БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 11, с. 1578 - 1591

УДК 577.151

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

И НЕОЖИДАННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ СНИЖЕНИЯ ЕЕ АКТИВНОСТИ

Обзор

В.И. Муронец^1,2*^,**, А.К. Мельникова²**,

К.В. Баринова¹, Е.В. Шмальгаузен¹**

¹ НИИ Физико химической биологии имени А.Н. Белозерского,

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

119234 Москва, Россия; электронная почта: vimuronets@belozersky.msu.ru

² Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

факультет биоинженерии и биоинформатики, 119234 Москва, Россия

Поступила в редакцию 11.06.2019

После доработки 11.08.2019

Принята к публикации 14.08.2019

В обзоре рассмотрено использование ингибиторов глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы (ГАФД) для

изучения этого фермента и подавления его активности в различных типах клеток. Основная проблема спе

цифического ингибирования ГАФД заключается в высокой консервативности активного центра фермента

и, особенно, окружения необходимой для катализа сульфгидрильной группы остатка Cys150. Многочислен

ные попытки найти ингибиторы спермоспецифичной ГАФД, а также ГАФД трипаносом (Trypanosoma sp.) и

микобактерий (Mycobacterium tuberculosis), которые бы не оказывали существенного воздействия на фермент

соматических клеток млекопитающих, не привели к практически важным результатам, что заставляет ис

кать новые пути решения этой задачи. Отдельные разделы посвящены инактивации фермента активными

формами кислорода, глутатионом и гликирующими соединениями. В заключительном разделе обсуждают

ся последствия, к которым приводит ингибирование, а также инактивация ГАФД. В частности, рассматри

вается влияние изменения активности ГАФД на эффективность гликолиза и на связанные с ним метаболи

ческие пути (пентозофосфатный путь, «футильный» цикл разобщения окисления и фосфорилирования в

гликолизе и другие).

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа, ингибиторы, окисление, сульфгидрильные

группы, гликирование, гликолиз.

DOI: 10.1134/S0320972519110058

Изучение глицеральдегид 3 фосфатдегидро

Н.К. Наградовой обнаружить не удалось, и их

геназы (ГАФД) на кафедре биохимии животных

воздействие на ферменты было объяснено бу

биологического факультета МГУ было начато

ферным или хелатирующим действием дипеп

более 60 лет назад Натальей Константиновной

тидов [2]. Однако именно эти работы послужи

Наградовой [1]. Как и многие другие направле

ли основой для многолетнего и разносторонне

ния, оно было инициировано Сергеем Евгенье

го изучения глицеральдегид 3 фосфатдегидро

вичем Севериным с целью выявления воздей

геназы сначала на кафедре, а затем в созданном

ствия дипептидов - карнозина и анзерина - на

С.Е. Севериным отделе биохимии животной

различные процессы: функционирование кле

клетки НИИ Физико химической биологии

ток и отдельных органелл, метаболические пути

имени А.Н. Белозерского МГУ. Более 150 статей

и поведение ферментов. Специфического влия

о глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназе, в том

ния дипептидов на ГАФД в первых работах

числе обзоры и монография, были опубликова

ны за эти годы сотрудниками нашей лаборато

рии. Пророческие слова С.Е. Северина, пере

Принятые сокращения: ГАФД - глицеральдегид 3

фразировавшего известное изречение, «Глице

фосфатдегидрогеназа, ГАФД с - спермоспецифичная гли

ральдегид 3 фосфатдегидрогеназа неисчерпае

церальдегид 3 фосфатдегидрогеназа, GSH - восстанов

ленный глутатион, ДГАФ - дигидроксиацетонфосфат.

ма как атом» подтверждаются возрастающим

* Адресат для корреспонденции.

интересом к этому ферменту, который продол

** Автор является выпускником кафедры биохимии биоло

жают изучать как ученики Н.К. Наградовой, так

гического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

и другие исследователи.

1578

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1579

Глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа ка

точников, прежде всего, за счет окислительного

тализирует одну из реакций гликолиза, так назы

фосфорилирования в митохондриях.

ваемую реакцию гликолитической оксидоредук

Высокая концентрация фермента, его присут

ции, являющуюся важной стадией как анаэроб

ствие во всех типах клеток, конститутивный

ного, так и аэробного энергетического пути. В

синтез сделали его основным белковым марке

ходе этой реакции образуется макроэргическое

ром, который служит для нормирования концен

соединение - 1,3 дифосфоглицерат, необходи

трации других белков при всех типах воздей

мый для синтеза АТР на последующих стадиях

ствий. В тысячах статей, в которых упоминается

гликолиза, и NADH. В анаэробных условиях (у

ГАФД (GAPDH или GPDH), речь идет не об изу

анаэробных микроорганизмов или у аэробных

чении этого фермента, а просто о его использо

организмов при гипоксии) гликолиз является

вании в качестве белка маркера. Однако посте

единственным источником энергии, при этом

пенно накапливается информация о том, что

NADH используется при восстановлении пиру

ГАФД может участвовать в регуляции жизнедея

вата до лактата. Не меньшее значение имеет

тельности клеток, и, изменяя ее активность,

ГАФД для энергообеспечения в аэробных усло

можно воздействовать не только на энергетиче

виях, поскольку в этом случае пируват и NADH

ский обмен, но и на другие процессы. Стало по

необходимы для синтеза АТР митохондриями.

нятно, что каталитическая активность ГАФД не

Следует также отметить, что в аэробных услови

столь велика, поскольку рН оптимум этого фер

ях определенное значение для бесперебойного

мента лежит в щелочной области (рН 9-10), а

образования субстратов окислительного фосфо

при физиологических значениях рН активность

рилирования в митохондриях может иметь ра

ГАФД значительно ниже (~30-40% от макси

зобщение окисления и фосфорилирования в

мальной). Кроме того, содержание ГАФД может

гликолизе. Такое разобщение может происхо

существенно изменяться при различных патоло

дить при мягком окислении ГАФД из за появле

гических процессах как за счет снижения синте

ния у фермента ацил фосфатазной активности,

за белка, так и из за его денатурации и накопле

как было показано в наших работах ранее [3-5].

ния неактивных агрегированных форм. Возник

Гидролиз

1,3 дифосфоглицерата окисленной

ли сомнения в правомерности использования

ГАФД позволяет при недостатке ADP обходить

ГАФД в качестве основного белка маркера из за

3 фосфоглицераткиназную реакцию и синтези

вариабельности его содержания в анализируе

ровать пируват и NADH, необходимые для окис

мых образцах [7, 8]. Особое значение имеет ин

лительного фосфорилирования в митохондриях.

формация о вовлечении ГАФД в развитие раз

Однако, несмотря на важность ГАФД и ее ин

личных заболеваний, например, нейродегенера

тенсивное изучение (на этом объекте была сде

тивных болезней амилоидной природы [9-11].

лана значительная часть фундаментальных энзи

При этом ГАФД может участвовать как в изме

мологических исследований), долгое время

нении энергоснабжения клеток при этих пато

ГАФД не считали перспективной мишенью для

логиях, так и непосредственно вовлекаться в

воздействия на жизнедеятельность клетки. При

формирование амилоидных агрегатов. Все эти

чин такого «пренебрежительного» отношения к

наблюдения придают новое значение исследо

ферменту было несколько. Во первых, содержа

ваниям действия ингибиторов на функциониро

ние ГАФД во всех клетках очень велико (5-15%

вание глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы.

от общего содержания растворимых белков) [6],

В представленном обзоре мы рассматриваем

во вторых, этот белок синтезируется постоянно

информацию о действии различных ингибито

и относится к белкам «домашнего хозяйства»

ров как на свойства глицеральдегид 3 фосфат

(«housekeeping») [6], и, в третьих, информация о

дегидрогеназы, так и на изменение метаболизма

регуляторных воздействиях на ГАФД долгое вре

в целом.

мя практически отсутствовала. Казалось очевид

ным, что ингибировать такой фермент, который

никак нельзя отнести к «ключевым» ферментам

ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ

гликолиза (в отличие от фосфофруктокиназы),

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТ

не имеет смысла из за его исходной очень высо

ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

кой общей активности. Более того, существова

ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТА

ние альтернативных метаболических путей, нап

ример, пентозофосфатного, ограничивало при

В течение десятилетий исследование

менение ингибиторов ГАФД для уменьшения

действия ингибиторов на каталитические свой

жизнеспособности клеток. Даже после ингиби

ства ГАФД было основным методом выяснения

рования этого участка гликолиза энергоснабже

механизма действия этого фермента, вплоть до

ние клеток могло быть обеспечено из других ис

появления 70 х гг. сведений о его простран

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1580

МУРОНЕЦ и др.

