовательности loxP-наполнителя Cre, нацеленные на экзон 5, был получен на смешанном генетическом фоне 129 Sv и C57BL/620.28 и скрещен с чистым генетическим фоном мышей C57BL/6J в лаборатории доктора Леша в отделе молекулярной психиатрии Центра психического здоровья, Университет Вюрцбурга в мае 2019 г. (Вюрцбург, Германия) [12].

Животных содержали и тестировали со свободным доступом к пище и воде в индивидуально вентилируемых клетках Bio A.S. (Vent II, EHRET, Германия) типа 2L (размер 350 × 200 × 140 мм). Самцов мышей содержали в группах по 2–3 особи, а самок – по 4–5 особей. Условия содержания животных были стандартизированы: температура – 20 ± 3°С, влажность – 35 ± 2%, приточно-вытяжная вентиляция – 95 ± 5 м³/ч, режим освещения день/ночь с 6.00 до 18.00/с 18.00 до 6.00. В качестве подстилки использовался кукурузный наполнитель (“Золотой кот”, Россия). На протяжении всего эксперимента животные потребляли гранулированный корм для разведения лабораторных грызунов (“Лабораторкорм”, Россия).

Для изучения репродуктивной функции мышей C57BL/6J генотипа TPH2 случайным образом были отобраны гетерозиготные животные: 17 самцов и 34 самки в возрасте 12–30 недель. Количество пар для размножения рассчитывалось, исходя из размера целевой группы по 17 животных на генотип, а также на основе равновесия Харди–Вайнберга, соотношения полов 1 : 2 и предполагаемого коэффициента репродуктивного успеха 75%.

Исследование материнского поведения было проведено на 18 примипарных самках дикого типа (Wt) и 18 примипарных гетерозиготных TPH2 самках (TPH2 Het). Исследование постнатального развития проводилось на потомстве, полученном от TPH2 Het мышей (n = 60), с учетом генотипа: гомозиготный нокаут – TPH2 KO (TPH2^–/^–, n = 11), гетерозиготный нокаут – TPH2 Het (TPH2⁺/^–, n = 29) и дикий тип – Wt (TPH2⁺/⁺, n = 20). Размер помета при рождении не нормировался на количество детенышей разных генотипов, пола или общий размер помета, что связано с более высокой смертностью потомства, полученного от гетерозиготных нокаутных мышей.

Разведение. Эструс самок из групп TPH2 Het и Wt определяли визуально путем осмотра вульвы и цитологически путем микроскопического анализа вагинальных мазков по Migliarini [4] в течение 20 дней (до разведения). Вагинальный секрет отбирали с помощью автоматической пипетки (Thermo Fisher Scientific, США) после добавления физиологического раствора (0.9% NaCl) в объеме 15 мкл при температуре 22 ± 3°C. Вагинальную секрецию изучали с помощью микроскопа Axio A1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении ×40. Для синхронизации эструса 2 г подстилочного материала, пропитанного мочой самцов, брали из клеток самцов, отобранных для спаривания, и добавляли в домашние клетки самок согласно Auth [5]. После 72 ч воздействия феромонов и подтверждения эструса у самок их помещали в клетки самцов (гаремная группа [трио] – 1 самец и 2 самки). Для регистрации акта спаривания регистрировали наличие вагинальных пробок. После подтверждения беременности (примерно на 14-й день беременности, путем визуального осмотра и пальпации) самцов и самок разделили по разным клеткам [13]. Далее гнезда проверяли на наличие детенышей один раз в день. День рождения был обозначен как послеродовой день (PD0). Эффективность спаривания животных оценивалась по способности самок и самцов к оплодотворению как процентное соотношение беременных самок/плодовитых самцов к общему количеству подсаженных самок/самцов [14].

Чтобы минимизировать стресс [10], после подтверждения беременности всех самок помещали в одинаковые клетки с гнездовым материалом из измельченной бумаги и бумажных трубочек. Для минимизации каннибализма к стандартному рациону разведения ежедневно добавляли корм для беременных и кормящих собак (Royal Canin, Польша) (1 г на мышь) и нежареные семена подсолнечника (1 г на мышь).

