БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 12, с. 1867 - 1875

УДК 577.322.9

GPI МОДИФИЦИРУЕМЫЕ БЕЛКИ,

НЕКОВАЛЕНТНО ЗАКРЕПЛЕННЫЕ В КЛЕТОЧНОЙ

СТЕНКЕ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae

В.В. Рекстина¹, А.А. Быкова¹, Р.Х. Зиганшин², Т.С. Калебина¹*

¹ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

биологический факультет, 119991 Москва, Россия; электронная почта: kalebina@gmail.com

² Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 20.03.2019

После доработки 05.08.2019

Принята к публикации 06.08.2019

GPI белки клеточной стенки дрожжей лишены липидной части якоря и с помощью остатков маннозы ко

валентно присоединены к высокомолекулярным полисахаридам глюкану и/или хитину. Они выполняют

множество функций, включая участие в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки и обес

печении устойчивости клетки к стрессовым воздействиям. В данной работе показано, что в клеточной стен

ке присутствует пул белков, относящихся к группе GPI модифицируемых, несвязанных ковалентной

связью с высокомолекулярными структурными полисахаридами, однако прочно закрепленных в клеточной

стенке. Предположено, что эти белки являются промежуточной формой в процессинге GPI белков клеточ

ной стенки, поскольку уже лишились липидной части GPI якоря и при экстракции по Фолчу не обнару

живаются во фракции липопротеинов, но еще не встроились в клеточную стенку путем присоединения ко

валентной связью к высокомолекулярным полисахаридам, поскольку экстрагируются в воду при нагрева

нии из делипидизированных клеточных стенок. Эта группа белков, о наличии которой ранее известно не

было, по видимому, может присутствовать в клеточной стенке в виде липид ассоциированных микроком

партментов. Таковыми являются обнаруженные недавно у дрожжей транспортные везикулы. Нековалентно

связанные с высокомолекулярными полисахаридами GPI модифицируемые белки обнаружены в клеточ

ной стенке как родительского штамма, так и у дрожжей, лишенных глюканозилтрансгликозилазы Bgl2, что

свидетельствует о независимом от функций данного белка пути их встраивания в клеточную стенку.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дрожжи, клеточная стенка, GPI белки, липид ассоциированный микрокомпарт

мент.

DOI: 10.1134/S0320972519120108

Клеточная стенка (КС) и плазматическая

среду [1]. КС является компартментом клетки, в

мембрана, разделенные периплазматическим

котором начинается расщепление питательных

пространством, представляют собой два важ

субстратов [2, 3]. Было показано, что КС весьма

нейших компартмента клетки дрожжей, форми

динамична: перестройками в ее молекулярной

рующих в совокупности их клеточную оболочку.

структуре сопровождаются такие процессы, как

За последнее десятилетие активные исследова

флокуляция, спаривание и переход к псевдоги

ния выявили роль КС как наружного скелета

фальному росту [4]. Известно, что как единый

дрожжей, от которого зависит поддержание

молекулярный ансамбль, клеточная стенка фор

формы клетки и ее устойчивость к внешним

мируется за пределами цитоплазматической

воздействиям, а также как физиологически ак

мембраны [5-7]. Клетка располагает большим

тивной органеллы, в которой закрепляются ре

количеством обходных путей, позволяющих

цепторы, воспринимающие сигналы из внеш

компенсировать как незначительные, так и

ней среды, и антигены, определяющие иммуно

весьма существенные нарушения в биосинтезе и

логические свойства микроорганизма. Кроме

встраивании ее компонентов [2, 8]. Без деталь

того, недавно были опубликованы данные о

ного изучения участников, путей и механизмов

том, что в КС дрожжей могут присутствовать ве

регуляции процесса сборки клеточной стенки

зикулы, вероятно, участвующие в процессе

дрожжей, формирования и функционирования

транспорта различных соединений, в первую

ее молекулярного ансамбля невозможно уста

очередь, белков из цитоплазмы во внешнюю

новление молекулярного строения и изучения

биогенеза динамичного, многокомпонентного и

* Адресат для корреспонденции.