ственной структуре. Этой теме можно было бы

специфическим мутагенезом могла бы решить

посвятить отдельный обзор, но, как минимум,

ряд задач (особенности эффекта «полуцентро

следует упомянуть имена крупнейших биохими

вой реактивности» у ГАФД из разных источни

ков 20 го столетия, которые проводили эти ис

ков, идентификацию структурных мотивов, вов

следования. В работах нобелевского лауреата

леченных в кооперативную работу активных

Пола Бойера (Cardon and Boyer [12]), Даниеля

центров, роль второго остатка Cys154 в актив

Кошланда (Koshland [13]), Сиднея Бернхарда

ном центре фермента и др.).

(Malhotra and Bernhard [14]) и многих других был

установлен механизм реакции, катализируемой

ГАФД, а также общие закономерности функцио

ИНАКТИВАЦИЯ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3

нирования сложного олигомерного фермента.

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Сделанные наблюдения позволили сформиро

ЕСТЕСТВЕННЫМИ МЕТАБОЛИТАМИ -

вать представления о взаимодействии фермента

ОКИСЛЕНИЕ И S ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЕ

с субстратом (модель индуцированного соответ

ствия «рука перчатка» Byers and Koshland [15] и

Каталитическая функция остатка Cys150 ак

Levitzki and Koshland [16]), о роли кооператив

тивного центра глицеральдегид 3 фосфатдегид

ных процессов в регуляции фермента и о многих

рогеназы досконально изучена - именно он взаи

других классических законах энзимологии. Ин

модействует с коферментом NAD c образовани

тенсивное изучение ингибирования и инактива

ем «комплекса с переносом заряда», а затем аци

ции ГАФД, проведенное Н.К. Наградовой и ее

лируется субстратом реакции, глицеральдегид

сотрудниками, внесло существенный вклад в

3 фосфатом. Естественно, что любая модифи

выяснение роли отдельных аминокислотных ос

кация этого остатка или его замена на другие ос

татков в функционировании ГАФД [17-19]. Так,

татки приводит к полной инактивации фермен

впервые была доказана роль остатков Arg в регу

та. Наличие высоко реакционноспособной

ляции активности ГАФД [20-22] и установлена

сульфгидрильной группы участвующего в ката

роль мягкого окисления остатка Cys150 актив

литическом акте остатака Cys150 в каждом из

ного центра в разобщении окисления и фосфо

четырех активных центров ГАФД делает этот

рилирования в гликолизе [3-5]. Использование

фермент легкодоступным для целого ряда моди

аналогов кофермента NAD позволило получить

фикаций - алкилирование, нитрозилирование,

новую информацию об особенностях его связы

окисление и другие. Мы остановимся в этом

вания с ферментом [23, 24], а анализ взаимодей

разделе только на окислении и S глутатионили

ствия ГАФД из разных источников с так называ

ровании фермента, а гликирование, затрагива

емыми «полуцентровыми реагентами» (half of

ющее в основном остатки Lys и Arg, рассмотрим

the site reagents) - выяснить новые механизмы

в заключительной части обзора.

кооперативности работы активных центров бел

Одним из наиболее важных естественных

ка [17, 25, 26]. После появления сведений о

путей ингибирования ГАФД является окисление

пространственной структуре ГАФД группой

каталитических остатков Cys150 перекисью во

Branlant с помощью сайт специфического мута

дорода. Механизм окисления ГАФД перекисью

генеза была подтверждена или уточнена инфор

водорода достаточно подробно описан, в том

мация, исходно основанная на ингибиторном

числе в наших работах. Сульфгидрильные груп

анализе [27, 28]. Завершение фундаментальных

пы (SH) остатка Cys150 активного центра после

исследований механизма функционирования

довательно окисляются с образованием сульфе

ГАФД и появление новых экспериментальных

новой, сульфиновой и сульфоновой кислот (ре

подходов привело к угасанию интереса к инги

акции 1-3 на схеме 1) [3, 29, 30].

биторному анализу, как основному подходу

При кратковременной инкубации (10-15 мин)

классической энзимологии, хотя, на наш взгляд,

в присутствии низких концентраций H₂O₂

его комбинация с молекулярным моделирова

(10-50 мкМ) происходит мягкое окисление ка

нием, рентгеноструктурным анализом и сайт

талитического остатка Cys с образованием цис

Схема 1. Окисление Cys150 активного центра ГАФД перекисью водорода

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1581

теин сульфеновой кислоты (схема 1, реакция 1).

Необходимо заметить, что в нормальных ус

Данная стадия является обратимой: цистеин

ловиях in vivo цистеин сульфеновая кислота в

сульфеновая кислота может быть восстановлена

активном центре ГАФД, скорее всего, не может

до Cys в присутствии аскорбиновой кислоты, ар

существовать длительное время, поскольку

сенита натрия или низкомолекулярных тиолов

GSH, который присутствует в клетках в высоких

[29, 31]. При более длительной инкубации с H₂O₂

концентрациях (1-5 мМ), взаимодействует с

или в присутствии более высокой концентрации

цистеин сульфеновой кислотой с образованием

окислителя образуются необратимые продукты

смешанного дисульфида [37, 38]:

окисления - цистеин сульфиновая и цистеин

сульфоновая кислоты (схема 1, реакции 2 и 3).

Cys150 SOH + GSH → Cys150 SSG + H₂O.

Следует отметить, что важной особенностью

ГАФД является присутствие двух остатков Cys в

Данная модификация носит название S глу

ее активном центре - Cys150, необходимый для

татионилирования и приводит к полной инак

катализа, и Cys154, который не участвует в ката

тивации фермента, но препятствует дальнейше

лизе. В отличие от Cys150, Cys154 экранирован в

му окислению цистеин сульфеновой кислоты с

активном центре ГАФД и становится доступен

образованием необратимых продуктов окисле

для окисления только после окисления Cys150.

ния ГАФД.

Роль Cys154 до сих пор неизвестна, хотя он яв

Однако полностью исключить возможность

ляется весьма консервативным остатком и при

необратимого окисления ГАФД все же нельзя,

сутствует у ГАФД из разных источников, за ис

поскольку концентрация GSH может снижаться

ключением ГАФД из некоторых микроорганиз

при различных патологических состояниях.

мов (например, бактерий рода Thermus) (https://

Протеомный анализ позволил выявить

www.uniprot.org/uniprot/P00361). Замена Cys154

S глутатионилированную ГАФД в растительных

на Ser не оказывает существенного влияния на

и животных тканях [39, 40]. Взаимосвязь между

активность фермента, но при этом снижает

окислением и S глутатионилированием ГАФД

чувствительность каталитического остатка

была впервые продемонстрирована в работе

Cys150 к окислению [32].

Schuppe Koistinen et al. [41]. Было показано, что

Мы предположили, что второй остаток Cys154

обработка клеток эндотелия человека перекисью

может быть необходим для предотвращения глу

водорода приводит к S глутатионилированию

бокого окисления сульфгидрильных групп ката

ГАФД и ее инактивации, в то время как деглута

литического остатка Cys150, приводящего к необ

тионилирование ГАФД сопровождается восста

ратимой инактивации фермента. Так, есть дан

новлением активности фермента. Позднее в на

ные, что в аэробных условиях in vivo между двумя

шей работе на очищенном препарате ГАФД из

цистеинами активного центра ГАФД может обра

мышц кролика была доказана взаимосвязь окис

зовываться дисульфидный мостик (реакция 4 на

ления каталитических остатков Cys150 и S глу

схеме 1) [33]. По видимому, окисление Cys150 с

татионилирования: фермент подвергался S глу

образованием цистеин сульфеновой кислоты

татионилированию при обработке перекисью

способствует образованию дисульфидного мос

водорода в присутствии GSH. При этом помимо

тика между соседними остатками Cys активного

смешанного дисульфида ГАФД SSG, среди про

центра ГАФД в соответствии с общим механиз

дуктов S глутатионилирования был зарегистри

мом окисления цистеинов в белках [34-36]. Ди

рован внутримолекулярный дисульфидный мос

сульфидный мостик в активном центре ГАФД мо

тик Cys150-Cys154. Согласно нашему предполо

жет быть восстановлен под действием дитиотреи

жению, смешанный дисульфид ГАФД SSG яв

тола или β меркаптоэтанола in vitro, а также при

ляется промежуточным продуктом реакции

участии глутаредоксина, тиоредоксина или вос

между Cys150 SOH и восстановленным глутати

становленного глутатиона (GSH) в живых систе

оном (схема 2, реакция 2), который дальше всту

мах. Совокупность этих процессов позволяет

пает в реакцию с Cys154 с образованием дисуль

предотвратить необратимую инактивацию ГАФД.

фидного мостика (схема 2, реакция 3) [38].

Схема 2. S глутатионилирование ГАФД и образование дисульфидного мостика в присутствии H₂O₂ и GSH

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1582

МУРОНЕЦ и др.

