Нейрохимия, 2023, T. 40, № 1, стр. 68-74

ВВЕДЕНИЕ

Одним из перспективных подходов к изучению патофизиологических механизмов эпилептиформных состояний являются генетические модели эпилепсии, к числу которых относится аудиогенная эпилепсия (АЭ). Известно, что около 15–20% особей лабораторных аутбредных линий крыс (например, Спрегг-Доули, некоторые стоки Вистар) реагируют на громкий звук сильным двигательным возбуждением (так называемым “клоническим бегом”), которое часто переходит в эпилептиформный судорожный припадок с клонической и, иногда, тонической фазами. В конце 1940 гг. Л.B. Крушинский, Л.Н. Молодкина и Д.А. Флесс (биолого-почвенный факультет МГУ) начали селекцию крыс Вистар на проявление АЭ – скрещивали между собой животных, у которых в ответ на сильный звук развивался эпилептиформный припадок [1, 2]. К середине 1950 гг. линия была сформирована, и позднее ей дали название “линия крыс Крушинского–Молодкиной” (КМ). В последующий период времени, в ходе поддержания и селекции крыс этой линии интенсивность эпилептиформного припадка АЭ крыс КМ постепенно повышалась, а к 1996 г. линия была переведена в инбредное состояние с почти 100% проявлением этого признака [3]. В 1990–2000 гг. для крыс КМ были получены нейрохимические данные о содержании нейротрансмиттерных моноаминов и аминокислот, а также их метаболитов в стуктурах мозга, как в состоянии покоя, так и на пике судорожного припадка после однократной экспозиции действию звука [4, 5]. В линиях, предрасположенных к АЭ, КМ, GEPR (Genetic Epilepsy-Prone Rats, США) и WAR (Wistar Audiogenic Rats, Бразилия), ежедневная экспозиция животных действию звука в течение 10–20 дней приводит к появлению миоклонических судорог (феномен “аудиогенного киндлинга” АуК) с небольшим снижением интенсивности тонических судорог [6, 7]. Этот тип судорог рассматривают как модель височной формы эпилепсии человека. АуК проявляется в виде коротких клонических судорог лицевой мускулатуры, мышц шеи и передних конечностей. Установлено, что в развитии собственно судорожного припадка АЭ ключевыми являются структуры ствола мозга, а формирование АуК происходит в структурах переднего мозга – в новой коре и гиппокампе [1, 8–12].

Важно отметить, что в приведенных выше исследованиях уровни нейротрансмиттеров в структурах мозга крыс линии КМ сопоставляли с таковыми аутбредной линии Вистар, на основе которой проводили селекцию крыс КМ. Однако за много десятков поколений разведения крыс КМ и крыс Вистар (с конца 1940 гг.) в обеих линиях могло произойти большое число мутационных изменений, в силу чего такое сравнение может быть малоинформативным. Это обстоятельство послужило основанием для проведения селекции крыс на отсутствие судорожного припадка АЭ, т.е. на создание линии крыс, обозначенной как “0” [13]. Исходной популяцией для этого селекционного эксперимента послужили гибриды F2 КМ × Вистар. Для получения гибридов F1 были выбраны крысы Вистар (питомник “Столбовая”), не проявлявшие никаких признаков АЭ при трехкратной экспозиции звука с интервалом в 5–7 дней. В линии “0” доля крыс (в возрасте 3–4 мес.), не обнаруживающих судорог АЭ при трехкратном применении звука с интервалом в 5 дней, колеблется от 20 до 60% [13].

Исследование спектра нейрохимических показателей содержания моноаминов в структурах мозга крыс КМ в сравнении с показателями крыс линии “0”, так же, как и изучение влияния на данные параметры аудиогенного киндлинга у крыс КМ ранее не проводилось.

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение содержания нейротрансмиттерных моноаминов, в также их метаболитов в структурах мозга крыс КМ после развития АуК в сопоставлении с показателями крыс линии “0”, не предрасположенных к АЭ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные животные. Эксперименты проводили на крысах линии Крушинского–Молодкиной (КМ) в возрасте 5 мес. с максимальной выраженностью судорог аудиогенной эпилепсии (АЭ) у 100% животных и крысах линии “0” в возрасте 5 мес., у которых судороги в ответ на звуковой раздражитель полностью отсутствовали. Животные были получены из лаборатории физиологии и генетики поведения (биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва), где проводится селекция и поддержание данных линий. Для целей настоящего эксперимента животных содержали в условиях лабораторного вивария ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова” при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму в соответствии с ГОСТ 33215-2014 и ГОСТ 33216-2014 “Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными” от 01 июля 2016 г.

