Успехи современной биологии, 2022, T. 142, № 6, стр. 578-590

ВВЕДЕНИЕ

С 1880-х гг., когда Жан-Жак Шлезинг и Ахилл Мюнц впервые установили взаимосвязь процесса нитрификации с деятельностью почвенных микроорганизмов, и до настоящего времени продолжается развитие представлений о важнейшей роли почвенной микробиоты в процессах почвообразования (Омелянский, 1940). Число публикаций, посвященных таксономическому разнообразию почвенных микроорганизмов, неуклонно растет в последние десятилетия (Манучарова и др., 2020; Чернов, Железова, 2020; Wellington et al., 2003; Thomson et al., 2010; Delgado-Baquerizo et al., 2018). Анализ почвенного метагенома или рибосомальной РНК in situ позволяет идентифицировать таксономические группы микроорганизмов, установить взаимосвязи между таксономической структурой и экологическими функциями микробного сообщества (Wellington et al., 2003), выявить место тех или иных таксономических групп в пищевых сетях и их участие в разложении органического вещества почвы. Изучение бактериального разнообразия на основе 16S рРНК позволило установить, что почва является одной из самых насыщенных прокариотами сред обитания на Земле. Несмотря на то, что сам ген 16S составляет примерно 0.05% среднего прокариотического генома, анализ этого участка рибосомальной РНК дает ценную информацию о разнообразии микробных популяций (Steele, Streit, 2005). Идентификация 16S рРНК до сих пор остается мощным инструментом микробной экологии. Одним из эффективных современных методов является метод in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами – FISH (fluorescence in situ hybridisation) (Манучарова, 2010; Amann et al., 1995).

Однако, несмотря на огромное разнообразие прокариот, их значимые экологические группы в почвах нашей планеты составляют сравнительно немногочисленные филотипы, около 2% от общего разнообразия (Delgado-Baquerizo et al., 2018). Наиболее распространенные из этих филотипов относятся к следующим филумам: Alphaproteobacteria (Bradyrhizobium, Sphingomonas, Rhodoplanes), Betaproteobacteria (Methylibium, Ramlibacter), Acidobacteria (Solibacter), Actinobacteria (Streptomyces, Salinibacterium, Mycobacterium). К достаточно распространенным таксономическим группам почвенных микроорганизмов относятся также Verrucomicrobia. Несмотря на низкую частоту встречаемости представителей этого филума в большинстве исследований, целенаправленный поиск позволяет выявлять более 20% Verrucomicrobia в почвах (Чернов, 2016; Janssen, 2006; Hansel et al., 2008; Bergmann et al., 2011). Отдельную нишу в исследованиях микробного разнообразия почв занимают Archaea. Вклад этой группы прокариот в микробные сообщества различных местообитаний может варьировать от долей процента до половины всей численности, как это было показано для олиготрофных болот (Панкратов, 2007).

Соотношение основных таксономических групп характеризуется широкой изменчивостью даже в пределах одного почвенного типа. Так, в различных черноземах доли Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria и Verrucomicrobia варьировали соответственно в пределах 8–36% (Чернов и др., 2018; Манучарова и др., 2020), 4–11% (Манучарова и др., 2020; Горбачева, 2016), 15–35% (Горбачева, 2016; Мельничук и др., 2018), 1.4–21% (Мельничук и др., 2018; Чернов и др., 2018). На таксономическую структуру микробных сообществ существенно влияет состав растительности. При исследовании почв зонального ряда для учета различий таксономической структуры в пределах одной природной зоны необходимо принимать во внимание взаимосвязи между растениями и микроорганизмами.

Метаболические особенности представителей некоторых филогенетических групп нередко перекрываются, однако существует возможность установить их преимущественную экологическую роль, поскольку микроорганизмы различных групп, разлагающие органическое вещество почвы, вступают в процессы его переработки на разных стадиях, с различной интенсивностью, играя свою роль в зависимости от условий среды. К существенным сезонным изменениям таксономической структуры микробных сообществ может приводить сельскохозяйственное использование почв. Так, в конце вегетации культуры увеличивается доля Actinobacteria, поскольку микробное сообщество нуждается в разрушении трудно гидролизуемого органического вещества, накопившегося в виде пожнивных остатков. В середине вегетации на разных фазах роста растений могут доминировать другие группы. При этом использование удобрений увеличивает количество копиотрофных и снижает долю олиготрофных микроорганизмов (Semenov, 2021).