Материнское поведение. Определение уровня материнского инстинкта оценивалось по следующим показателям: обустройство гнезда, “поисковый тест”, кормление и каннибализм.

Оценку обустройства гнезда у подопытных мышей проводили с помощью модифицированной шкалы [15, 16], разделенной на две категории для предотвращения необъективных наблюдений – оценка точки организации гнезда и измерение глубины и ширины гнезда. На PD0 использовалась 3-балльная шкала организации гнезда (рис. 1): “1” балл – материал гнезда (НМ) не тронут более чем на 70%, частично разорван; “2” балла – НМ в основном раздавлен, но не идентифицируется как гнездо, менее 50% НМ остается нетронутым, но менее 90% находится в пределах четверти площади пола клетки, НМ не собран в гнезде, а разбросан по всей клетке; “3” балла – используется более 90% НМ, и гнездо представляет собой глубокую чашу. Глубина и ширина гнезд также измерялись линейкой.

Рис. 1.

Оценка гнездостроения экспериментальных мышей.

Группировку детенышей оценивали по “поисковому тесту” [17, 18], адаптированному для мышей. Для этого детенышей равномерно распределяли по домашней клетке и в течение 10 минут регистрировали их возвращение самкой в гнездо. Если детеныши оставались нетронутыми самкой, материнское поведение оценивалось в “0” баллов. Если детенышей перетаскивали в одно место вне гнезда, то ставили “1” балл. Хаотичное группирование детенышей в гнезде оценивалось в “2” балла, а сгруппированные детеныши в гнезде – в “3” балла. Также регистрировалось время группировки всех детенышей из помета.

Кормление детенышей оценивали на PD2–PD12 каждые 3 дня по наличию молочных пятен в желудке.

Проявлением материнского каннибалистического поведения считали появление мертвых детенышей со следами укусов или травм. Пометы проверяли ежедневно на PD0–PD21. При установлении факта каннибализма погибших детенышей удаляли, а клетку и подстилочный материал заменяли новыми.

Также определяли средний размер помета, количество живых и мертвых новорожденных, рассчитывали выживаемость от 0 до 25 дней жизни (отношение количества детенышей, доживших до 25 суток, к количеству живорожденных), соотношение самцов и самок. Помет отлучали от матери в возрасте 21 суток (PD21).

Оценка развития потомства. Физиологическое развитие потомства оценивали путем определения массы тела детенышей на 3, 7, 14, 21, 28 и 35-й дни жизни с помощью электронных весов DX-2000 (A&D Company ltd., Япония) и ежедневного наблюдения с PD0 по PD40 с фиксацией следующих параметров: период отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников и открытие влагалища [15].

Для выявления сенсорных рефлексов у детенышей [18–21] были проведены следующие тесты: плайсинговая реакция передних и задних конечностей, плайсинг вибриссный и визуальный (табл. 1). Также потомство тестировали для определения нейроповеденческого моторного развития (табл. 1). Все манипуляции проводились в течение четырехчасового периода до полудня, чтобы исключить различия в поведении в зависимости от времени суток. Последовательность неонатальных моторных тестов была адаптирована с использованием батареи тестов Фокса и включала: рефлекс выпрямления, отрицательный геотаксис и тест на мышечную силу. Также проверялись амбуляция, сила передних конечностей и задних конечностей.