Согласно лабораторному протоколу, в возрасте 3 месяцев крыс KM подвергали звуковому воздействию, чтобы определить у них наличие АЭ (тестировали только один раз). Крысы линии “0” экспонировались действию звука 3 раза (с интервалом в 7–8 дней) в возрасте 2–3 месяца и в эксперимент отбирались только животные, не проявившие признаков АЭ все 3 раза.

Формирование аудиогенных миоклонических судорог (аудиогенного киндлинга, АуК). Экспозицию действию звука у крыс КМ проводили в 5 мес. возрасте в пластиковой звукоизолирующей камере размерами 30 × 55 × 45 см (фирма Open Science, www.openscience.ru) (аудиторный звонок, сила звука 120 дБ). Через 3–4 с после включения звука у крыс КМ развивалось двигательное возбуждение (“клонический бег”), переходящее, к 7–8 с действия звука, в клонико-тонический судорожный припадок. Через 20 дней ежедневных экспозиций действию звука для формирования аудиогенного киндлинга у всех крыс КМ ослаблялись тонические судороги с параллельным развитием аудиогенного миоклонуса (АуК).

Животные были разделены на группы:

1. “КМ-фон” без звуковой стимуляции непосредственно перед опытом (без АуК) (n = 8).

2. “КМ-АуК” через 7 дней после последней экспозиции действию звука в серии из 20 ежедневных (n = 9).

3. Группа крыс линии “0” (без звуковой стимуляции непосредственно перед опытом) (n = 8).

Нейрохимические методы исследования. Для определения содержания моноаминов в структурах мозга животных декапитировали с помощью гильотины (Open Science, Россия), группу крыс КМ-АуК – через 7 дней после последней экспозиции действию звука. Структуры мозга всех крыс (фронтальная кора, гипоталамус, прилежащее ядро, стриатум, гиппокамп и ствол) извлекали на льду, замораживали в жидком азоте и взвешивали. Пробы хранили в жидком азоте. Для определения содержания нейротрансмиттеров пробы размельчали в гомогенизаторе Поттера (тефлон-стекло) в 1 мл 0.1 н HСlO₄ с добавлением 3,4-диоксибензиламина (0.5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Определяли содержание ((нейротрансмиттеров -)) норадреналина (НА), дофамина (ДА), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), серотонина (5-окситриптамина, 5-ОТ) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) (наномоль/грамм ткани). Использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД, хроматограф LC-304T, ВАS, США с аналитической колонкой ReproSil-Pur ODS, C18, 100 × 4 мм, 3 мкм, Dr. Maisch, Германия). Скорость элюции подвижной фазы была 1.0 мл/мин, давление до 200 атм. Подвижная фаза состояла из: 0.1 M цитратно-фосфатного буфера, содержащего 1.1 мМ октансульфоновой кислоты, 0.1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили с помощью электрохимического детектора LC-4B (BAS США) на двойном стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Регистрация образцов проводилась с помощью аппаратно-программного комплекса “Мультихром 1.5” (“Амперсенд”). Все использовавшиеся для анализа реактивы были высокой степени чистоты: “ос. ч.” или “analytical grade”.

Обработку данных по содержанию моноаминов проводили следующим образом. Соответствие массива данных нормальному распределению проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Полученные результаты представляли в виде средних арифметических и их стандартных отклонений. Данные обрабатывали с помощью непараметрического аналога дисперсионного анализа по Крускалу–Уоллису с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну. Во всех случаях использовали двухсторонний критерий при критическом уровне значимости α = 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Содержание норадреналина (НА). Во фронтальной коре и прилежащем ядре содержание НА в группе крыс КМ-фон (т.е. в отсутствие выработанных миоклонических судорог) и у крыс линии “0” (нечувствительных к действию звука) практически не различалось. Однако во фронтальной коре группы КМ-АуК содержание НА было достоверно ниже, чем у КМ-фон (p < 0.001) и чем у крыс линии “0” (p < 0.05) (табл. 1). Более низкое по сравнению с линией “0” содержание НА в группе КМ-фон отмечалось в гиппокампе (р ≤ 0.05) и гипоталамусе (р ≤ 0.05), тогда как в стволе мозга у обеих групп крыс КМ уровень НА был, напротив, достоверно (p < 0.05) выше, чем у линии “0” (табл. 1), т.е. процедура формирования АуК не повлияла на содержание НА в стволе мозга у КМ. Статистически значимых изменений в содержании НА в прилежащем ядре и стриатуме выявлено не было.

Таким образом, формирование АуК у крыс линии КМ в результате многократных звуковых экспозиций сопровождалось снижением содержания НА во фронтальной коре, тогда как в группе крыс КМ-фон (не подвергавшихся процедуре АуК) низкие значения уровня НА отмечались в гиппокампе и гипоталамусе.