Таким образом, S глутатионилирование

ния предполагает возможность обратимого ин

приводит к обратимой инактивации ГАФД. В

гибирования гликолиза и активации пентозо

нашей работе было показано, что нефермента

фосфатного пути в ответ на окислительный

тивное деглутатионилирование ГАФД и восста

стресс. Таким образом достигается увеличение

новление ферментативной активности может

продукции кофермента NADPH, который необ

происходить в ходе реакции дисульфидного об

ходим для воспроизводства GSH при участии

мена с GSH в присутствии его избытка [38]:

глутатионредуктазы и, следовательно, для под

держания системы антиоксидантной защиты.

ГАФД SSG + GSH → ГАФД SH + GSSG.

Введение мутаций, снижающих чувствитель

ность ГАФД к окислению, приводит к устране

Кроме того, деглутатионилирование ГАФД и

нию данного регуляторного механизма. Таким

восстановление дисульфидного мостика Cys150-

образом, повышенная чувствительность ГАФД к

Cys154 может осуществляться ферментативны

окислению является необходимым элементом

ми путями при участии глутаредоксина или тио

системы антиоксидантной защиты клетки. Осо

редоксина [37, 38].

бенности S глутатионилирования ГАФД челове

Таким образом, S глутатионилирование яв

ка с заменой C156S, обнаруженные при ее

ляется обратимой модификацией, которая ини

экспрессии в культуре дрожжевых клеток, ука

циируется окислением каталитического Cys150

зывают на возможную роль Cys156 в регуляции

ГАФД и препятствует необратимому окислению

антиоксидантной защиты. Однако для проверки

фермента.

такого предположения необходимо проведение

экспериментов не только на клеточных культу

рах, но и с изолированным мутантным фермен

РОЛЬ S ГЛУТАТИОНИЛИРОВАНИЯ

том с заменой C156S. В таких прямых экспери

ГАФД В АКТИВАЦИИ

ментах можно будет точно сравнить чувстви

АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ

тельность нативной и мутантной ГАФД к окис

лению перекисью водорода и другими активны

Основную роль в защите клеток от перекиси

ми формами кислорода, оценить эффектив

водорода играют пероксиредоксины: константа

ность S глутатионилирования двух форм фер

скорости окисления SH групп пероксиредокси

мента, а также обратимость этой модификации.

нов перекисью водорода составляет ~10⁷ М^-1с^-1

[42], что на несколько порядков превышает

константу скорости окисления SH групп ГАФД

СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ

(~10 М^-1с^-1) [43]. Однако чувствительность

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРО

ГАФД к окислению перекисью водорода доста

ГЕНАЗ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ

точно высока по сравнению с большинством

SH содержащих белков. При инкубации клеток

Ингибирование ГАФД в качестве подхода

с перекисью водорода в первую очередь окисля

для снижения жизнеспособности клеток имеет

ются пероксиредоксин 2 и ГАФД [44]. По види

много ограничений. Однако в определенных

мому, окисление ГАФД начинается тогда, когда

случаях ингибирование ГАФД может эффектив

антиоксидантная система клетки не справляет

но нарушить энергоснабжение клетки в целом

ся с защитой.

или ее отдельных компонентов. Например, ин

В работе Peralta et al. [32] было исследовано

гибирование ГАФД может быть эффективным,

влияние Н₂О₂ на дрожжевые штаммы, экспрес

если клетка не обладает иными источниками

сирующие ГАФД человека дикого типа, а также

энергии, кроме гликолиза. Примером таких

ГАФД с мутацией некаталитического остатка

клеток могут быть паразитические микроорга

цистеина (Cys156 в случае ГАФД человека), ко

низмы, вызывающие сонную болезнь [45-48]

торые отличались устойчивостью к окислению

или болезнь Шагаса [49, 50]. Кроме того, инги

и, как следствие, к S глутатионилированию.

бирование ГАФД могло бы приводить к наруше

Было показано, что инкубация дрожжевых кле

нию энергоснабжения раковых клеток, основ

ток, экспрессирующих ГАФД дикого типа, с

ным источником энергии для которых является

Н₂О₂ приводила к увеличению соотношения

гликолиз. Можно также предположить, что ин

NADPH/NADP, в то время как в клетках,

гибирование ГАФД может ухудшить энерго

экспрессирующих мутантные ГАФД C156S с по

снабжение отдельных компонентов клетки, на

ниженной чувствительностью к окислению, та

рушив тем самым определенную функцию. Из

кой эффект не развивался. На основании этих

вестно, что для отдельных ферментов гликоли

исследований был сделан вывод, что обратимая

за, прежде всего, для ГАФД и 3 фосфоглицерат

инактивация ГАФД путем S глутатионилирова

киназы, катализирующей следующую реакцию,

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1583

сопряженную с синтезом АТР, характерна ком

логичная ситуация наблюдается в случае ГАФД

партментализация. Так в мышечных клетках

из гликосом T. brucei (https://www.uniprot.org/

ГАФД адсорбируется на актине, в эритроцитах -

uniprot/P22512).

на белках мембраны через «белок полосы 3», в

Начиная с 90 х гг., поиск специфических ин

ретикулоцитах - на полирибосомах, обеспечи

гибиторов ГАФД был сосредоточен на соедине

вая надежное энергоснабжение именно за счет

ниях, являющихся аналогами NAD, точнее, на

гликолиза тех функций, для которых предназна

аналогах аденозиновой части этого кофермента

чены данные типы клеток. Следовательно, ин

[54, 55]. Так, на основании данных о простран

гибирование ГАФД даже без существенного из

ственной структуре ГАФД T. brucei и других

менения содержания АТР в клетке в целом мо

представителей этой группы простейших были

жет ухудшать энергоснабжение именно тех

разработаны эффективные ингибиторы фер

функций, для которых необходим АТР, образу

мента, взаимодействующие с аденозиновым

ющийся в гликолизе [51, 52].

участком NAD связывающего домена. Найден

Следовательно, можно полагать, что в опре

ные ингибиторы связывались с ГАФД простей

деленных случаях ингибирование ГАФД может

ших с К_d = 4-16 мкМ. При этом данные ингиби

существенно снизить жизнеспособность клеток

торы не влияли на активность ГАФД человека

или, по крайней мере, затормозить их функцио

вплоть до концентрации 20-40 мкМ [45]. Менее

нирование, несмотря на сохранение других ис

успешным был поиск специфических ингиби

точников АТР (например, митохондрий). Наи

торов ГАФД среди аналогов его субстрата -

более ярким примером являются сперматозои

1,3 дифосфоглицерата [46]. Поиск таких соеди

ды млекопитающих, поступательное движение

нений интенсивно продолжается до настоящего

которых обеспечивается волнообразными дви

времени [48], причем особый интерес представ

жениями их «хвоста». Несмотря на наличие ми

ляют ингибиторы ГАФД из природных источни

тохондрий, важным источником энергии для

ков. Был проведен виртуальный скрининг баз

этого типа движений является гликолиз, осуще

природных соединений, среди которых удалось

ствляемый закрепленной вдоль «хвоста» ГАФД,

выявить 700 потенциальных ингибиторов для

связанной с другими гликолитическими фер

последующего анализа [56]. В ряде работ были

ментами. Более подробно эти примеры мы рас

также найдены эффективные ингибиторы ГАФД

смотрим ниже.

рода Trypanosoma: крассифлорон (сrassiflorone)

растительного происхождения [57], мастопаран

(mastoparan) из яда бразильских ос [58] и другие.

ИНГИБИТОРЫ ТРИПАНОСОМНЫХ

К сожалению, до сих пор не созданы лекар

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3

ственные препараты на основе ингибиторов

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ

этого фермента. Ряд исследователей предлагают

использовать ингибиторы ГАФД в сочетании с

Впервые ингибиторы ГАФД были использо

соединениями, влияющими на ферменты дру

ваны для снижения жизнеспособности патоген

гих метаболических путей, например, на трипа

ных микроорганизмов, вызывающих сонную

нотионредуктазу (trypanothione reductase) [59].

болезнь и болезнь Шагаса. Эти болезни вызыва

ют простейшие Trypanosoma cruzi (болезнь Ша

гаса) и Trypanosoma brucei (сонная болезнь).

СПЕРМОСПЕЦИФИЧНАЯ

Единственным источником энергии для удли

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3

ненной размножающейся формы Т. brucei, пара

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА

зитирующей в кровяном русле хозяина млеко

КАК ВОЗМОЖНАЯ МИШЕНЬ

питающего, является гликолиз. При этом гли

ДЛЯ ПРОТИВОЗАЧАТОЧНЫХ СРЕДСТВ

колиз протекает в специальных органеллах -

гликосомах, содержащих набор гликолитичес

Создание противозачаточных средств, кото

ких ферментов [53]. Окислительное фосфори

рые могли бы использоваться мужчинами, явля

лирование у этих форм Trypanosoma не происхо

ется актуальной и до сих пор не решенной зада

дит, поскольку митохондрии у них неактивны и

чей. Идея использовать спермоспецифичную

не содержат крист.