полифункционального компартмента клетки

1867

1868

РЕКСТИНА и др.

дрожжей Saccharomyces cerevisiae - клеточной

ренный маннопротеин, который может быть ас

стенки. В настоящее время эти вопросы далеки

социирован с транслирующими рибосомами и

от разрешения.

способен влиять на секрецию белков (в т.ч. Bgl2)

КС целиком покрывает дрожжевую клетку и,

[17], Ecm33 - GPI заякоренный белок, вовле

в основном, состоит из белков маннопротеинов

ченный в TORC1 сигналинг, а также необходи

(~40%), глюкана (~50%) и хитина (~5%). Счита

мый для сборки КС [18, 19], и некоторые другие,

ется, что полисахариды КС дрожжей связаны

например, хитинтрансгликозилазы Crh1 и Crh2,

ковалентными связями в единую сеть.

необходимые для присоединения хитина к β

Белки маннопротеины, ответственные за

1,3 и β 1,6 глюкану [20].

осуществление клеточной стенкой перечислен

Ковалентная связь с полисахаридами клеточ

ных выше функций, в настоящее время принято

ной стенки делает эти белки маломобильными.

делить на три группы [5, 6]: 1) группа SE белков

Столь прочное их закрепление в полисахарид

(SDS еxtractable proteins), которые могут быть

ном каркасе не оставляет возможности этим бел

экстрагированы из клеточных стенок детерген

кам для латерального перемещения по КС, а в

тами и тиоловыми реагентами при нагревании;

случае наличия у них ферментативной активнос

в большинстве - это ферменты, которые не свя

ти оставляет открытым вопрос о возможности ее

заны ковалентной связью с высокополимерны

регуляции клеткой. В то же время строгая регу

ми полисахаридами клеточной стенки и могут

ляция активности таких ферментов, как глюка

быть соединены дисульфидными связями с мо

нозилтрансгликозилазы, входящих в состав этой

лекулами маннопротеинов других групп; 2) глю

группы, представляется жизненно необходимой

каназо экстрагируемые GPI заякоренные бел

для клетки. Эти ферменты располагаются в не

ки (glycosylphosphatidylinositol anchored pro

посредственном окружении своего субстрата -

teins). Общий план строения этих белков в раз

глюкана, а основной их функцией является пе

личных организмах одинаков. Однако на пове

рестройка этого мажорного структурного поли

рхности клеток дрожжей присутствуют два типа

сахарида КС в процессе роста и деления клетки.

GPI заякоренных белков. Первые локализуют

Их бесконтрольная активность с неизбежностью

ся в плазматической мембране и содержат ли

должна приводить к лизису клетки.

пидный компонент [9]. Вторые присутствуют в

За встраивание GPI белков в КС могут отве

КС, они лишены липидного компонента в ре

чать другие глюканозилтрансгликозилазы, нап

зультате процессинга и закреплены в КС с по

ример, SE белок Bgl2. Делеция гена, кодирую

мощью ковалентной связи через остатки манно

щего данную глюканозилтрансгликозилазу,

зы с фрагментом β 1,6 глюкана и далее с высо

приводит к нарушению встраивания GPI бел

кополимерным β 1,3 глюканом и/или хитином.

ков в КС и отсутствию ряда из них в глюканазо

Эти белки могут быть выделены из клеточной

экстрагируемой фракции белков КС [21]. Инте

стенки с помощью глюканаз после того, как из

ресно отметить, что подобное нарушение не вы

КС будут удалены SE белки [10]; 3) ASL белки

зывает значительных изменений в скорости

(proteins with alkali soluble linkage) могут быть

роста дрожжей в относительно стабильных ус

выделены из клеточной стенки при действии

ловиях эксперимента, проводимого в стандарт

щелочи после удаления SE белков. Ковалентно

ных лабораторных условиях выращивания

закрепленные ASL белки КС часто характери

дрожжей. Значительным снижением скорости

зуются наличием внутренних повторов, высо

роста дрожжи, лишенные Bgl2, характеризуются

ким содержанием О связанных маннозных це

только в условиях выращивания при повышен

пей [11] и отсутствием GPI якоря. Показано,

ной температуре или высушивании, что может

что ASL белки образуют щелочно лабильные

быть следствием отсутствия в КС самого белка

сложноэфирные связи между γ карбоксиль

Bgl2 [22], а не нарушениями во встраивании им

ными группами глутаминовых кислот и гидрок

других белков. Известно, что Bgl2 является ма

сильными группами глюкозы цепей β 1,3 глю

жорным и конститутивным белком КС, облада

кана. Такая реакция может осуществляться на

ющим амилоидными свойствами [23, 24], и, сог

клеточной поверхности [12].