Содержание дофамина (ДА). Статистически значимых изменений содержания ДА во всех исследованных структурах мозга всех трех групп крыс не наблюдалось, отмечено лишь недостоверное увеличение этого параметра в гипоталамусе крыс КМ- АуК (табл. 1). Вместе с тем, в содержании метаболитов ДА был выявлен ряд отличий, которые отражали изменение интенсивности внутриклеточного обмена – в гипоталамусе отмечено более высокое содержание ДОФУК у КМ, по сравнению с линией “0”, причем для группы КМ-фон оно было достоверно выше (р < 0.05). Содержание ГВК, являющееся показателем скорости внеклеточного метаболизма ДА, в гиппокампе было достоверно (р < 0.05) ниже у группы КМ-фон по сравнению с линией “0”. У группы КМ-АуК внеклеточный оборот ДА был несколько выше, чем у группы КМ-фон, о чем может свидетельствовать более высокое содержание ГВК в прилежащем ядре (отличие КМ-АуК vs КМ-фон достоверно, р < 0.05) и в стриатуме (отличие КМ АуК vs “0” достоверно, р < 0.05) (табл. 1).

Содержание серотонина и его метаболитов. Содержание серотонина (5-ОТ) во фронтальной коре у обеих групп КМ было достоверно (р < 0.05) выше, чем у крыс линии “0”. В стриатуме у группы КМ-фон этот показатель был достоверно ниже, чем у линии “0”, тогда как у КМ-АуК он был равен таковому линии “0”, при этом отличия от КМ-фон были недостоверны. В стволе мозга крыс группы КМ-АуК содержание 5-ОТ было достоверно (р < 0.05) ниже, чем у КМ-фон, тогда как различия между линий “0” и КМ-фон были недостоверными.

Содержание 5-ОИУК (метаболита 5-ОТ), являющимся показателем скорости утилизации 5-ОТ, у крыс группы КМ-фон было выше, чем у крыс линии “0” в таких структурах мозга, как фронтальная кора, прилежащее ядро, гиппокамп и ствол. Отношение 5-ОИУК/5-OT (показатель утилизации 5-OT) во всех исследованных структурах мозга крыс группы КМ-фон было значительно выше, чем у крыс линии “0”. В данной группе особенно интенсивный оборот серотонина отмечался в стволе мозга, где наблюдалось также и более высокое содержание 5-ОТ по сравнению с линией “0” (табл. 2).

В группе крыс КМ-АуК отмечалось снижение интенсивности оборота серотонина относительно группы КМ-фон во всех структурах (кроме гипоталамуса) мозга, не достигшее, однако, уровня достоверности. Тем не менее, в данной группе статистическая значимость по величине отношения 5-ОИУК/5-OT при сравнении с крысами линии “0” сохранялась только в гипоталамусе, стриатуме и стволе мозга. Обнаруженное более низкое содержание 5-ОТ в стволе мозга у крыс КМ-АуК (по сравнению с КМ-фон), возможно, причинно связано с более низкими значениями показателя оборота 5-ОТ в данных структурах (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Как было показано ранее, у крыс линии КМ наблюдаемые тонико-клонические судороги при воздействии акустического раздражителя начинаются “диким бегом” и завершаются тоническим судорожным припадком с экстензией конечностей [14]. Аудиогенный киндлинг (АуК) у крыс КМ, так же как и у крыс других линий с АЭ (GEPR и WAR), представляет собой появление новых по своей форме судорог – миоклонических, проявляющихся как короткие “тикообразные” подергивания мышц морды и передних конечностей [14], что было продемонстрировано и в данном исследовании. Появление миоклонических судорог сопровождается некоторым ослаблением интенсивности тонических судорог (у крыс линии КМ проявляющимся нерегулярно) [8, 10–12].

Как было показано в настоящем исследовании, АуК в наибольшей степени оказывал влияние на содержание норадреналина (НА) и серотонина (5-ОТ) в мозге крыс КМ. В ряде исследований было показано, что НА можно рассматривать как ингибитор судорожной активности, и при многих моделях эпилепсии обнаруживают его дефицит [15–18]. Установлено, что функциональная активность норадренергической системы играет значительную роль в реализации противосудорожного действия многих противоэпилептических препаратов, эффект которых ослаблен у грызунов с дефицитом НА [17, 19]. Показано также, что противосудорожный эффект стимуляции блуждающего нерва (способа ослабления пилокарпиновых судорог), достигается за счет повышения уровня НА в гиппокампе [20, 21]. Как известно, источником норадренергической иннервации практически всех отделов мозга является ядро locus coeruleus (голубое пятно), расположенное в области моста. Роль этого ядра в генезе аудиогенной эпилепсии была показана достаточно давно [22], как и то, что феномен киндлинга, вызванного электростимуляцией миндалины, сопровождается ослаблением норадренергической нейротрансмиссии в мозге [23]. Ранее, при сопоставлении двух групп крыс с АЭ (линий GEPR-9 и GEPR-3), было установлено, что у GEPR-9 (с повышенной предрасположенностью к АЭ) норадренергическая “недостаточность” выражена сильнее, чем у GEPR-3 [24]. У крыс линии GEPR-3 формирование АуК сопровождается усилением дефицита НА в стволе мозга, в новой коре, гиппокампе, гипоталамусе и миндалине [25]. Авторы полагают, что это связано с тем, что повторные судороги при выработке АуК у крыс GEPR-3 снижают и без того низкую активность тирозингидроксилазы (фермента лимитирующего синтез НА) в locus coeruleus и в нижнем бугорке четверохолмия [26]. Однако следует также помнить, что линии GEPR имеют иной, чем линия КМ, генетический фон.