ГАФД (ГАФД с) в качестве мишени для проти

Было показано, что последовательности

возачаточных средств появилась 15 лет назад

ГАФД человека (https://www.uniprot.org/uniprot/

после того, как было обнаружено, что этот фер

P04406) и ГАФД из гликосом T. cruzi (https://

мент необходим для обеспечения подвижности

www.uniprot.org/uniprot/P22513) содержат 178

сперматозоидов. Более того, при отсутствии

идентичных а.о., что соответствует 53,1% иден

ГАФД с самцы мышей теряли способность к оп

тичности их последовательностей (рис. 1). Ана

лодотворению [60]. Оказалось, что, несмотря на

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1584

МУРОНЕЦ и др.

Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей ГАФД Mycobacterium tuberculosis (UniProt ID P9WN82),

Trypanosoma cruzi (UniProt ID P22513), Homo sapiens (UniProt ID P04406). Консервативные позиции отмечены звездочкой.

Консервативный пептид активного центра фермента выделен рамкой. Цистеин активного центра показан стрелкой

нормальное функционирование митохондрий,

тавляло 1,2 мкМ. К сожалению, это соединение

осуществление прямого поступательного дви

ингибировало и соматическую форму ГАФД, хо

жения сперматозоидов невозможно без АТР, об

тя и с меньшей эффективностью. Таким обра

разующегося в гликолизе в результате реакций,

зом, поиски специфических ингибиторов, нап

катализируемых спермоспецифичными фер

равленных на активный центр ГАФД с, до нас

ментами. Из этих наблюдений следовало, что

тоящего времени не увенчались успехом. Воз

ингибирование ГАФД с, закрепленной в фиб

можно, более перспективным окажется подход,

розном слое хвоста сперматозоида по всей его

основанный на поиске лигандов, связывающих

длине, могло бы обездвижить сперматозоиды,

ся вне активного центра, который мы рассмот

обеспечив противозачаточное действие. Для ре

рим далее.

шения этой задачи были выделены рекомбинант

ные формы ГАФД с [43, 61, 62], и подробно изу

чены особенности их каталитического действия

ИНГИБИРОВАНИЕ

и регуляторные характеристики [62-64]. Затем

СПЕРМОСПЕЦИФИЧНОЙ

были получены данные о пространственной

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3

структуре ГАФД с. Сначала удалось установить

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

структуру гибридных молекул тетрамера (димер

КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ

ГАФД с крысы с димером ГАФД из Escherichia

coli [65]), а затем гомотетрамера рекомбинант

В нашей работе было показано, что некото

ной ГАФД с человека [62, 66]. Основная работа

рые линии клеток меланомы, наряду с обычной

по поиску ингибиторов, избирательно действу

соматической ГАФД, содержат значительные

ющих на спермоспецифичную ГАФД, была про

(до 50% от общего содержания ГАФД) количест

ведена в группе O’Brien с помощью высокопро

ва спермоспецифичной формы фермента [68].

изводительного экспериментального скрининга

Это наблюдение хорошо согласуется с много

[66, 67]. Было обнаружено несколько ингибито

численными данными об экспрессии спермо

ров, значение IC₅₀ для лучшего из которых сос

специфичных белков в раковых клетках. Можно

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1585

предположить, что экспрессия ГАФД с в неко

Такие соединения могли бы предотвращать свя

торых типах раковых клеток участвует в измене

зывание ГАФД с другими белками (например, с

нии их энергетического обмена. Как следует из

трансферрином в случае ГАФД M. tuberculósis)

предыдущего раздела, до сих пор нет существен

или оказывать влияние на каталитическую ак

ного прогресса в поиске избирательных ингиби

тивность или регуляторные характеристики бел

торов ГАФД с. Однако разработка новых подхо

ка. Работы такого рода только начинаются, од

дов, основанных на поиске эффекторов, связы

нако последние достижения в области молеку

вающихся вне активного центра, позволяет на

лярного моделирования в сочетании с высоко

деяться на то, что такие ингибиторы будут най

производительным виртуальным и эксперимен

дены. В этом случае их использование поможет

тальным скринигом дают надежду на успешное

существенно снизить эффективность гликолиза

применение новых типов лигандов, избиратель

или изменить соотношение метаболических пу

но воздействующих на определенные изоформы

тей в некоторых типах раковых клеток, в кото

глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы.

рых экспрессируется ГАФД с, не затрагивая

К сожалению, ингибирования гликолиза в

энергетический обмен здоровых клеток.

микобактериях может быть недостаточно для

полного подавления энергообеспечения

M. tuberculósis, поскольку в них эффективно

ИНГИБИТОРЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО

функционирует окислительное фосфорилиро

ОБМЕНА МИКОБАКТЕРИЙ,

вание в митохондриях. Специфическое подав

ВЫЗЫВАЮЩИХ ТУБЕРКУЛЕЗ

ление митохондриального окисления может

быть проведено бедаквилином, бактерицидное

Поиск новых соединений, направленных

действие которого обусловлено специфическим

против вызывающих туберкулез микобактерий

ингибированием F₁F_О АTP синтазы в M. tuber

(Mycobactérium tuberculósis), становится все бо

culósis [70, 71], или имидазо[1,2 альфа]пириди

лее актуальной задачей в связи с устойчивостью

ном, бактерицидное действие которого основа

микобактерий к известным антибиотикам. Од

но на ингибировании дыхательного комплекса

ной из мишеней для новых лекарственных пре

bc1 [72]. Однако действия этих соединений не

паратов могла бы стать глицеральдегид 3 фос

всегда достаточно для подавления жизнедея

фатдегидрогеназа микобактерий, которая не

тельности микобактерий - медленное действие,

только катализирует важнейшую гликолитичес

возникновение устойчивости, экспрессия ци

кую реакцию, но и участвует в транспорте желе

тохрома bd и др. факторы, включающие функ

за, взаимодействуя с трансферрином

[69].

ционирование гликолитического пути [73, 74].

Boradia et al. предположили существование до

Мы полагаем, что на основе совместного ис

полнительного пути получения железа, который

пользования специфических ингибиторов

включает интернализацию трансферрина с по

ГАФД и окислительного фосфорилирования,

мощью ГАФД, присутствующей на поверхности

полностью подавляющих два основных пути

клеток микобактерий. Вероятно, соединения,

энергоснабжения, может быть создан новый

влияющие на активность и другие функции

класс лекарственных препаратов против мико

ГАФД, могли бы снижать жизнеспособность

бактерий, вызывающих туберкулез.

микобактерий. Однако ГАФД из M. tuberculósis

(https://www.uniprot.org/uniprot/P9WN82) имеет

до 49,6% идентичности с ферментом человека,

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ

согласно выравниванию их аминокислотных

ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3

последовательностей, причем структура их ак

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

тивных центров практически не отличается

НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ

(рис. 1).

И ГЛИКИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

Следовательно, поиск соединений, избира

тельно взаимодействующих с активным или ко

В заключительном разделе мы хотели бы

фермент связывающим центрами ГАФД M.

рассмотреть неожиданные последствия ингиби

tuberculósis, представляется малоэффективным,

рования глицеральдегид 3 фосфатдегидрогена

о чем свидетельствуют не слишком успешные

зы для метаболизма клеток. Если снижение эф

примеры использования ингибиторов ГАФД для

фективности гликолиза при ингибировании или

подавления жизнеспособности сперматозоидов

инактивации ГАФД достаточно очевидно, то из

и трипаносом.

менения в протекании других процессов, в ко

Более перспективным представляется поиск

торых участвует ГАФД, не столь предсказуемы.

лигандов, взаимодействующих с участками

Как уже отмечалось выше, концентрация этого

ГАФД, расположенными вне активного центра.

фермента во всех типах клеток очень велика.

5 БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1586

МУРОНЕЦ и др.

Возможно, одной из причин высокой концент

содержится в связанной с ГАФД форме - в виде

рации ГАФД в клетке является необходимость

различных производных ГАФД (тиополуаце

нейтрализовать действие ее высоко реакцион

таль , а затем ацил фермент). В определенных

носпособного субстрата - глицеральдегид 3

условиях можно даже выделить промежуточное

фосфата. Токсическое действие глицеральде

соединение - ацил фермент [75]. Таким обра

гид 3 фосфата на белки проявляется в его спо

зом, для предотвращения токсического

собности модифицировать сульфгидрильные

действия глицеральдегид 3 фосфата должна

группы остатков Cys, аминогруппы остатков

поддерживаться высокая концентрация актив

Lys, а также гуанидиновую группу остатков Arg.