В связи с множеством публикаций, посвященных таксономическому разнообразию микробных сообществ в почвах различных природных зон, появилась необходимость в обобщении и структуризации этих данных. Цель исследования – обзор экологически значимых таксономических групп прокариот в почвах зонального ряда и сравнительный анализ результатов, полученных нами для южного чернозема методом FISH, с данными о таксономическом разнообразии типичных и южных черноземов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Статистическую обработку данных по 40 почвам из 23 литературных источников проводили в программе Excel с помощью построения диаграмм box plot (Krzywinski, Altman, 2014) и в программе STATISTICA методом главных компонент.

Материал экспериментального исследования – верхний горизонт чернозема южного (Богучарский р-он Воронежской обл.). Образцы отбирались в июне 2021 г. В этом году почва после многолетней регулярной распашки впервые перестала использоваться. Начался переход пахотной почвы в залежное состояние. Растительное сообщество было представлено сурепкой Barbarea vulgaris, проективное покрытие составляло 100%. Проведена оценка относительного обилия метаболически активных клеток микроорганизмов различных таксономических групп с использованием рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов, меченных Cy-3, в трех независимых повторностях (Манучарова, 2010): Archaea ARCH915, Alphaproteobacteria ALFlb, Betaproteobacteria ВЕТ42а, Actinobacteria HGC69a, Acidobacteria НоАс, Verrucomicrobia Ver138. При этом общую численность микробного сообщества почвы оценивали в тех же образцах с использованием акридина оранжевого. Статистическая обработка данных проводилась стандартными методами (Дмитриев, 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Относительное обилие основных таксономических групп микробных сообществ в верхних горизонтах почв зонального ряда приведено в табл. 1.

Оценка таксономической структуры методом FISH проводилась в 10% выборки, остальные 90% результатов были получены с помощью метагеномного анализа.

Одна из самых распространенных микробных групп во многих почвах – Proteobacteria, что подтверждается как молекулярными методами, так и методами культивирования. Эта таксономическая группа в совокупности обладает широким спектром метаболических возможностей, включая копиотрофных, метилотрофных, азотфиксирующих, сульфат- и железоредуцирующих бактерий (Zhang, Xu, 2008). Большинство представителей Proteobacteria относятся к копиотрофам, участвующим в разложении легкодоступной органики (Eilers et al., 2010; Goldfarb et al., 2011).

В почвах зонального ряда выявлено широкое варьирование относительного обилия Proteobacteria (рис. 1).

Рис. 1.

Относительное обилие Proteobacteria в верхних горизонтах почв зонального ряда: 1 – вечномерзлые почвы (n = 4), 2 – почвы лесной зоны (n = 12), 3 – черноземы (n = 10), 4 – почвы сухостепной зоны (n = = 7), 5 – пустынные почвы (n = 6).

В степных почвах доля Proteobacteria снижается, по сравнению с лесными почвами, до 14–36% в черноземах и до 12–31% в почвах зоны сухих степей. При этом в коричневой почве содержание Proteobacteria в микробном пуле выше, чем в каштановой почве, а средние и медианные величины этого показателя соответствуют солонцам. Широкий разброс относительного обилия Proteobacteria отмечен в почвах пустынь – от 25 до 51%. Здесь наиболее высокий процент этой группы выявлен в биогенных горизонтах пустынных почв Восточного Казахстана (Кутовая и др., 2015). Необходимо отметить, что механизмы адаптации к высыханию для большинства Proteobacteria до сих пор остаются неразгаданными, однако они нередко составляют высокую долю в микробном разнообразии пустынь (Heulin et al., 2017).