ласно данным литературы, может рассматри

В группу глюканазо экстрагируемых GPI

ваться как самостоятельный кандидат на выпол

белков КС входят такие важные в функциональ

нение протекторных функций при высушива

ном отношении белки, как глюканозилтранс

нии и нагреве клеток.

гликозилазы, α агглютинин альфа клеток [3,

Сказанное позволило нам предположить,

13], Cwp1 - маннопротеин КС, локализован

что описанный способ ковалентного встраива

ный в дочерних «шрамах» [3, 14, 15], Tir1 - бе

ния GPI белков в полисахаридный каркас КС

лок холодового шока [2, 16], Sed1 - мажорный

не является единственно возможным. Учитывая

стресс индуцируемый структурный GPI заяко

опубликованные недавно данные о том, что в

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

GPI БЕЛКИ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ ДРОЖЖЕЙ

1869

КС дрожжей могут присутствовать липидные

шении 0,7 : 1 (по объему) и осаждали центрифу

компартменты, например, обнаруженные не

гированием. Эту процедуру повторяли три раза.

давно везикулы или иные, но в данный момент

Полученный препарат КС трижды промывали

еще неохарактеризованные [1], было высказано

водой. Количество КС оценивали по оптичес

предположение, что указанные белки могут

кой плотности при 540 нм. На следующем этапе

присутствовать в КС в виде липид ассоцииро

КС промывали раствором 0,1 М Тris (в соотно

ванных микрокомпартментов, например, как

шении 1 о.е. суспензии КС на 10 μl 0,1 М Тris)

содержимое везикул. Данная статья посвящена

2 раза по 1,5 ч и 3 раза Milli Q H₂O, после чего

проверке высказанного предположения и выяв

КС инкубировали 2 ч в 6 М гуанидингидрохло

лению закрепленных нековалентно на высоко

риде рН 5,6 (в соотношении 1 о.е. суспензии КС

молекулярных полисахаридах КС липид ассо

на 10 μl 6 М гуанидингидрохлорида) при 30 °С.

циированных GPI белков.

Процедуру проводили при качании 200 об/мин,

после чего дважды центрифугировали в течение

5 мин при 12 000g на центрифуге Minispin

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

(«Eppendorf»).

Экстракцию липидов и липопротеинов прово

Штаммы дрожжей и условия их выращивания.

дили по Фолчу [25] c модификациями и последую

В данной работе были использованы штаммы

щей экстракцией белков из КС в горячую воду.

дрожжей Saccharomyces cerevisiae: BY4742 Matα;

КС 8 раз промывали Milli Q H₂O, центрифуги

his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0 («Invitrogen»,

ровали 5 мин при 12 000 g на центрифуге Minispin.

США) (далее в работе будет обозначаться как

К осадку клеточных стенок добавляли смесь

«дикий тип» или «wt»); BY4742 с делецией гена

хлороформ : метанол в соотношении 2 : 1 (v/v)

BGL2 Matα; his3Δ1; leu2Δ0; lys2Δ0; ura3Δ0;

(к 20 о.е. КС 1 мл смеси), тщательно перемеши

bgl2::LEU2 (получен ранее методом гомологич

вали, инкубировали 1 ч при 200 об/мин и 30 °С,

ной рекомбинации [22], далее будет обозначать

затем центрифугировали при 12 000 g. КС промы

ся как «bgl2Δ»). Дрожжи выращивали в жидкой

вали водой до полного исчезновения хлороформа

среде YPD (1% ный дрожжевой экстракт, 2%

под осадком. Затем добавляли Milli Q H₂O, так

ный пептон, 2% ная глюкоза) при 30 °С и

чтобы произвести экстракцию из КС в отноше

качании 200 об/мин.