Генотипирование. Генотипирование детенышей проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ) ДНК из фрагмента кончика хвоста (3 ± 1 мм) [18]. Биоматериал, полученный от каждой особи, помещали в отдельную пробирку (1.5 мл) с присвоенным индивидуальным номером, после чего помещали в морозильную камеру при температуре –40 ± 1°C. Для разрушения костной ткани и облегчения процедуры выделения ДНК образец хвоста обрабатывали жидким азотом. Выделение ДНК проводили с помощью набора Сорб-ГМО-B (Синтол, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Для ПЦР РВ использовали праймеры: TPH2 F KO 5' CACCCCACCTTTGCAGAAATGTTTA 3', длина ампликона – 387; TPH2 F WT 5' TGGGGCATCTCAGGACGTAGTAGTAGT 3', длина ампликона – 437; и TPH2 R 5' TGGGGCCTGCCGATAGTAACAC 3' [5]. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе АНК-32 (SYNTOL, Россия). Реакционная смесь (25 мкл) содержала праймеры (300 нМ), 2.5× реакционную смесь с красителем EvaGreen (Синтол, Россия) (10 мкл) и выделенную ДНК (2 мкл). Режим реакции ПЦР был следующим: денатурация (95°C/5 мин), затем 40 циклов амплификации (95°C/15 с, 64°C/30 с и 72°C/10 с). Для идентификации проводили отдельные реакции: для выявления аллеля “дикого типа” – с парой праймеров TPH2 F WT и TPH2 R, для выявления мутантного аллеля – с TPH2 F KO и TPH2 R. Реакционные смеси без добавления ДНК использовались в качестве отрицательного контроля.

Статистика. Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0 (Statsoft, США). Нормальность распределения данных анализировали с помощью тестов Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова, равенство вариаций определяли с помощью критерия Левена. Для проверки различий между двумя выборками парных и независимых измерений по уровню количественного признака использовали односторонний ANOVA с критериями Вилкоксона и Манна–Уитни. Анализ выживаемости потомства проводили в программе SPSS Windows, Version 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) с использованием метода анализа Каплана–Майера с критерием Log-rang. Данные с нормальным распределением представлены в виде среднего со стандартным отклонением (M ± SD), а также в виде диапазонов min–max (минимальное и максимальное значения измеряемой величины), медианы (ME) с межквартильным интервалом ([P25–P75]), в долях (процентах) или в абсолютных числах. Для оценки результатов, полученных в тесте “поиск”, проводился корреляционный и регрессионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Размножение. Средняя продолжительность эстрального цикла у самок TPH2 Het составила 4.5 [3.8–4.9] дня. Анализ мазков показал более длительные стадии эструса и диэструса у 82.6% самок по сравнению с эстральным циклом самок Wt со средней продолжительностью 4.0 [3.7–4.9] дня. После помещения самок в клетки с самцами на первые 3 дня, вагинальная пробка наблюдалась у 78.5% самок TPH2 Het и у 86.9% самок Wt. Наблюдения за самками во время беременности не выявили никаких различий в их социальном поведении или внешнем виде.

Эффективность спаривания достигала 64.3% среди TPH2 Het и 72.7% среди Wt групп. Средняя продолжительность беременности у самок TPH2 Het составила 19.0 ± 2.0 дней, у самок Wt – 19.0 ± 0.8 дней. Смертность, связанная с родами, среди самок не зарегистрирована.

Среднее количество мышат в помете TPH2 Het составило 6.0 [5.0–8.0], при соотношении самцов и самок 46/54. Средний размер помета у самок Wt составил 7.0 [7.0–8.0] мышат, при соотношении самцов и самок 42/57. Такие результаты являются нормальными для животных этой линии [8]. Генотипирование показало, что соотношение мышат по генотипу близко к нормальному менделевскому распределению (1 : 2 : 2) с гетерозиготным разведением KO/Het/Wt –18/48/34 (1 : 2.7 : 1.9).

Материнское поведение. Оценка гнездостроения у самок TPH2 Het и WT показала идентичные результаты между двумя генотипами, средний балл составил 2.63 ± 0.52 и 2.73 ± 0.44 (p = 0.69) соответственно. Как показано на рис. 2а, глубина и ширина гнезд между двумя генотипами мышей практически не различались. Однако анализ материнского поведения в “поисковом тесте” выявил ряд различий (рис. 2б). В среднем, в группе TPH2 Het потребовалось на 34% (p = 0.08) больше времени, чтобы вернуть весь помет в гнездо: 159.0 [155.0–169.0] с для самок TPH2 Het и 97.0 [80.0–159.0] с для самок Wt. Корреляция между числом детенышей в помете и временем, затраченным на возвращение детенышей в гнездо, у самок Wt прямая и сильная (r = 0.73), а у самок TPH2 Het обратная и слабая (r = –0.14).

Рис. 2.