В отдельных случаях отмечаются низкие величины относительного содержания Proteobacteria – в темно-серой лесной почве Белгородской обл., в черноземе типичном Воронежской обл. (Чернов и др., 2018) и в почве пустыни Атакама в Чили (Neilson et al., 2012). В целом, тенденция снижения содержания Proteobacteria в микробных сообществах отмечена в зональном ряду от почв лесной зоны к почвам сухостепной зоны.

Обилие таксонов Proteobacteria обычно уменьшается с глубиной (Steger et al., 2019). Однако в микробных сообществах глубоких почвенных горизонтов известны случаи резкого увеличения доли этой таксономической группы. Так, в нижнем горизонте солонца на границе с почвообразующей породой их содержание в микробном пуле достигает почти 100% (Чернов, 2016). Эти данные согласуются с недавно полученными нами результатами о значительном увеличении доли сапротрофных микроорганизмов с глубиной в современных и погребенных почвах (Юршенас, Каширская, 2022). Кроме того, высокое обилие Proteobacteria в глубоких горизонтах почв может быть связано с разнообразием этой группы и присутствием среди ее представителей сульфат- и железоредуцирующих бактерий. Известно, что в поверхностных горизонтах преобладают Alphaproteobacteria, а в более глубоких слоях – Betaproteobacteria (Steger et al., 2019). Отмечены случаи увеличения относительного обилия Betaproteobacteria в нарушенных почвах (Кондакова, 2019; Labbé et al., 2007). Считается, что представители данной группы могут вести себя как олиготрофы.

Следующая экологически значимая группа микроорганизмов, имеющая повсеместное распространение в почвах Земного шара, – Acidobacteria. Большинство представителей этой группы – ацидофильные хемогетеротрофы, растущие аэробно в мезофильных условиях (Zhang, Xu, 2008), они связаны с трансформацией органического вещества почвы (Banerjee et al., 2016). Acidobacteria принимают участие в регуляции биогеохимических циклов, секреции экзополисахаридов и стимуляции роста растений (Kalam et al., 2020). Они активно участвуют в утилизации труднодоступного органического вещества, образующегося при отмирании растений, грибов и насекомых (Kalam et al., 2020). Некоторые представители Acidobacteria, синтезируя широкий спектр гликозидгидролаз, способны к расщеплению сложных углеводных полимеров: ксилана, целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина, крахмала и хитина (Ward et al., 2009; Belova et al., 2018). Исследования предполагают взаимосвязь генных модулей, кодирующих эти ферменты, с устойчивостью Acidobacteria к высыханию. Все культивируемые Acidobacteria являются грамотрицательными, не образуют спор и демонстрируют олиготрофный способ питания. Отсутствие роста на обычных питательных средах у большинства представителей данной группы может быть связано с их олиготрофной природой или экологической K-стратегией (Ward et al., 2009).

На рис. 2 представлено соотношение Proteobacteria и Acidobacteria в верхних горизонтах почв зонального ряда. В почвах лесных экосистем относительное обилие как Proteobacteria, так и Acidobacteria, было в большей части случаев заметно выше, чем в степных почвах. Это может быть связано с преобладанием процессов разложения органического вещества в лесных почвах, тогда как почвы степной зоны характеризуются большей интенсивностью накопления органики, высокой емкостью катионного обмена и формированием почвенных микроагрегатов. Установлено, что в микроагрегатах представители Acidobacteria содержатся в меньшем количестве, по сравнению с макроагрегатами (Mummey et al., 2006).

Рис. 2.

Соотношение Proteobacteria и Acidobacteria в верхних горизонтах почв зонального ряда: 1 – арктическая почва, 2 – торфяная почва тундры, 3 – лесные почвы, 4 – степные почвы, 5 – почвы пустынь, 6 – субтропические почвы.

Преобладание Acidobacteria отмечено в микробных сообществах субтропических почв чайных плантаций Китая (Li et al., 2016). Известно, что в тропических почвах с недостатком питательных веществ представители Acidobacteria получают преимущество, благодаря высокой способности адаптироваться к разложению сложных субстратов (Ward et al., 2009).