нии 1 о.е. к 10 μl при нагревании до 100 °С в тече

Выделение КС дрожжей. Клетки дрожжей,

ние 5 мин. Полученные таким способом экстрак

выращенные до поздней логарифмической фа

ты были исследованы с помощью LC MS/MS

зы (19 ч роста), пересевали в 200 мл (2% ный

анализа.

инокулят) среды и выращивали также 19 ч.

Биотинилирование белков в растворе. К полу

Осаждение клеток проводили центрифугирова

ченным экстрактам добавляли сульфо NHS LC

нием 5 мин при 1650 g при 20 °С. Осадки промы

биотин («Pierc», США) до конечной концентра

вали один раз дистиллированной водой, затем

ции 0,5 мг/мл и инкубировали 1 ч при 4°С [10].

один раз 0,05 М калий фосфатным буфером

Электрофорез белков в денатурирующих усло

рН 8,0. Разрушение клеток проводили на шей

виях. Белки анализировали в полиакриламид

кере с помощью стеклянных шариков в присут

ном геле [26]. В качестве белкового маркера ис

ствии 5 мМ PMSF и 5 мМ ЭДТА (при охлажде

пользовали набор «Thermo Scientific», США.

нии на льду). Степень разрушения клеток конт

После проведения электрофореза в денатуриру

ролировали с помощью светового микроскопа.

ющих условиях гель окрашивали Кумасси и се

Далее использовали препараты КС, содержащие

ребром по стандартным методикам.

не более 1% неразрушенных клеток. Суспензию

Вестерн блот анализ. После электрофореза

отделяли от стеклянных шариков, после чего

гель промывали в воде, затем проводили

КС центрифугировали при 2580 g 5 мин при

перенос на нитроцеллюлозную мембрану

4 °С. Полученный препарат клеточных стенок

(«Amersham Protran», 0,45 мкм) в буфере, содер

промывали один раз водой, два раза 1% ной са

жащем 100 мМ Тris НCl, 192 мМ глицина c до

харозой, два раза 1 М NaCl, два раза 1% ным

бавлением 20% ного изопропанола в течение

NaCl, один раз водой при 4 °С.

1-1,5 ч при силе тока 110 мА. После окончания

Отмывка и получение КС. Полученный пре

процедуры проводили визуализацию белков с

парат КС обрабатывали при перемешивании в

помощью антител к Bgl2 по стандартной мето

течение 1 ч при 37 °С 1% ным SDS. Далее КС

дике. Процедуру ECL проводили согласно [27] в

осаждали центрифугированием, промывали

темной комнате. В случае биотинилированных

5 раз 0,2 М натрий ацетатным буфером рН 5,6 и

образцов мембрану в течение 1 ч инкубировали

один раз водой. Затем КС в течение 15 мин ин

в буфере TBS, содержащем 0,05% ный Tween 80

кубировали со смесью бутанол : вода в соотно

(«Ferax», США), 1% ный казеин и стрептавидин

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1870

РЕКСТИНА и др.

(1 : 2000, «Sigma», США), отмывали и визуализи

ровали в буфере 100 мМ Тris НСl (pH 9,0) с

10 мМ MgCl₂, содержащем 0,692 мМ BCIP

(5 bromo 4 chloro 3′ indolylphosphate) и 0,734 мМ

NBT (nitro blue tetrazolium).

Подготовка проб для LC MS/MS анализа. К

экстрактам из КС добавляли Тris, рН 8,5, дезок

сихолат и ДТТ до конечной концентрации

0,1 M, 1% и 10 мМ, соответственно. Затем кипя

тили в течение 10 мин и охлаждали при комнат

ной температуре. Экстракты хранили при 4 °С.

Дальнейшую подготовку проб, жидкостную

хроматографию и масс спектрометрический

анализ проводили по методу [28] с некоторыми

модификациями.