В настоящей работе у крыс группы КМ-АуК содержание НА в гипоталамусе и гиппокампе было выше, чем у животных группы КМ-фон (практически не отличаясь по этому показателю от линии “0”). В то же время во фронтальной коре группы КМ-АуК этот показатель был достоверно ниже, чем у линии “0” и у группы КМ-фон. Это может быть одним из индикаторов участия фронтальной коры в генезе миоклонических судорог (возможно через связи этой корковой структуры с миндалиной и гиппокампом). Отметим, однако, что в стволе мозга содержание НА было выше у обеих групп КМ по сравнению с группой “0”, что, по всей видимости, не совпадает с концепцией НА как ингибитора судорожной активности, во всяком случае, для структур ствола. Ранее было показано, что снижение содержания НА в переднем мозге при амигдалярном киндлинге значительно потенциирует развитие последнего [23, 27].

Анализ изменения показателей дофаминергической системы выявил только одно достоверное различие между двумя группами КМ – в прилежащем ядре содержание ГВК, показателя отражающего внеклеточный оборот дофамина, было достоверно выше у КМ-АуК vs КМ-фон.

Показатели метаболизма серотонина во всех структурах мозга крыс линии КМ значительно превышали таковые значения для крыс линии “0”, что соотносится с результатами, полученными ранее при сравнении с крысами Вистар [4]. При этом во всех отделах мозга наблюдались более высокие, чем у линии “0”, величины отношения 5-ОИУК/5-ОТ (как показателя “истощения” серотонина). Однако достоверное снижение уровня серотонина отмечалось только в стриатуме крыс КМ. Аналогичная картина наблюдалась у крыс линии GEPR-9, проявляющих стволовые судороги, у которых уровень серотонина был значительно ниже в данной структуре, чем у GEPR-3, проявляющих только клонические судороги [28]. АуК приводил к некоторому изменению показателей метаболизма серотонина в структурах мозга КМ. Наблюдалось снижение его интенсификации в гиппокампе, прилежащем ядре и особенно в стволе.

Таким образом, серийное предъявление звука (120 дБ) и формирование миоклонических судорог у крыс линии КМ привело к развитию изменения функциональной активности норадренергических и серотонергических систем мозга. Обнаруженные различия находятся в общем русле особенностей метаболизма нейротрансмиттеров у крыс линий, предрасположенных к АЭ [22, 29–31, 12, 32 ], хотя могут быть и отражением повышенной судорожной готовности в целом [33]. Следует, однако, отметить, что особенности состояния нейротрансмиттерных систем мозга при судорожных состояниях в ответ на звук, по всей видимости, следует рассматривать как модуляторные факторы, поскольку в развитии аудиогенной эпилепсии ключевую роль играют глутаматергическая и ГАМК-ергическая нейротрансмиттерные системы [34–36].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленные в настоящем исследовании особенности обмена норадреналина у крыс КМ до и после АуК подчеркивают важную роль коры (и как минимум ее фронтальных отделов) в генезе миоклонических судорог, развивающихся при ритмической провокации тонических судорожных припадков, имеющих “стволовое” происхождение. Содержание норадреналина в гиппокампе и гипоталамусе может быть индикатором того, что селекция на высокую предрасположенность к аудиогенной эпилепсии повлияла на этот показатель не только в структурах ствола. Интенсификация метаболизма серотонина более выражена у крыс КМ в “фоне”, а при формировании АуК наблюдается замедление метаболизма нейротрансмиттера в гиппокампе, прилежащем ядре и особенно в стволе мозга и “фоновый” дефицит серотонина в стриатуме исчезает. Полученные в данной работе результаты, наряду с описанными ранее аномалиями в ГАМКергической и глутаматергической системах [34–36], демонстрируют и подтверждают существенную роль дисбаланса моноаминов в определении повышенной судорожной готовности крыс линии Крушинского–Молодкиной.