ных форм ГАФД в клетке. Очевидно, что введе

Однако в функционирующих клетках практи

ние ингибиторов ГАФД или инактивация фер

чески нет свободного глицеральдегид 3 фосфа

мента, прежде всего в результате окисления

та, который после образования из фруктозо 1,6

сульфгидрильных групп или его гликирования,

дифосфата, в основном, утилизируется ГАФД в

может приводить к накоплению глицеральде

гликолитическом пути или подвергается изоме

гид 3 фосфата и изменять соотношение мета

ризации в дигидроксиацетонфосфат (ДГАФ)

болических путей, представленных на рис. 2.

(рис. 2). Даже в том случае, когда интенсивность

Особое внимание хотелось бы обратить на

следующих после катализируемой ГАФД стадий

гликирование ГАФД, которому долгое время не

гликолиза замедляется, глицеральдегид 3 фос

уделяли должного внимания. Известно, что

фат не сохраняется в свободном состоянии, а

ГАФД может подвергаться модификации раз

Рис. 2. Схема, иллюстрирующая возможное влияние ингибирования глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы на глико

лиз и связанные с ним метаболические пути. На рис. схематически представлены основные стадии гликолиза, приводя

щие в аэробных условиях к образованию пирувата, который в дальнейшем используется в цикле Кребса, а также реакции,

в которых участвует глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа. ГАФД, содержащая в активном центре окисленную до суль

феновой кислоты сульфгидрильную группу, (ГАФД SOH) обладает ацил фосфатазной активностью и гидролизует 1,3 ди

фосфоглицерат, осуществляя тем самым «футильный путь» разобщения окисления и фосфорилирования в гликолизе.

При ингибировании ГАФД и снижении скорости гликолиза эффективность пентозофосфосфатного пути может увеличи

ваться. Гликирование ГАФД метилглиоксалем приводит к ее инактивации, повышению концентрации глицеральдегд 3

фосфата, а затем метилглиоксаля. Тонкими серыми линиями указаны неферментативные реакции (гликирование и обра

зование метилглиоксаля из глицеральдегид 3 фосфата и диоксиацетонфосфата)

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1587

личными сахарами (глюкозой, фруктозой и др.)

глиоксаль, образующийся из ДГАФ, концентра

по свободным аминогруппам а.о. в результате

ция которого во всех случаях 10× превышает

неферментативного гликозилирования (глики

концентрацию глицеральдегид 3 фосфата. Оче

рования). Гликированием принято называть

видно, что увеличение концентрации метилгли

также модификацию метилглиоксалем и сход

оксаля за счет его образования из ДГАФ будет

ными с ним соединениями, включая глицераль

происходить при ингибировании ГАФД.

дегид 3 фосфат. При этом метилглиоксаль мо

Таким образом, запущенные любым спосо

жет образовываться в результате сложного кас

бом инактивация или ингибирование фермента

када реакций из первичных продуктов гликиро

вызывают увеличение концентрации свободно

вания или синтезироваться в связанных с глико

го глицеральдегид 3 фосфата и метилглиокса

лизом метаболических путях [76]. Было показа

ля, последующую дополнительную инактива

но, что метилглиоксаль эффективно модифици

цию ГАФД и новый виток этого процесса. Сле

рует ГАФД по аминогруппам остатков Lys, что

довательно, ингибиторы ГАФД могут не только

приводит к снижению ее активности [77]. В на

обратимо уменьшать интенсивность гликолиза,

ших работах было обнаружено, что столь же вы

но и вызывать необратимую инактивацию

раженное инактивирующее воздействие оказы

ГАФД и других ферментов из за их гликирова

вает на ГАФД гликирование ее собственным

ния. Эти эффекты могут быть желательным по

субстратом - глицеральдегид 3 фосфатом [78].

следствием применения ингибиторов ГАФД в

Естественно, гликирование ГАФД глицеральде

описанных выше случаях подавления жизне

гид 3 фосфатом по остаткам Lys и Arg не может

способности паразитических микроорганизмов

происходить при обычных физиологических ус

или раковых клеток, а также снижения подвиж

ловиях. При воздействии глицеральдегид 3

ности сперматозоидов. В то же время именно

фосфата на ГАФД, прежде всего происходит его

ингибирование ГАФД может быть важной при

связывание по сульфгидрильной группе остатка

чиной появления гликированных белков, участ

Cys150 активного центра, обладающей необыч

вующих в развитии ряда патологических про

но высокой реакционной способностью из за

цессов, например, нейродегенеративных забо

изменения ее рК_a за счет микроокружения. Т.е.

леваний амилоидной природы [76].

происходит первый этап обычной реакции гли

Не менее важно учитывать влияние ингиби

колитической оксидоредукции, характерной

торов ГАФД на сопряженность окисления и

для гликолиза. Из за протекания гликолитичес

фосфорилирования в гликолизе, обнаруженную

кой реакции при высоком содержании ГАФД,

в наших работах [3-5]. Для реализации разоб

существенно превышающем концентрацию ее

щения необходимо присутствие в активном

субстрата, не остается свободного глицеральде

центре ГАФД остатка Cys150, окисленного до

гид 3 фосфата для гликирования фермента. Од

сульфеновой кислоты. Препятствием для появ

нако при ингибировании ГАФД различными ли

ления сульфеновой кислоты может быть вовле

гандами или при модификации ее сульфгид

чение сульфгидрильной группы во взаимодей

рильных групп активными формами кислорода

ствие с ингибиторами, направленными на ак

глицеральдегид 3 фосфат уже может модифи

тивный центр (каталитический, субстрат или

цировать остатки Lys и Arg фермента, вызывая

кофактор связывающие центры). В этом случае

дополнительное снижение его активности. При

не будет осуществляться ацил фосфатазная ре

этом возрастает и концентрация свободного

акция, позволяющая трансформировать 1,3 ди

глицеральдегид 3 фосфата, что усиливает эф

фосфоглицерат в 3 фосфоглицерат без участия

фективность гликирования фермента. Следует,

3 фосфоглицераткиназы и синтеза АТР (рис. 2).

однако, учитывать, что сдвиг равновесия трио

Гидролиз 1,3 дифосфоглицерата окисленной

зофосфатизомеразной реакции в сторону обра

ГАФД может приводить к ускорению образова

зования ДГАФ (константа равновесия реакции

ния пирувата при снижении продукции АТР. В

глицеральдегид 3 фосфат → ДГАФ составляет

аэробных условиях гликолиз с нулевым выхо

0,048 при 25 °С) [79] будет ограничивать накоп

дом АТР может иметь смысл, поскольку он

ление глицеральдегид 3 фосфата при ингиби

обеспечивает продукцию NADH и пирувата для

ровании фермента. Тем не менее известно, что

более эффективного окислительного фосфори

даже в этой ситуации при ингибировании ГАФД

лирования в митохондриях. Однако следует от

концентрация глицеральдегид 3 фосфата суще

метить, что сульфеновая кислота реагирует с

ственно возрастает (например, при ингибирова

восстановленным глутатионом с образованием

нии ГАФД иодацетатом - (6-7)×) и, следова

смешанного дисульфида, что приводит к инги

тельно, он может участвовать в гликировании

бированию ацил фосфатазной активности [38].

фермента [80]. Хотя, безусловно, основным гли

Следовательно, ацил фосфатазная активность

кирующим фактором, скорее всего, будет метил

ГАФД может иметь значение в том случае, когда

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1588

МУРОНЕЦ и др.

содержание восстановленного глутатиона в

быть полезны в тех случаях, когда необходимо

клетке значительно снижается.

повысить содержание NADPН и GSH. Эти со

Важнейшим метаболическим процессом,

ображения могут указывать на важную роль

связанным с гликолизом, является пентозофос

ГАФД в регуляции окислительно восстанови

фатный путь (рис. 2). Судьба глюкозо 6 фосфа

тельного статуса клеток и на необходимость

та зависит от многих факторов, основным из ко

учитывать разнообразные последствия ингиби

торых является концентрация в клетке NADP⁺.

рования ГАФД на метаболизм клеток.

При повышении концентрации NADP⁺ глюко

Безусловно, ингибирование и, тем более,

зо 6 фосфат начинает использоваться в пенто

инактивация ГАФД вызывают более серьезные

зофосфатном пути, что сопровождается образо

последствия, которые не ограничиваются влия

ванием столь необходимого клеткам NADPН.

нием на энергетический метаболизм клеток.

Однако и ингибирование гликолиза стимулиру

Прежде всего это касается появления неактив

ет использование глюкозо 6 фосфата в пенто

ных, денатурированных и агрегированных форм

зофосфатном пути, причем именно с использо

ГАФД, играющих важную роль в формировании

ванием традиционных ингибиторов гликолиза

амилоидных структур в клетке. Эти аспекты вы

он и был открыт. Следует отметить, что обрати

ходят за рамки данного обзора и подробно осве

мое окисление ГАФД, ингибирующее гликолиз,

щены в наших недавно опубликованных статьях

должно повышать интенсивность пентозофос

[9, 76].