Статистическая обработка данных LC

MS/MS анализа. Статистический анализ приме

няли для оценки разброса количества уникаль

ных пептидов GPI белков, выявленных в липид

ассоциированной фракции в трех биологических

повторах. Доверительный интервал был посчи

тан с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рис. 1. Выявление белков в экстракте в воду при нагреве до

100

°С делипидизированных КС штамма дрожжей

Первоначально было проведено выявление

Saccharomyces cerevisiae дикого типа. Электрофоретическое

белков в экстракте в воду при нагреве делипиди

разделение в ПААГ, окрашивание Кумасси (дорожка 1) и

нитратом серебра (дорожка 2). Вестерн блот анализ пред

зированных КС штамма дикого типа. Выбор ме

варительно биотинилированных белков экстракта с окра

тодического подхода определялся тем, что в

шиванием стрептавидином (дорожка 3) и окрашиванием

статьях, опубликованных ранее, практически

антителами к Bgl2 (дорожка 4)

единственным SE белком, закрепленным неко

валентно и экстрагируемым при нагреве в воде

до 100 °С КС, отмытых 1% ным SDS при 37 °С,

Количественная представленность опреде

является Bgl2 [23, 24]. Авторы указанных статей,

ляемых белков из делипидизированных КС

однако, не исследовали вопроса о том, влияет ли

штамма дикого типа дана на рис. 2, а. Белок

процедура делипидизации КС на изменение на

считали присутствующим во фракции в том слу

бора белков, экстрагируемых в воду при нагре

чае, если в трех повторах он был определен не

вании. Иными словами, вопрос о том, можно ли

менее чем по 10 пептидам. Все белки, выявлен

обнаружить нековалентно закрепленные на вы

ные в клеточной стенке дрожжей штамма дико

сокомолекулярных полисахаридах белки (поми

го типа, также присутствовали в клеточной

мо Bgl2) в КС после процедуры делипидизации,

стенке дрожжей штамма bgl2Δ, лишенного глю

исследован не был.

канозилтрансгликозилазы Bgl2 (рис. 2, б).

С помощью денатурирующего электрофореза

Описание белков, идентифицированных ме

с последующим окрашиванием Кумасси G 250

тодом LC MS/MS анализа, обнаруживаемых в

(рис. 1, дорожка 1) или нитратом серебра (рис. 1,

экстрактах из делипидизированных КС штам

дорожка 2) белки нам выявить не удалось. Ис

мов дикого типа и bgl2Δ в воду при нагревании,

пользование методов биотинилирования и блот

представлено в табл. 1. Видно, что все белки от

тинга со стрептавидином позволило обнаружить

носятся к группе GPI модифицируемых белков.

белки в данной фракции, однако не позволило их

В дрожжах штамма дикого типа также выявляет

идентифицировать (рис. 1, дорожка 3). Един

ся Bgl2 (рис. 2, а), который, как уже было указа

ственным белком, идентификация которого бы

но, GPI белком не является.

ла доступна, была глюканозилтрансгликозилаза

Экстракция из КС белков, относящихся к

Bgl2, поскольку этот фермент был выявлен с ис

группе GPI модифицируемых, до делипидиза

пользованием антител (рис. 1, дорожка 4). Для

ции происходит с весьма низкой эффектив

идентификации белков полученная фракция бы

ностью, и определяемое с помощью LC MS/

ла проанализирована методом LC MS/MS.

MS анализа количество уникальных пептидов

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

GPI БЕЛКИ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ ДРОЖЖЕЙ

1871

этих белков нестабильно от эксперимента к экс

гуанидингидрохлоридом перед делипидизацией

перименту (данные не приведены). Сказанное

КС была проведена для исключения, в первую

относится как к экстракции GPI модифицируе

очередь, возможности закрепления экстрагиру

мых белков из КС в воду при нагреве, так и к их

емых белков за счет их амилоидных свойств,

экстракции в гуанидингидрохлорид. Обработка

поскольку недавно в литературе появились све

Таблица 1. GPI модифицируемые белки, идентифицированные методом LC MS/MS анализа в делипидизированных

клеточных стенках штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа и bgl2Δ