Материнское поведение. Обозначения: а – ширина (белые квадраты) и глубина (серые квадраты) гнезд; б – результаты “поискового теста”. Данные представлены в виде графика качелей с границами P25–P75 и отметками минимальных и максимальных значений набора данных.

Для потомства самок Wt 1-й день был критическим – причиной гибели детенышей было заглатывание плаценты самками во время родов и единичные случаи (5.9%) рождения детенышей в амниотической оболочке, что привело к гибели от гипоксии, как показано на диаграмме на рис. 3. Каких-либо нарушений в способности к кормлению детенышей среди самок TPH2 Het и Wt групп не наблюдалось. Молочное пятно присутствовало у 75.0% детенышей, за исключением каннибализированных. Тем не менее, отсутствие кормления и игнорирование помета на PD0 было зарегистрировано среди 25.0% матерей TPH2 Het, что привело к гибели 100.0% детенышей в помете, в то время как каннибализм не был зарегистрирован в клетках самок Wt.

Рис. 3.

Анализ выживаемости потомства по Каплану–Майеру.

Мониторинг в послеродовой период самок TPH2 Het (от PD0 до PD25) выявил каннибализм в 66.7% случаев смерти – причиной смерти детенышей был направленный инфантицид, в то время как в 50.0% случаев самки убивали весь помет. Отмечено, что критическими были первые 3 суток после рождения и 8-й день жизни детенышей (рис. 3). Исследование мертвых детенышей от TPH2 Het матерей показало, что в большинстве случаев было нанесен ущерб передней поверхности тела (передняя или брюшная части тела) – 23% случаев, а в 76% от детенышей оставалась только область головы. Случаев 100% каннибализации тела детенышей не зарегистрировано. Среди каннибализированного потомства 64.7% принадлежали к генотипу Het, 29.4% – к KO и 5.9% – к Wt (KO/Het/Wt – 5.0/11.0/1.0). Равенство распределения выживаемости для генотипов Wt и Het составило 0.0004.

Корреляционный анализ зависимости процента каннибализированных детенышей в помете TPH2 Het от оценки построения гнезда составил r = 0.95 (p = 0.0001), тогда как для группы Wt корреляция не была обнаружена.

Оценка развития потомства. Комплексная оценка морфологических и функциональных параметров постнатального онтогенеза потомства мышей выявила несколько важных различий (рис. 4). Наблюдалась значительная разница в массе тела детенышей между генотипами WT и KO. На PD7 эта разница составила 18.5% (p = 0.01), на PD14 – 40.1% (p = 0.04), PD21 – 45.2% (p = 0.001), PD28 – 36.9% (p = 0.001) и на PD35 – 27.1% (p = 0.001). Различий в массе тела между детенышами генотипов WT и Het обнаружено не было (рис. 4). Также наблюдалась статистическая разница в массе тела между мышатами генотипов Het и KO на PD14 – 39.6% (p = 0.05), PD21 – 44.3% (p = 0.001), PD28 – 35.4% (p = 0.001) и PD35 – 25.1% (p = 0.01). Прирост веса машат на PD35 по сравнению с PD3 составил: для группы Wt – 16.1 [14.6–17.9] г, для группы Het – 14.9 [9.0–17.2] г и для группы KO – 11.90 [9.0–12.7] г.

Рис. 4.

Масса тела потомства от самок TPH2 Het. (Примечания: * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01 и *** p ≤ 0.001 для KO по отношению к Wt; # p ≤ 0.05; ## p ≤ 0.01 и ### p ≤ 0.001 для Het по отношению к Wt). Белый столбец представляет Wt; серый – Het; темно-серый – KO.

Анализ физиологического развития потомства (табл. 2) показал, что у нокаутных особей появление первичного волосяного покрова, прорезывание верхних резцов и открытие влагалища наблюдалось на сутки раньше, чем у животных Wt и Het. У 84.6% детенышей Het открытие глаз было зарегистрировано на 14 день, в то время как детеныши KO и Wt открыли глаза на 15 день (16.7 и 42.8% соответственно) и на 16 день (83.3 и 57.1% соответственно).