Пустынные почвы в большей части случаев характеризовались широким варьированием относительного обилия Proteobacteria и низкими величинами доли Acidobacteria, за исключением почвы пустыни Сахара, где доля последних достигала 17%.

Важную роль в процессах минерализации почвенного органического вещества играют Actinobacteria, способные разлагать различные его формы, включая труднодоступные. В этом аспекте Actinobacteria могут выполнять ту же экологическую функцию, что и рассмотренная ранее группа Acidobacteria, но преимущество они получают при других условиях. Большинство представителей Actinobacteria предпочитают значения рН = 6–9 и умеренную температуру – 25–30°C. Богатые органическим веществом щелочные почвы оптимальны для их развития (Hazarika, Thakur, 2020). В зональном ряду при снижении кислотности и увеличении температуры почв доля Actinobacteria увеличивается с уменьшением доли Acidobacteria.

Поиск взаимосвязи между относительным обилием Actinobacteria и Proteobacteria в верхних горизонтах почв зонального ряда представлен на рис. 3. Эти таксономические группы показали здесь отрицательную корреляцию с коэффициентом r = –0.77. Наибольшее содержание Actinobacteria и наименьшее – Proteobacteria отмечено в почве пустыни Атакама в Чили, которая известна как самая сухая пустыня земного шара (Neilson et al., 2012). Почва отличается высоким рН и достаточно развитым растительным покровом, представленным преимущественно Cistanthe salsoloides. Подобные условия приемлемы для устойчивых к высыханию, способных к образованию спор представителей Actinobacteria, относительное обилие которых здесь достигает 77%. Известно, что устойчивость микроорганизмов к обезвоживанию – наиболее существенный адаптивный признак для засушливых местообитаний (Heulin et al., 2017). Кроме того, преобладание Actinobacteria в почвах, растительный покров которых представлен ксерофитами, связано с их способностью перерабатывать труднодоступное органическое вещество.

Рис. 3.

Взаимосвязь относительного обилия Proteobacteria и Actinobacteria в верхних горизонтах почв зонального ряда: 1 – арктическая почва, 2 – торфяная почва тундры, 3 – лесные почвы, 4 – степные почвы, 5 – почвы пустынь, 6 – субтропические почвы.

Увеличение относительного обилия Actinobacteria в микробном сообществе, сопровождающееся уменьшением доли Proteobacteria, наблюдается в щелочных почвах степной зоны. В лесных и вечномерзлых почвах с низкими значениями рН доля Actinobacteria уменьшается, поскольку преимущество здесь получают другие представители гидролитического микробного комплекса. Наименьшие значения относительного обилия Actinobacteria на фоне высокого обилия Proteobacteria отмечены в лесной почве Чехии (Lladó et al., 2016), пустынных почвах Казахстана (Кутовая и др., 2015) и кислых тропических почвах Китая (Li et al., 2016; Wang et al., 2016).

В погребенных палеопочвах содержание Actinobacteria в некоторых случаях сохраняется на уровне выше 30% от общего пула микроорганизмов (Семенов и др., 2020). В коллювиальных почвах Южной Моравии, Чешская Республика наибольшее их относительное обилие отмечено на глубине 250–350 см в погребенном гумусовом горизонте палеочернозема (Sagova-Mareckova et al., 2016). По-видимому, рассматриваемый горизонт изначально был богат органическим веществом, обеспечившим высокую исходную численность этой характерной для черноземов группы гидролитического микробного комплекса. С другой стороны, доля Actinobacteria нередко увеличивается с глубиной, поскольку они способны к олиготрофному способу питания. Закономерные изменения в зависимости от глубины почвенного слоя для Actinobacteria обычно не выявляются (Eilers et al., 2012).