Белок

Краткое описание белка

Cwp1

Маннопротеин КС. Локализован в дочерних «шрамах», присоединен к β 1,3 и β 1,6 глюкану. Штаммы дрож

жей, лишенные Cwp1, жизнеспособны, но имеют измененную морфологию КС и вакуолей, сниженную устой

чивость к росту на среде с кислым значением рН и в присутствии различных химических стрессовых агентов,

однако характеризуются повышенными способностью к формированию биопленок и термоустойчивостью, бо

лее интенсивным почкованием и отсутствием программируемой клеточной смерти

Sag1

α/Агглютинин альфа/клеток. N концевая последовательность гомологична представителям суперсемейства

иммуноглобулинов. Штаммы дрожжей, лишенные Sag1, жизнеспособны, но не способны к половому размно

жению, характеризуются измененной морфологией липидных капель, сниженными скоростью вегетативного

роста, скоростью утилизации азота, временем жизни, устойчивостью к росту в присутствии различных хими

ческих стрессовых агентов

Crh1

Хитинтрансгликозилаза. Присоединяет хитин к β 1,3 и β 1,6 глюкану. Локализуется на участках полярного

роста. Штаммы дрожжей, лишенные Crh1, жизнеспособны, характеризуются увеличенным временем жизни,

измененной морфологией вакуолей, сниженной скоростью утилизации азота. Сверхэкспрессия гена CRH1

приводит к снижению скорости вегетативного роста

Crh2

Хитинтрансгликозилаза. Присоединяет хитин к β 1,3 и β 1,6 глюкану. Локализуется в зоне почечного рубца.

Штаммы дрожжей, лишенные Crh2, жизнеспособны, характеризуются сниженной устойчивостью к росту в

присутствии различных химических стрессовых агентов. Сверхэкспрессия гена CRH2 приводит к увеличению

скорости инвазивного роста

Gas1

β 1,3 глюканозилтрансгликозилаза семейства GAS. Показано участие в сайленсинге рДНК и регуляции клеточ

ного цикла. Штаммы дрожжей, лишенные Gas1, жизнеспособны, характеризуются измененной формой кле

ток, паттернами почкования, морфологией КС и вакуолей, повышенным содержанием хитина в КС, снижен

ными скоростью вегетативного роста, термоустойчивостью и устойчивостью к росту на среде с щелочным зна

чением рН и в присутствии различных химических стрессовых агентов. Сверхэкспрессия гена GAS1 приводит к

снижению скорости вегетативного роста

Gas3

β 1,3 глюканозилтрансгликозилаза семейства GAS. Предположительно не проявляет ферментативной активнос

ти. Штаммы дрожжей, лишенные Gas3, жизнеспособны, характеризуются измененной морфологией вакуолей

и сниженной устойчивостью к голоданию. Сверхэкспрессия гена GAS3 приводит к снижению скорости вегета

тивного роста

Gas5

β 1,3 глюканозилтрансгликозилаза семейства GAS. Штаммы дрожжей, лишенные Gas5, жизнеспособны, харак

теризуются измененной морфологией вакуолей и сниженной устойчивостью к голоданию. Сверхэкспрессия

гена GAS5 приводит к снижению скорости вегетативного роста

Ecm33

Белок с неизвестной функцией. Возможно, играет роль в апикальном росте. Штаммы дрожжей, лишенные

Ecm33, жизнеспособны, характеризуются увеличенным размером клеток, измененной морфологией вакуолей,

повышенным содержанием хитина в КС, сниженными скоростью вегетативного роста, термоустойчивостью и

устойчивостью к окислительному стрессу. Сверхэкспрессия гена ECM33 приводит к снижению скорости веге

тативного роста

Tir1

Экспрессия гена TIR1 происходит в ответ на холодовой шок и анаэробиоз. Штаммы дрожжей, лишенные Tir1,

жизнеспособны, характеризуются сниженной устойчивостью к окислительному стрессу и к росту на среде в

присутствии различных химических стрессовых агентов, сниженным уровнем программируемой клеточной

смерти в культуре. Сверхэкспрессия гена TIR1 приводит к снижению скорости вегетативного роста

Tip1

Мажорный белок КС с возможной липазной активностью. Транскрипция TIP1 индуцируется в ответ на тепло

вой и холодой шок. Штаммы дрожжей, лишенные Tip1, жизнеспособны, характеризуются сниженными ско

ростью вегетативного роста, устойчивостью к холоду и голоданию, однако характеризуются повышенной спо

собностью к формированию биопленок

Примечание. Информация для краткого описания белков взята из базы данных Saccharomyces Genome Database (https://

www.yeastgenome.org/).