Анализ реакции постановки передней конечности не выявил существенных различий между исследуемыми мышатами (рис. 5a): у трех генотипов созревание рефлекса было зарегистрировано на PD5. Однако потомтсво Wt и KO показали худшие результаты в реакции постановки задней конечности по сравнению с мышатами Het на PD5 и PD10 (рис. 5б). У нокаутных животных был самый низкий результат на PD5 (0.20 ± 0.11 балла при отсутствии реакции у 50.0% особей), что было ниже, чем в группах Wt и Het на 66.7% (p = 0.273) и 67.7% (p = 0.285) соответственно. На PD10 потомство Het набирало 0.94 ± 0.18 балла (среди них 61.5% не проявляли реакцию). Эти значения были ниже, чем в группах Wt и KO на 17.5% (p = 0.179) и 10.6% (p = 0.108) соответственно. На PD15 реакция наблюдалась у всех генотипов.

Рис. 5.

Анализ постнатальных рефлексов детенышей. (Примечания: а – реакция плайсинга передних конечностей; б – реакция плайсинга задних конечностей; в – плайсинг вибриссный; г – амбуляция; д – скоринг; е – мышечная сила; ж – поверхностное выпрямление; з – отрицательный геотаксис; и – подвешивание передних конечностей). Данные представлены в виде графика колебаний с границами P25–P75 и отметками минимальных и максимальных значений набора данных. Белая рамка представляет Wt; серая рамка представляет Het; темно-серая рамка представляет KO. * p ≤  ≤ 0.05 для детенышей Wt по отношению к детенышам KO.

При оценке реакции размещения вибрисс было отмечено, что 100% мышат Wt не имели реакции до PD10, в то время как 84.6% мышат Het и 30.0% мышат KO имели сниженную реакцию (различия недостоверны). Размещение вибрисс было полностью сформировано на PD15 у детенышей всех генотипов (рис. 5в).

При оценке двигательных рефлексов на PD5 у мышат Wt был выявлен высокий амбуляционный ответ (рис. 5г), превышающий показатели KO группы на 33.3% (p = 0.067) и Het группы на 22.2% (p = 0.057). Однако на PD10 мышата KO имели самый высокий показатель (2.8 ± 0.45), который превышал значения Wt и Het групп на 14.3% (p = 0.345 и p = 0.361 соответственно). У детенышей всех генотипов реакция была полностью сформирована на PD15 и характеризовалась плавным движением без асимметрии.

При оценке силы в тесте оценки задней конечности (рис. 5д) на PD5, у нокаутных мышат минимальный балл был на 51.7% (p = 0.079) ниже, чем в группе Wt. Значения в группе Het были на 10.3% ниже, чем в группе Wt (p = 0.361). На PD10 максимальный балл также наблюдался в группе Wt, причем он был на 24.1% выше, чем в группе Het (p = 0.079) и на 10.3% выше, чем в группе KO (p = = 0.592). На PD5 по сравнению с PD10 средний балл у мышат Het снижался на 15.4% (p = 0.361), что может указывать на некоторый дефицит мышечной силы задних конечностей.

Время удержания на перевернутом экране у мышат Het составило 9.92 ± 4.01 с, что на 34.0% ниже, чем у Wt и KO (p = 0.043 и p = 0.067), и также подтверждает недостаток мышечной силы у мышат генотипа Het (рис. 5е).

В тесте на поверхностное выпрямление также были выявлены различия (рис. 5ж). Возвращение в исходное положение тела на PD5 у детенышей KO превышало этот показатель у детенышей Wt на 52.7% (p = 0.108) и у детенышей Het на 45.3% (p = = 0.067). На PD10 максимальное время было выявлено у мышат KO, которое превышало таковое в группе Het на 35.1% (p = 0.500) и в группе Wt на 72.2% (p = 0.067). В то же время в группе Het эти показатели превышали значения группы Wt на 70.8% (p = 0.067).