фатного пути. Наиболее подробно этот процесс

был изучен в описанном выше примере S глута

тионилирования ГАФД. Происходящее при

Финансирование. Работа была поддержана

этом накопление NADPН, являющегося кофер

Российским научным фондом (грант № 16 14

ментом глутатионредуктазы, вызывает повыше

10027).

ние концентрации GSH, необходимого для ре

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у

активации ГАФД и последующей стимуляции

них нет конфликта интересов.

гликолиза. Очевидно, что такой механизм регу

Соблюдение этических норм. Настоящая

ляции не функционирует для необратимых ин

статья не содержит каких либо исследований с

гибиторов ГАФД. Однако не только S глутатио

использованием животных в качестве объектов,

нилирование, но и другие способы обратимого

а также экспериментов с участием людей в каче

ингибирования или инактивации ГАФД могут стве объектов исследований.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Nagradova, N.K. (1956) Mechanism of action of carnosine

for normalisation in colorectal cancer experiments? Br. J.

on glycolytic oxidation reduction combined with phospho

Cancer, 103, 1475-6.

rylation, Biochemistry (Moscow), 21, 17-25.

9. Muronetz, V.I., Barinova, K.V., Stroylova, Y.Y.,

Nagradova, N.K. (1965) The effect of histidine and other

Semenyuk, P.I., and Schmalhausen, E.V.

(2017)

chelating agents on the activity of 3 phosphoglyceralde

Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase: aggregation

hyde dehydrogenase from rabbit muscles, Biochemistry

mechanisms and impact on amyloid neurodegenerative

(Moscow), 30, 50-7.

diseases, Int. J. Biol. Macromol., 100, 55-66.

Schmalhausen, E.V., Nagradova, N.K., Boschi Muller, S.,

10. Mazzola, J.L., and Sirover, M.A. (2002) Alteration of

Branlant, G., and Muronetz, V.I. (1999) Mildly oxidized

intracellular structure and function of glyceraldehyde 3

GAPDH: the coupling of the dehydrogenase and acyl

phosphate dehydrogenase: a common phenotype of neu

phosphatase activities, FEBS Lett., 452, 219-222.

rodegenerative disorders? Neurotoxicology, 23, 603-609.

Danshina, P.V., Schmalhausen, E.V., Avetisyan, A.V., and

11. Tatton, W.G., Chalmers Redman, R.M., Elstner, M.,

Muronetz, V.I. (2001) Mildly oxidized glyceraldehyde 3

Leesch, W., Jagodzinski, F.B., Stupak, D.P.,

phosphate dehydrogenase as a possible regulator of glycol

Sugrue, M.M., and Tatton, N.A. (2000) Glyceraldehyde

ysis, IUBMB Life, 51, 309-314.

3 phosphate dehydrogenase in neurodegeneration and

Dan’shina, P.V., Schmalhausen, E.V., Arutiunov, D.Y.,

apoptosis signaling, J. Neural Transm. Suppl., 60, 77-100.

Pleten’, A.P., and Muronetz, V.I. (2003) Acceleration of

12. Cardon, J.W., and Boyer, P.D. (1982) Subunit interaction

glycolysis in the presence of the non phosphorylating and

in catalysis. Some experimental and theoretical approach

the oxidized phosphorylating glyceraldehyde 3 phosphate

es with glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,

dehydrogenases, Biochemistry (Moscow), 68, 593-600.

J. Biol. Chem., 257, 7615-7622.

Seidler, N.W. (2013) Basic biology of GAPDH, Adv. Exp.

13. Koshland, D.E. (1977) The specificity of subunit interac

Med. Biol., 985, 1-36.

tions, Biochem. Soc. Trans., 5, 605-606.

Sikand, K., Singh, J., Ebron, J.S., and Shukla, G.C. (2012)

14. Malhotra, O.P., and Bernhard, S.A. (1973) Activation of a

Housekeeping gene selection advisory: glyceraldehyde 3

covalent enzyme substrate bond by noncovalent interac

phosphate dehydrogenase (GAPDH) and β actin are tar

tion with an effector, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70,

gets of miR 644a, PLoS One, 7, e47510.

2077-2081.

Caradec, J., Sirab, N., Revaud, D., Keumeugni, C., and

15. Byers, L.D., and Koshland, D.E. (1975) The specificity of

Loric, S. (2010) Is GAPDH a relevant housekeeping gene

induced conformational changes. The case of yeast glycer

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3

ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1589

aldehyde 3 phosphate dehydrogenase, Biochemistry, 14,

dehydrogenase to an acylphosphatase by trinitroglycerin

3661-3669.

and inactivation of this activity by azide and ascorbate,

16.

Levitzki, A., and Koshland, D.E. (1976) The role of nega

Biochim. Biophys. Acta, 384, 317-330.

tive cooperativity and half of the sites reactivity in enzyme

32.

Peralta, D., Bronowska, A.K., Morgan, B., Dóka, É., Van

regulation, Curr. Top. Cell. Regul., 10, 1-40.

Laer, K., Nagy, P., Gräter, F., and Dick, T.P. (2015) A pro

17.

Nagradova, N.K., Ashmarina, L.I., Asryants, R.A.,

ton relay enhances H₂O₂ sensitivity of GAPDH to facilitate

Cherednikova, T.V., Golovina, T.O., and Muronetz, V.I.

metabolic adaptation, Nat. Chem. Biol., 11, 156-163.

(1980) Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase: the

33.

Leichert, L.I., Gehrke, F., Gudiseva, H.V, Blackwell, T.,

role of subunit interactions in enzyme functioning, Adv.

Ilbert, M., Walker, A.K., Strahler, J.R., Andrews, P.C., and

Enzyme Regul., 19, 171-204.

Jakob, U. (2008) Quantifying changes in the thiol redox

18.

Nagradova, N.K. (2001) Interdomain interactions in

proteome upon oxidative stress in vivo, Proc. Natl. Acad.

oligomeric enzymes: creation of asymmetry in homo

Sci. USA, 105, 8197-202.

oligomers and role in metabolite channeling between active

34.

Cremers, C.M., and Jakob, U. (2013) Oxidant sensing by

centers of hetero oligomers, FEBS Lett., 487, 327-332.

reversible disulfide bond formation, J. Biol. Chem., 288,

19.

Nagradova, N.K. (2001) Study of the properties of phos

26489-26496.

phorylating D glyceraldehyde 3 phosphate dehydroge

35.

Roos, G., and Messens, J. (2011) Protein sulfenic acid for

nase, Biochemistry (Moscow), 66, 1067-1076.

mation: from cellular damage to redox regulation, Free

20.

Asryants, R.A., Kuzminskaya, E.V., Tishkov, V.I.,

Radic. Biol. Med., 51, 314-326.

Douzhenkova, I.V., and Nagradova, N.K. (1989) An

36.

Rehder, D.S., and Borges, C.R. (2010) Cysteine sulfenic

examination of the role of arginine residues in the func

acid as an intermediate in disulfide bond formation and

tioning of D glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,

nonenzymatic protein folding, Biochemistry,

49,

Biochim. Biophys. Acta, 997, 159-166.

7748-7755.

21.

Levashov, P.A., Schmalhausen, E.V., Muronetz, V.I., and

37.

Bedhomme, M., Adamo, M., Marchand, C.H., Couturier, J.,

Nagradova, N.K. (1995) E. coli D glyceraldehyde 3 phos

Rouhier, N., Lemaire, S.D., Zaffagnini, M., and Trost, P.

phate dehydrogenase modified by 2,3 butanedione: mani

(2012) Glutathionylation of cytosolic glyceraldehyde 3

festation of a pairwise of non equivalence of active centers,

phosphate dehydrogenase from the model plant

Biochem. Mol. Biol. Int., 37, 991-1000.

Arabidopsis thaliana is reversed by both glutaredoxins and

22.

Nagradova, N.K., Schmalhausen, E.V., Levashov, P.A.,

thioredoxins in vitro, Biochem. J., 445, 337-347.

Asryants, R.A., and Muronetz, V.I. (1996) D glyceralde

38.

Barinova, K.V., Serebryakova, M.V., Muronetz, V.I., and

hyde 3 phosphate dehydrogenase. Properties of the

Schmalhausen, E.V. (2017) S glutathionylation of glycer

enzyme modified at arginine residues, Appl. Biochem.

aldehyde 3 phosphate dehydrogenase induces formation

Biotechnol., 61, 47-56.

of C150 C154 intrasubunit disulfide bond in the active site

23.

Nagradova, N.K., Asryants, R.A., and Ivanov, M.V. (1971)

of the enzyme, Biochim. Biophys. Acta, 1861, 3167-3177.

Interaction of 1 anilino 8 naphthalene sulfonate with

39.

Gao, X.H., Bedhomme, M., Veyel, D., Zaffagnini, M.,

yeast

glyceraldehyde 3 phosphate

dehydrogenase,

and Lemaire, S.D. (2009) Methods for analysis of protein

Experientia, 27, 1169-1170.

glutathionylation and their application to photosynthetic

24.