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1872

РЕКСТИНА и др.

дения о том, что некоторые GPI белки, в част

ности, Gas1, способны формировать структуры

типа амилоидных [29]. В то же время Bgl2 явля

ется мажорным белком, экстрагируемым в го

рячую воду из КС как до, так и после делипиди

зации. Ни GPI модифицируемые белки, ни

Bgl2 не были нами выявлены во фракции ли

попротеинов при экстракции по методу Фолча

даже на уровне единичных пептидов.

Выявлено фосфорилирование ряда амино

кислотных остатков GPI модифицируемых бел

ков, нековалентно закрепленных на высокомо

лекулярных полисахаридах КС штаммов дикого

типа и bgl2Δ (табл. 2). Следует отметить, что

между ними наблюдаются различия, однако по

лученные результаты не во всех случаях позво

ляют однозначно утверждать о фосфорилирова

нии того или иного аминокислотного остатка в

идентифицированном пептиде. Для получения

более точного ответа необходимо продолжить

эти исследования с применением и других под

ходов для идентификации посттрансляционных

модификаций белков КС.

Рис. 2. Представленность GPI модифицируемых белков и

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

SE белка Bgl2 в экстракте в воду при нагреве до 100 °С де

липидизированных КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae

штаммов дикого типа (а) и bgl2Δ (б) (данные LC MS/MS

Данные, опубликованные в литературе, поз

анализа)

воляют сформировать новые представления о

Таблица 2. Фосфорилирование GPI модифицируемых белков из КС штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого ти

па и bgl2Δ в постлипидной фракции

Белок

Пептиды wt

Пептиды bgl2Δ

Cwp1

²⁰DSPEEFGLVSIR31

³²S

^?GSP?DLQYLSP?VYSDNGTLK49

⁸⁵EGSPESDAATGFSIK98

⁹⁹DGHLNYKSSSGFYPAIKDGSSYIFSSK124

Crh1

⁴⁵TTGCTPPDTALATSFSEDFSSSSKWFTDLK73

⁴⁵TTGCTPDTALATPSFSEDFSSSSKWFTDLK73

Gas1

⁴¹⁵YPGAYSFCTPK425

Gas3

²²³YLQCNSPLDGNKVNDDLDISK242

Gas5

⁵⁰GVDYQPGGSSNLTPDPLADASVCDRDVPVLK79

⁸⁸VYTPVDNSQDHSHCMK102

²⁰⁷QLAAEYPFNCGDEADAR222

269

²⁵⁰LYQDYSPVPVFLSEFGCNQVK

²⁵⁰LYQDYSPVPVFLSEFGCNQVK269

Примечание. Пептиды, в которых фосфорилирование встречается по трем LC MS/MS определениям, отмечены жирным

шрифтом. Пептиды, в которых фосфорилирование встречается по двум LC MS/MS определениям, отмечены обычным

шрифтом. В начале и конце каждого пептида указаны номера аминокислотных остатков последовательности

соответствующих белков. Фосфорилирование обозначено значком P после аминокислотного остатка. В случае спорного

варианта, какой из аминокислотных остатков в пептиде фосфорилируется, использован значок

^?.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

GPI БЕЛКИ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ ДРОЖЖЕЙ

1873

роли липидного компонента клеточной стенки

ность которой поддерживаются клетками в раз

в регуляции метаболической активности этой

личных, даже экстремальных условиях. Несмот

органеллы и показывают значительное взаимо

ря на достигнутые успехи, большое количество

действие клеточной стенки и плазматической

вопросов, связанных со строением клеточной

мембраны (ПМ), которые в свете исследований

стенки дрожжей, остаются невыясненными.

