Онтогенез, 2023, T. 54, № 1, стр. 105-113

ВВЕДЕНИЕ

В ходе генетического анализа пациентов с гипертрофической кардиомиопатией нами был выявлен пациент, имеющий вариант p.Asn515del (c.1543_1545delAAC) в 17-м экзоне гена MYBPC3 (Дементьева и др., 2020). Данный вариант представляет собой делецию одной аминокислоты и прежде уже обнаруживался у пациентов с гипертрофической (Поляк и др., 2016) и дилатационной (Waldmüller et al., 2011) кардиомиопатиями, однако его клиническое значение остается неясным. Поскольку большие перспективы для изучения клинического значения генетических вариантов открывает получение изогенных линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, имеющих одинаковый генетический фон и различающихся лишь присутствием одной мутации, было решено внести вариант p.Asn515del в ген MYBPC3 индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) здорового донора ICGi022-A (Malakhova et al., 2020).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ

Для редактирования геномной ДНК ИПСК здорового донора была использована система CRISPR/Cas9, состоящая из белка Cas9 и направляющей РНК, включающей последовательность (спейсер), комплементарную участку 17-го экзона гена MYBPC3 (протоспейсеру). Комплексы из направляющей РНК и белка Cas9 вместе с одноцепочечным донорным олигонуклеотидом, комплементарным участку 17-го экзона гена MYBPC3 и содержащим трехнуклеотидную делецию AAC (p.Asn515del), были доставлены в клетки линии ICGi022-A с помощью электропорации. Полученные после электропорации клоны ИПСК были проанализированы посредством ПЦР с использованием пары праймеров, которая позволяет детектировать присутствие варианта p.Asn515del. В результате было отобрано 12 позитивных на наличие варианта p.Asn515del клонов. Для этих клонов было проведено секвенирование 17-го экзона гена MYBPC3. Три клона оказались гомозиготными по трехнуклеотидной делеции в гене MYBPC3 (рис. 1а). Остальные клоны в одном аллеле имели вариант p.Asn515del, а во втором – различные варианты делеций и инсерций. Три линии ИПСК, гомозиготные по варианту p.Asn515del, ICGi022-A-3, ICGi022-A-4, ICGi022-A-5, были выбраны для дальнейшей работы и детально охарактеризованы. Линии ИПСК демонстрировали характерную для плюрипотентных стволовых клеток человека морфологию (рис. 1б) и экспрессировали маркеры плюрипотентного состояния: транскрипционные факторы OCT4, NANOG и поверхностные антигены TRA-1-60 и SSEA4 (рис. 1в). Количественный анализ с помощью ПЦР в реальном времени показал, что уровень экспрессии генов плюрипотентности OCT4, NANOG и SOX2 в этих линиях сопоставим с уровнем их экспрессии в линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 (рис. 1г).  G-бэндинг линий  ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 на 8–12 пассажах показал, что клетки сохраняли нормальный кариотип – 46,XX (рис. 1д). Способность линий ИПСК давать производные трех зародышевых листков оценивалась посредством спонтанной дифференцировки в эмбриоидных тельцах. Иммунофлуоресцентное окрашивание дифференцированных клеток выявило экспрессию маркеров эктодермы (β3-тубулина (TUBB3) и MAP2), мезодермы (гладкомышечного α-актина (αSMA) и транскрипционного фактора NKX2-5), энтодермы (ядерного фактора гепатоцитов HNF3β и цитокератина 18 (СК18)) (рис. 1е). В полученных линиях ИПСК, как и в исходной линии ICGi022-A, отсутствовали эписомные векторы (рис. 1ж), а также контаминация микоплазмами (рис. 1з). Анализ коротких тандемных повторов (STR) в линиях ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 подтвердил их идентичность исходной линии ИПСК ICGi022-A по 26 полиморфным локусам (данные доступны по запросу у авторов). С помощью секвенирования по Сэнгеру в полученных линиях ИПСК было продемонстрировано отсутствие нецелевой активности системы CRISPR/Cas9 в 4 предсказанных с помощью ресурса Benchling (https://www.benchling.com/) сайтах. Пример анализа одного из предсказанных сайтов нецелевой активности системы CRISPR/Cas9 представлен на рис. 1и.

Рис. 1.

Начало.

Рис. 1.

Характеристика линий ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4, ICGi022-A-5 с внесенной в ген MYBPC3 мутацией p.Asn515del. (а) В трех линиях ИПСК, полученных в результате редактирования гена MYBPC3 линии ИПСК ICGi022-A, выявлена гомозиготная мутация p.Asn515del. (б) Морфология линий ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5. Масштабная линейка – 200 мкм. (в) Экспрессия транскрипционных факторов OCT4 и NANOG и поверхностных антигенов TRA-1-60 и SSEA4 в полученных линиях ИПСК. Масштабная линейка – 100 мкм. (г) Анализ экспрессии генов OCT4, NANOG, SOX2 методом ПЦР в реальном времени в линиях ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5. Линия эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 была использована в качестве контроля. (д) Кариотип полученных линий ИПСК. (е) Подтверждение способности линий ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 дифференцироваться в производные трех зародышевых листков. Масштабная линейка – 100 мкм. (ж) ПЦР-тест показал отсутствие в полученных линиях ИПСК эписомных векторов. (з) ПЦР-тест показал отсутствие контаминации линий ИПСК микоплазмами. (и) Отсутствие нецелевой активности системы CRISPR/Cas9 в линиях ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 в предсказанном сайте нецелевой активности chr14:56408506-56408525 .

Паспорт линий ИПСК ICGi022-A-3, ICGi022-A-4 и ICGi022-A-5 представлен в табл. 2, полная характеристика этих линий приведена в табл. 3.