Nagradova, N.K., Asryants, R.A., and Ivanov, M.V (1972)

organisms, Molecular Plant, 2, 218-235.

I Anilino 8 naphthalene sulfonate as a coenzyme com

40.

Newman, S.F., Sultana, R., Perluigi, M., Coccia, R., Cai, J.,

petitive inhibitor of yeast glyceraldehyde 3 phosphate

Pierce, W.M., Klein, J.B., Turner, D.M., and Butterfield,

dehydrogenase: multiple inhibition studies, Biochim.

D.A. (2007) An increase in S glutathionylated proteins in

Biophys. Acta, 268, 622-628.

the Alzheimer’s disease inferior parietal lobule, a pro

25.

Golovina, T.O., Muronetz, V.I., and Nagradova, N.K.

teomics approach, J. Neurosci. Res., 85, 1506-1514.

(1978) Half of the sites reactivity of rat skeletal muscle D

41.

Schuppe Koistinen, I., Moldéus, P., Bergman, T., and

glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, Biochim.

Cotgreave, I.A. (1994) S thiolation of human endothelial

Biophys. Acta, 524, 15-25.

cell glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase after

26.

Muronets, V.I., Golovina, T.O., and Nagradova, N.K.

hydrogen peroxide treatment, Eur. J. Biochem., 221,

(1982) Use of immobilization for the study of glyceralde

1033-1037.

hyde 3 phosphate dehydrogenase. Immobilized dimers of

42.

Davies, M.J. (2016) Protein oxidation and peroxidation,

the enzyme, Biochemistry (Moscow), 47, 3-12.

Biochem. J., 473, 805-825.

27.

Soukri, A., Mougin, A., Corbier, C., Wonacott, A.,

43.

Elkina, Y.L., Kuravsky, M.L., El’darov, M.A., Stogov, S.V.,

Branlant, C., and Branlant, G. (1989) Role of the histidine

Muronetz, V.I., and Schmalhausen, E.V.

(2010)

176 residue in glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase

Recombinant human sperm specific glyceraldehyde 3

as probed by site directed mutagenesis, Biochemistry, 28,

phosphate dehydrogenase: structural basis for enhanced

2586-2592.

stability, Biochim. Biophys. Acta, 1804, 2207-2212.

28.

Clermont, S., Corbier, C., Mely, Y., Gerard, D., Wonacott, A.,

44.

Baty, J.W., Hampton, M.B., and Winterbourn, C.C. (2005)

and Branlant, G. (1993) Determinants of coenzyme speci

Proteomic detection of hydrogen peroxide sensitive thiol

ficity in glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase: role

proteins in Jurkat cells, Biochem. J., 389, 785-795.

of the acidic residue in the fingerprint region of the

45.

Aronov, A.M., Verlinde, C.L., Hol, W.G., and Gelb, M.H.

nucleotide binding fold, Biochemistry, 32, 10178-10184.

(1998) Selective tight binding inhibitors of trypanosomal

29.

Little, C., and O’Brien, P.J. (1969) Mechanism of peroxide

glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase via structure

inactivation of the sulphydryl enzyme glyceraldehyde 3

based drug design, J. Med. Chem., 41, 4790-4799.

phosphate dehydrogenase, Eur. J. Biochem., 10, 533-538.

46.

Ladame, S., Bardet, M., Périé, J., and Willson, M. (2001)

30.

Muronetz, V.I., Melnikova, A.K., Saso, L., and

Selective inhibition of Trypanosoma brucei GAPDH by

Schmalhausen, E.V (2018) Influence of oxidative stress on

1,3 bisphospho D glyceric acid (1,3 diPG) analogues,

catalytic and non glycolytic functions of glyceraldehyde 3

Bioorg. Med. Chem., 9, 773-783.

phosphate dehydrogenase, Curr. Med. Chem.,

47.

Callens, M., and Hannaert, V. (1995) The rational design

doi: 10.2174/0929867325666180530101057.

of trypanocidal drugs: selective inhibition of the glyceralde

31.

You, K.S., Benitez, L.V., McConachie, W.A., and Allison, W.S.

hyde 3 phosphate dehydrogenase in Trypanosomatidae,

(1975) The conversion of glyceraldehyde 3 phosphate

Ann. Trop. Med. Parasitol., 89, Suppl. 1, 23-30.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

1590

МУРОНЕЦ и др.

48.

Haanstra, J.R., Gerding, A., Dolga, A.M., Sorgdrager, F.J.H.,

O’Brien, D.A. (2004) Glyceraldehyde 3 phosphate dehy

Buist Homan, M., du Toit, F., Faber, K.N., Holzhütter, H.G.,

drogenase S, a sperm specific glycolytic enzyme, is

Szöör, B., Matthews, K.R., Snoep, J.L., Westerhoff, H.V.,

required for sperm motility and male fertility, Proc. Natl.

and Bakker, B.M. (2017) Targeting pathogen metabolism

Acad. Sci. USA, 101, 16501-16506.

without collateral damage to the host, Sci. Rep., 7, 40406.

61.

Lamson, D.R., House, A.J., Danshina, P. V, Sexton, J.Z.,

49.

Pereira, J.M., Severino, R.P., Vieira, P.C., Fernandes, J.B.,

Sanyang, K., O’Brien, D.A., Yeh, L.A., and Williams, K.P.

da Silva, M.F.G.F., Zottis, A., Andricopulo, A.D., Oliva, G.,

(2011) Recombinant human sperm specific glyceralde

and Corrêa, A.G. (2008) Anacardic acid derivatives as

hyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDHS) is expressed

inhibitors of glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase

at high yield as an active homotetramer in baculovirus

from Trypanosoma cruzi, Bioor. Med. Chem.,

16,

infected insect cells, Protein Expr. Purif., 75, 104-113.

8889-8895.

62.

Chaikuad, A., Shafqat, N., Al Mokhtar, R., Cameron, G.,

50.

Prokopczyk, I.M., Ribeiro, J.F.R., Sartori, G.R., Sesti

Clarke, A.R., Brady, R.L., Oppermann, U., Frayne, J., and

Costa, R., Silva, J.S., Freitas, R.F., Leitão, A., and

Yue, W.W. (2011) Structure and kinetic characterization of

Montanari, C.A. (2014) Integration of methods in chemin

human sperm specific glyceraldehyde 3 phosphate dehy

formatics and biocalorimetry for the design of trypanoso

drogenase, GAPDS, Biochem. J., 435, 401-409.

matid enzyme inhibitors, Fut. Med. Chem., 6, 17-33.

63.

Kuravsky, M., Barinova, K., Marakhovskaya, A., Eldarov, M.,

51.

Chu, H., Puchulu Campanella, E., Galan, J.A., Tao, W.A.,

Semenyuk, P., Muronetz, V., and Schmalhausen, E. (2014)

Low, P.S., and Hoffman, J.F. (2012) Identification of

Sperm specific glyceraldehyde 3 phosphate dehydroge

cytoskeletal elements enclosing the ATP pools that fuel

nase is stabilized by additional proline residues and an

human red blood cell membrane cation pumps, Proc. Natl.

interdomain salt bridge, Biochim. Biophys. Acta, 1844,

Acad. Sci. USA, 109, 12794-12799.

1820-1826.

52.

Муронец В.И., Наградова Н.К. (1990) Взаимодей

64.

Kuravsky, M.L., Barinova, K.V., Asryants, R.A.,

ствие глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназы со

Schmalhausen, E.V., and Muronetz, V.I. (2015) Structural

структурными элементами клеток, Успехи биологиче

basis for the NAD binding cooperativity and catalytic char

ской химии, 31, 115-131.

acteristics of sperm specific glyceraldehyde 3 phosphate

53.

Opperdoes, F.R., and Borst, P. (1977) Localization of nine gly

dehydrogenase, Biochimie, 115, 28-34.

colytic enzymes in a microbody like organelle in Trypanosoma

65.

Frayne, J., Taylor, A., Cameron, G., and Hadfield, A.T.

brucei: the glycosome, FEBS Lett., 80, 360-364.

(2009) Structure of insoluble rat sperm glyceraldehyde 3

54.

Van Calenbergh, S., Verlinde, C.L., Soenens, J., De Bruyn, A.,

phosphate dehydrogenase (GAPDH) via heterotetramer

Callens, M., Blaton, N.M., Peeters, O.M., Herdewijn, P.,

formation with Escherichia coli GAPDH reveals target for

Rozenski, J., and Hol, W.G.J. (1995) Synthesis and struc

contraceptive design, J. Biol. Chem., 284, 22703-22712.

ture activity relationships of analogs of 2’ deoxy 2’ (3

66.