При анализе результатов теста отрицательного геотаксиса (рис. 5з) были обнаружены некоторые изменения вестибулярной функции у нокаутных мышат на PD5 и PD10: время, затраченное на возвращение в положение “голова вверх”, было больше, чем в группе Het на 36.8% (p = 0.144) и 24.7% (p = 0.685), а в группе Wt на 48.6% (p = 0.059) и 70.7% (p = 0.465) соответственно. При этом время поворота у детенышей Het на PD5 превышало показатели Wt группы на 22.9% (p = 0.172).

Сила передних конечностей, оцененная в тесте подвешивания на PD10, оказалась ниже как в группе Het, так и в группе KO на 38.8% (p = 0.204) и на 78.5% (p = 0.361) и составила 7.38 ± 3.88 с и 2.60 ± 0.89 с соответственно по сравнению с Wt мышатами (рис. 5и). Разница в силе передних конечностей между генотипами Het и KO составила 64.8% (p = 0.177). На PD15 максимальное время висения было отмечено в группе Het (19.18 ± 4.82 с), что превышало значения групп KO (14.21 ± 8.22 с) и Wt (8.17 ± 4.17 с) на 25.6% (p = 0.592) и 18.3% (p = 0.892) соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ

Репродуктивные показатели при разведении гетерозиготных TPH2 мышей характеризовались как нормальные, за исключением эффективности спаривания, которая была снижена на 10.3% по сравнению со средним показателем (75.0%) у мышей дикого типа, что может быть связано с аверсивным поведением самок с дефицитом серотонина [4, 9].

Анализ материнского поведения выявил некоторые отклонения среди самок TPH2 Het, которые включали нарушения в возвращении детенышей в гнездо и повышенный процент детоубийств. Средний балл за гнездовое поведение был близок к максимальному значению, а нарушений в поведении при кормлении детенышей обнаружено не было. Наши результаты также подтверждаются другим исследованием этой генетической модели с дефицитом серотонина [18]. Как упоминалось ранее, основной причиной гибели детенышей был направленный каннибализм со стороны матерей, что может указывать на участие серотониновой сигнализации в проявлении этого поведения.

Беременность и роды являются стрессовой ситуацией [22], провоцирующей постнатальную депрессию у подопытных мышей. Этот вывод можно сделать на основании 67% смертности детенышей из-за материнского каннибализма и плохого гнездования TPH2 Het самок. Важно отметить, что эти два фактора наблюдались только у самок TPH2 Het. Ранее было показано, что самки TPH2 KO каннибализируют в основном детенышей KO, и что выживаемость детенышей Wt была выше, когда их воспитывали самки KO [23]. В нашей работе мы наблюдали повышенный процент каннибализма в отношении детенышей гетерозиготного генотипа. Похоже, что эти результаты не могут быть объяснены только влиянием генотипа матери или детеныша, и поэтому фактор отсутствия гена TPH2 может быть причиной более сложных взаимодействий [24, 25]. Мы не нашли объяснений тому, что самки TPH2 Het канибализируют своих детенышей, преимущественно гетерозиготного генотипа, но можем отметить, что все детеныши родились живыми, и у них не было проблем с кормлением. Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, действительно ли это процесс каннибализма или детоубийства.

При изучении постнатального развития на 35 день с момента рождения было обнаружено отставание развития детенышей-нокаутов по весу от детенышей Het и Wt. В свете плейотропного эффекта серотонина, выявленная выраженная гипофагия у нокаутных мышей может быть объяснена двумя основными неисключительными причинами: пищевой и/или метаболической. Поскольку вес детенышей трех генотипов не отличался до PD3, можно сделать вывод, что недостаток серотонина в мозге не влияет на рост и развитие плода, а скорее сказывается на раннем неонатальном развитии [12].

Несмотря на существующие данные о задержке физиологического развития мышей TPH2 KO [12, 22], в проведенных экспериментах такие основные показатели, как отлипание ушной раковины, прорезывание верхних резцов, открытие глаз и опускание семенников у мышей гомозиготного генотипа TPH2 KO наблюдались в те же сроки, что и у Wt и Het. Кроме того, такие показатели неонатального развития, как появление первичного волосяного покрова, прорезывание верхних резцов и открытие влагалища у нокаутных мышей были зафиксированы на день раньше по сравнению с детенышами других генотипов (Wt и Het). Такое быстрое развитие может быть вызвано сочетанием явлений патологической акселерации и ретардации, эти эффекты часто диагностируются при психических заболеваниях [27], но для подтверждения этой гипотезы необходима дополнительная серия экспериментов с использованием большей выборки животных.