Свидетельства широкого распространения и многочисленности Verrucomicrobia в почвах указывают на значимую роль этих микроорганизмов, хотя конкретная экологическая их функция до сих пор не установлена (Zhang, Xu, 2008). Доля представителей этого филума в микробных сообществах современных почв редко превышает 5%, однако существует вероятность значительной их недооценки, поскольку большинство используемых праймеров не обеспечивают в достаточной мере амплификацию генов 16S рРНК Verrucomicrobia (Bergmann et al., 2011). Долгое время считалось, что они олиготрофны и могут расти при низкой доступности углерода (Eilers et al., 2012). Выявлено увеличение относительного обилия данной группы с повышением концентраций нитратного и аммонийного азота, что подтверждает идею о способности развиваться при низких концентрациях углерода, используя для получения энергии неорганические соединения (Steger et al., 2019). Тем не менее, методом метабаркодинга показана взаимосвязь большей части Verrucomicrobia с верхними горизонтами почвы, что указывает на их потребность в высоком содержании органического вещества (Семенов и др., 2020). В пахотных почвах, в ответ на снижение содержания органического углерода после вспашки, численность Verrucomicrobia резко уменьшается (Semenov, 2021).

На рис. 4 представлено относительное обилие Verrucomicrobia в верхних горизонтах современных почв зонального ряда и в погребенных почвах. Среди вечномерзлых почв данные по относительному обилию Verrucomicrobia получены для торфяной почвы Большеземельской тундры (Лаптева и др., 2017), антарктической почвы Фолклендских островов (Yergeau et al., 2012) и арктической почвы Шпицбергена (Schostag et al., 2015). Значения этого показателя составляют здесь 3, 10 и 20% соответственно. В современных лесных, степных и пустынных почвах относительное обилие Verrucomicrobia, как правило, варьирует в близком диапазоне от 1.1 до 7.9%. В палеопочвах представленность этой таксономической группы снижается в 2–4 раза, по сравнению с современными почвами. При этом Verrucomicrobia – индикаторы разновозрастных погребенных палеопочв, где их распространенность в ряде случаев на порядок ниже, чем в современных почвах (Чернов и др., 2018). Однако единичные случаи экстремально высоких величин относительного обилия Verrucomicrobia в пределах 20–30% отмечены как в современных почвах, так и в погребенных палеопочвах.

Рис. 4.

Относительное обилие Verrucomicrobia в верхних горизонтах почв зонального ряда и погребенных почв: 1 – вечномерзлые почвы (a – арктическая почва, b – почва Антарктиды, c – торфяная почва тундры) (n = 3), 2 – почвы лесной зоны (n = 10), 3 – почвы степной зоны (n = 9), 4 – пустынные почвы (n = 5), 5 – погребенные почвы (n = 6).

Сравнительный анализ относительного обилия четырех таксономических групп в микробных сообществах верхних горизонтов лесных и степных почв проводился с помощью метода главных компонент (рис. 5). На диаграмме рассеяния представлены 81.7% различий между шестнадцатью вариантами, семь из которых относится к степным почвам и девять – к почвам лесной зоны. К группе лесных почв отнесены две палеопочвы, погребенные 2 тыс. л. н. и 2.6–2.4. тыс. л. н., к группе степных почв – одна палеопочва, погребенная 3.7–3.5 тыс. л. н. Увеличение доли Acidobacteria смещает координаты на факторной плоскости в положительном направлении по оси Ох (фактор 1), а увеличение доли Verrucomicrobia – в положительном направлении по оси Оy (фактор 2). Умеренная положительная корреляция с коэффициентом 0.5 выявлена между группами Acidobacteria и Proteobacteria, умеренная отрицательная корреляция с коэффициентом –0.6 – между группами Acidobacteria и Actinobacteria. Увеличение относительного обилия Proteobacteria смещает координаты в положительном направлении по фактору 1 и в отрицательном – по фактору 2, а рост относительного обилия Actinobacteria – в отрицательном направлении по обеим осям.

Рис. 5.

Анализ содержания Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria и Verrucomicrobia в микробных сообществах верхних горизонтов лесных (n = 8) и степных (n = 7) почв с помощью метода главных компонент.

Таким образом, для большинства почв лесной зоны характерны высокие показатели Acidobacteria и Proteobacteria, а в степных почвах преобладающая группа – Actinobacteria. Значительное увеличение Verrucomicrobia отмечено в единичных случаях как в лесных, так и в степных почвах. Палеопочвы характеризуются низким содержанием Verrucomicrobia, по сравнению с большей частью современных почв.