Dan’shina, P.V., Qu, W., Temple, B.R., Rojas, R.J.,

methoxybenzamido)adenosine, a selective inhibitor of try

Miley, M.J., Machius, M., Betts, L., and O’Brien, D.A.

panosomal glycosomal glyceraldehyde 3 phosphate dehy

(2016) Structural analyses to identify selective inhibitors of

drogenase, J. Med. Chem., 38, 3838-3849.

glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase S, a sperm spe

55.

Link, A., Heidler, P., Kaiser, M., and Brun, R. (2009)

cific glycolytic enzyme, Mol. Hum. Reprod., 22, 410-426.

Synthesis of a series of N6 substituted adenosines with

67.

Sexton, J.Z., Danshina, P.V., Lamson, D.R., Hughes, M.,

activity against trypanosomatid parasites, Eur. J. Med.

House, A.J., Yeh, L.A., O’Brien, D.A., and Williams, K.P.

Chem., 44, 3665-3671.

(2011) Development and implementation of a high

56.

Herrmann, F.C., Lenz, M., Jose, J., Kaiser, M., Brun, R.,

throughput screen for the human sperm specific isoform of

and Schmidt, T.J. (2015) In Silico Identification and in vitro

glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDHS),

activity of novel natural inhibitors of Trypanosoma brucei

Curr. Chem. Genomics, 5, 30-41.

glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, Molecules,

68.

Sevostyanova, I.A., Kulikova, K.V., Kuravsky, M.L.,

20, 16154-16169.

Schmalhausen, E.V., and Muronetz, V.I. (2012) Sperm

57.

Uliassi, E., Fiorani, G., Krauth Siegel, R.L., Bergamini, C.,

specific glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase is

Fato, R., Bianchini, G., Carlos Menéndez, J., Molina, M.T.,

expressed in melanoma cells, Biochem. Biophys. Res.

López Montero, E., Falchi, F., Cavalli, A., Gul, S.,

Commun., 427, 649-653.

Kuzikov, M., Ellinger, B., Witt, G., Moraes, C.B., Freitas

69.

Boradia, V.M., Malhotra, H., Thakkar, J.S., Tillu, V.A.,

Junior, L.H., Borsari, C., Costi, M.P., and Bolognesi, M.L.

Vuppala, B., Patil, P., Sheokand, N., Sharma, P.,

(2017) Crassiflorone derivatives that inhibit Trypanosoma

Chauhan, A.S., Raje, M., and Raje, C.I.

(2014)

brucei glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase

Mycobacterium tuberculosis acquires iron by cell surface

(TbGAPDH) and Trypanosoma cruzi trypanothione

sequestration and internalization of human holo transfer

reductase (TcTR) and display trypanocidal activity, Eur. J.

rin, Nat. Commun., 5, 4730.

Med. Chem., 141, 138-148.

70.

Andries, K., Verhasselt, P., Guillemont, J., Göhlmann, H.W.H.,

58.

Vinhote, J.F.C., Lima, D.B., Menezes, R.R.P.P.B.,

Neefs, J. M., Winkler, H., Van Gestel, J., Timmerman, P.,

Mello, C.P., de Souza, B.M., Havt, A., Palma, M.S.,

Zhu, M., Lee, E., Williams, P., de Chaffoy, D., Huitric, E.,

Santos, R.P.D., Albuquerque, E.L., Freire, V.N., and

Hoffner, S., Cambau, E., Truffot Pernot, C., Lounis, N.,

Martins, A.M.C.

(2017) Trypanocidal activity of

and Jarlier, V. (2005) A diarylquinoline drug active on the

mastoparan from Polybia paulista wasp venom by interac

ATP synthase of Mycobacterium tuberculosis, Science, 307,

tion with TcGAPDH, Toxicon, 137, 168-172.

223-227.

59.

Belluti, F., Uliassi, E., Veronesi, G., Bergamini, C., Kaiser, M.,

71.

Koul, A., Vranckx, L., Dendouga, N., Balemans, W., Van

Brun, R., Viola, A., Fato, R., Michels, P.A., Krauth

den Wyngaert, I., Vergauwen, K., Göhlmann, H.W.,

Siegel, R.L., Cavalli, A., and Bolognesi, M.L.

(2014)

Willebrords, R., Poncelet, A., Guillemont, J., Bald, D.,

Toward the development of dual targeted glyceraldehyde

and Andries, K. (2008) Diarylquinolines are bactericidal

3 phosphate dehydrogenase/trypanothione reductase

for dormant mycobacteria as a result of disturbed ATP

inhibitors against Trypanosoma brucei and Trypanosoma

homeostasis, J. Biol. Chem., 283, 25273-25280.

cruzi, ChemMedChem, 9, 371-382.

72.

Pethe, K., Bifani, P., Jang, J., Kang, S., Park, S., et al.

60.

Miki, K., Qu, W., Goulding, E.H., Willis, W.D., Bunch,

(2013) Discovery of Q203, a potent clinical candidate for

D.O., Strader, L.F., Perreault, S.D., Eddy, E.M., and

the treatment of tuberculosis, Nat. Med., 19, 1157-1160.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019

ИНГИБИТОРЫ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД 3 ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

1591

73. Forte, E., Borisov, V.B., Falabella, M., Colaço, H.G.,

glycolysis, and neurodegenerative diseases: is there any

Tinajero Trejo, M., Poole, R.K., Vicente, J.B., Sarti, P.,

connection? Biochemistry (Moscow), 82, 874-886.

and Giuffrè, A. (2016) The terminal oxidase cytochrome

77. Lee, H.J., Howell, S.K., Sanford, R.J., and Beisswenger, P.J.

bd promotes sulfide resistant bacterial respiration and

(2005) Methylglyoxal can modify GAPDH activity and

growth, Sci. Rep., 6, 23788.

structure, Ann. NY Acad. Sci., 1043, 135-145.

74. Forte, E., Borisov, V.B., Vicente, J.B., and Giuffrè, A.

78. Muronetz, V., Barinova, K., and Schmalhausen, E. (2017)

(2017) Cytochrome bd and gaseous ligands in bacterial

Glycation of glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase

physiology, Adv. Microb. Physiol., 71, 171-234.

in the presence of glucose and glyceraldehyde 3 phos

75. Malhotra, O.P., and Bernhard, S.A. (1981) Role of nicotin

phate, J. Int. Soc. Antioxid., 2, 1-4.

amide adenine dinucleotide as an effector in formation and

79. Cornish Bowden, A. (1981) Thermodynamic aspects of

reactions of acylglyceraldehyde 3 phosphate dehydroge

glycolysis, Biochem. Educ., 9, 133-137.

nase, Biochemistry, 20, 5529-5538.

80. Veech, R.L., Raijman, L., Dalziel, K., and Krebs, H.A.

76. Muronetz, V.I., Melnikova, A.K., Seferbekova, Z.N.,

(1969) Disequilibrium in the triose phosphate isomerase

Barinova, K.V., and Schmalhausen, E.V. (2017) Glycation,

system in rat liver, Biochem. J., 115, 837-842.

INHIBITORS OF GLYCERALDEHYDE 3 PHOSPHATE DEHYDROGENASE

AND UNEXPECTED EFFECTS OF ITS REDUCED ACTIVITY

Review

V. I. Muronetz^1,2*^,**, A. K. Melnikova²**, K. V. Barinova¹, and E. V. Schmalhausen¹**

¹ Belozersky Institute of Physico Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University,

119234 Moscow, Russia; E mail: vimuronets@belozersky.msu.ru

² Lomonosov Moscow State University, Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, 119234 Moscow, Russia

Received June 11, 2019

Revised August 11, 2019

Accepted August 14, 2019

The review describes the use of glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) inhibitors to study the enzyme

and suppress its activity in various cell types. The main problem of specific inhibition of GAPDH is the highly con

servative nature of the enzyme active center and especially of the microenvironment of Cys150 sulfhydryl group that

is important for catalysis. Numerous attempts to find inhibitors of sperm specific GAPDH, as well as GAPDH of try

panosomes (Trypanosoma sp.) and mycobacteria (Mycobacterium tuberculosis), which would not significantly inhibit

the enzyme of mammalian somatic cells, did not lead to practically important results. The search for compounds

aimed at less conservative sites, located outside of the active site of GAPDH, and affecting catalytic and regulatory

properties of the enzyme seems promising. Separate sections of the review are devoted to the inactivation of the

enzyme by reactive oxygen species, glutathione, and glycating compounds. The final section discusses the effects of

inhibition as well as inactivation of GAPDH (oxidation, S glutathionylation and glycation) on glycolysis and related

metabolic pathways (pentose phosphate pathway, “futile” cycle of glycolytic oxidation and phosphorylation uncou

pling).

Keywords: glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, enzymatic inhibitors, oxidation, sulfhydryl group, glycation,

glycolysis

БИОХИМИЯ том 84 вып. 11 2019