Тестирование нейроповеденческих рефлексов дает прогностические характеристики аномального развития и созревания коры головного мозга, что может быть важно в условиях, когда очевидной невропатологии не наблюдается [12]. При отсутствии экспрессии гена TPH2 у гомозиготных нокаутных мышей нарушение синтеза серотонина в нейронах имеет место уже в пренатальный период [26], тогда как у гетерозиготных нокаутных мышей снижение содержания серотонина ниже только на 10–20% по сравнению с мышами дикого типа [9].

При изучении нейроповеденческого развития новорожденных мышей мы обнаружили незначительную задержку на PD5 в появлении некоторых неврологических рефлексов (амбуляция, отрицательный геотаксис, подвешивание передних конечностей, скоринг и плайсинг вибрисс) у детенышей нокаутного генотипа TPH2, что также показано в других исследованиях [12, 28]. Результаты повторных тестов на PD10 свидетельствуют об усилении рефлекса с наличием импульсивных реакций, за которым следует полное развитие исследуемых рефлексов на PD15. Полученные данные могут указывать на прямую связь между уровнем серотонина и ранним развитием рефлексов у новорожденных [29].

Мы также выявили некоторые отклонения в развитии двигательных рефлексов у детенышей с генотипом TPH2 Het. Так, в проявлении постуральных рефлексов (отрицательный геотаксис и поверхностное выпрямление) и в тестах, определяющих мышечную силу детенышей (подвешивание передних конечностей, скоринг и удерживание на экране), результаты детенышей генотипа Het были значительно хуже, чем у Wt, начиная с PD10. В развитии сенсорных рефлексов (постановка задних конечностей) у мышей Het также были отмечены отклонения на PD10, тогда как к PD15 эти показатели нормализовались. Такая нейроповеденческая динамика, вероятно, отражает корреляцию между изменениями в постнатальном развитии и дефицитом серотонинергической иннервации мозга потомства, что требует дальнейших исследований.

С трансляционной точки зрения результаты, полученные в данном исследовании, могут свидетельствовать как о нарушении взаимодействия между депрессивной матерью и ее ребенком [11], так и нарушении его развития.

ВЫВОДЫ

Репродуктивные показатели при разведении гетерозиготных TPH2 мышей характеризовались как нормальные, однако у TPH2 Het самок была обнаружена пониженная выживаемость помета и дефицит материнского поведения. При отсутствии явных признаков измененного поведения при гнездовании было обнаружено снижение общей характеристика материнского поведения, включая нарушение в возвращении детенышей в гнездо и повышенный процент инфантицида.

На ранних стадиях постнатального развития (до PD5) поведенческие паттерны моторного и сенсорного развития мышей гомозиготного генотипа с целевым нокаутом гена TPH2 (TPH2 KO) характеризовались как задержанные. Однако результаты моторных и сенсорных тестов тех же животных на PD10 указывали на усиление рефлекса с присутствием импульсивных реакций, за которым следовало полное развитие рефлексов к PD15. Развитие двигательных рефлексов у детенышей гетерозиготного генотипа (TPH2 Het) на PD5 существенно не отличалось от показателей животных дикого типа. Однако, начиная с PD10, у мышей генотипа Het наблюдалось некоторое отставание в развитии: результаты ряда тестов, проведенных в эти периоды, были значительно ниже, чем у мышей TPH2 Wt и TPH2 KO. Таким образом, дефицит гена TPH2 вносит вклад в нарушение поведенческого и эмоционального благополучия матери и ребенка. Аномалии поведения, направленные на потомство, наблюдаемые у самок, влияют на последующее развитие потомства, особенно у гомозиготных мышей. Наши данные подтверждают гипотезу о влиянии аномального материнского поведения, обусловленного нарушением системы 5-HT в мозге, на развитие потомства.