На рис. 6 представлены результаты экспериментальной работы: численность и относительное обилие основных таксономических групп микробного сообщества в черноземе южном Богучарского р-на Воронежской обл. Общая численность микробных клеток, окрашенных акридином оранжевым, достигает в верхнем горизонте 3.42 × 10⁸ кл./г. Гибридизация с олигонуклеотидными зондами позволяет выявить около 60% микробного сообщества. Численность отдельных таксономических групп варьирует от 0.14 × 10⁸ до 0.59 × 10⁸ кл./г. Максимальную долю микробного сообщества представляют Alphaproteobacteria – 17%, а минимальную – Verrucomicrobia – 4% от общей численности микробных клеток, окрашенных акридином оранжевым. Сумма Alphaproteobacteria и Betaproteobacteria составляет 26%, что согласуется с результатами по обилию Proteobacteria в южных черноземах, где, по данным метагеномного анализа, эта группа микроорганизмов варьирует в пределах 23–26%, увеличиваясь при оптимальной сельскохозяйственной обработке (Мельничук и др., 2018).

Рис. 6.

Численность и относительное обилие таксономических групп микробного сообщества в верхнем слое южного чернозема Богучарского р-на Воронежской обл.: 1 – Alphaproteobacteria, 2 – Betaproteobacteria, 3 – Acidobacteria, 4 – Actinobacteria, 5 – Verrucomicrobia, 6 – Archaea.

Значительную долю микробного сообщества – 13% составляют Acidobacteria, что наиболее близко к значению, обнаруженному в верхнем слое пахотного чернозема Курской обл. (Горбачева, 2016), где содержание данной группы достигает 11%. В пахотных почвах варьирование численности Actinobacteria и Acidobacteria может быть обусловлено сезонными изменениями. В конце вегетации культуры преобладание какой-либо из этих групп гидролитического микробного комплекса, принимающих участие в утилизации пожнивных остатков, зависит от рН и температуры почвы. Зима 2020/2021 гг. признана самой холодной за последние 10 лет, а исследуемый нами чернозем южный только в 2021 г. начал переход из состояния пахотной почвы в залежное. Здесь могла сохраниться высокая доля Acidobacteria, поскольку их представители более устойчивы к низким температурам, по сравнению с Actinobacteria, доля которых, по данным нашего исследования составляет 8%, что в 2–4.5 раза меньше, чем в черноземах, исследованных ранее (Горбачева, 2016; Мельничук и др., 2018). При этом значения относительного обилия Archaea и Verrucomicrobia составляют 8 и 4% соответственно, подтверждая данные метагеномного анализа, полученные для южных черноземов (Мельничук и др., 2018).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщение данных по содержанию экологически значимых таксономических групп микробных сообществ в верхних горизонтах зональных почв выявило различия между почвами лесных и степных экосистем. В почвах лесной зоны преобладают Proteobacteria, принимающие участие в разложении легкодоступного органического вещества, и Acidobacteria, способные усваивать труднодоступное органическое вещество при низких значениях рН. В степной зоне с более теплым климатом и щелочными почвами в качестве преобладающей группы гидролитического микробного комплекса выделены Actinobacteria.

В ряду зональных почв выявлена отрицательная корреляция с коэффициентом r = –0.77 между величинами относительного обилия Actinobacteria и Proteobacteria. При этом для обеих групп отмечена высокая устойчивость к засушливым условиям.

Хотя случаи экстремально высокого содержания Verrucomicrobia наблюдаются как в современных почвах, так и в палеопочвах, для большей части палеопочв различного возраста характерно существенное уменьшение относительного обилия данной группы, по сравнению с современными почвами.

В южном черноземе Богучарского р-на Воронежской обл. выявлены повышенная доля Acidobacteria и низкая доля Actinobacteria. По-видимому, баланс между этими двумя таксономическими группами здесь еще не успел восстановиться после длительного периода сельскохозяйственного использования и холодной зимы. При этом относительное обилие Archaea, Verrucomicrobia и Proteobacteria показывают значительное сходство с результатами метагеномных исследований южных черноземов.