последних нескольких лет, включая и наши ис

В данной работе показано, что в КС дрожжей

следования, более отчетливо предстают единым

присутствуют GPI модифицируемые белки,

компартментом клетки дрожжей - клеточной

несвязанные ковалентно с высокомолекулярны

поверхностью. Так, в частности, недавно было

ми полисахаридами, формирующими структур

показано, что через клеточную стенку осущест

ный каркас КС. Они могут быть экстрагированы

вляется везикулярный транспорт [1]. Как еди

из КС в воду при нагревании после удаления

ный компартмент КС и ПМ функционируют и в

фракции липидов. О наличии этих белков, при

процессе формирования ответа клетки дрожжей

сутствующих в КС, но в форме молекул ковалент

на стресс [30]. В общем виде последователь

но связанных с высокомолекулярными полиса

ность событий в этом случае сводится к воспри

харидами остатком GPI якоря, лишенным ли

ятию сигнала, как правило, идущего из внешней

пидного компонента, известно давно.

среды (например, механическое воздействие на

Мы предполагаем, что обнаруженные нами

клетку, изменение физико химических факто

белки уже лишились липидной части GPI якоря

ров внешней среды, отсутствие питательного

в процессинге, поскольку они не выявляются с

субстрата и др.), передаче его через клеточную

помощью LC MS/MS анализа во фракции ли

стенку и периплазматическое пространство на

попротеинов, в которую должны были бы

мембрану и далее внутрь клетки и ответной ре

экстрагироваться при условии наличия у них

акции, часто сопровождающейся значительны

столь значительного липидирования. В то же

ми перестройками в КС [2]. В настоящее время

время эти белки еще не прошли процесс встраи

идет процесс активного накопления данных о

вания в полисахаридный каркас КС, поскольку

взаимодействии ПМ и КС при осуществлении

экстрагируются в горячую воду при нагревании

этих процессов. Появляются (пока еще отдель

после делипидизации. Возможность присут

ные) сведения о взаимодействии белков КС и

ствия в КС липидного компонента в виде вези

белков ядерного матрикса клетки дрожжей в

кул хорошо объясняет факт удержания в ней

процессе сайленсинга рДНК [31].

изучаемых белков: они не экстрагируются в го

Большим прогрессом на этом пути явилось

рячую воду до делипидизации и экстрагируются

обнаружение белков, ранее считавшихся внут

после делипидизации. Сказанное не исключает

риклеточными и мембранными, а недавно выяв

присутствия в КС и других липидных микро

ленными за пределами клетки в составе транс

компартментов, ранее в данной органелле не

портных везикул, экспортирующих метаболи

охарактеризованных, например, таких как ли

чески активные соединения из клетки через кле

пидные капли, в составе которых также могли

точную стенку дрожжей Candida albicans во

бы находиться обнаруженные нами липид ассо

внешнюю среду [1, 32]. Очевидно, что на одном

циированные белки.

из этапов этого транспорта везикулы являются

Это заключение нуждается в дальнейшей

составляющей КС. Гипотеза о возможном нали

проверке, однако наличие пула нековалентно

чии в КС дрожжей таких структур и предполо

связанных с высокомолекулярными полисаха

жение об их роли во взаимодействии КС и ПМ

ридами КС GPI модифицируемых белков,

ранее были высказаны исследователями неод

прочно закрепленных в клеточной стенке дрож

нократно, и одними из первых были И.С. Кула

жей S. cerevisiae, установлено в данной работе.

ев, В.М. Вагабов и А.Б. Циоменко [33, 34]. Есть

Совокупность полученных результатов позволя

и другие данные в пользу наличия в КС микро

ет отнести обнаруженный пул белков к проме

компартментов, в состав которых предположи

жуточной стадии процессинга GPI белков КС.

тельно входят Bgl2, трегалаза и инвертаза [35].

Были выявлены Bgl2 и 10 ковалентно незакреп

Накопленный фактический материал позво

ленных на высокомолекулярных полисахаридах

ляет более полно представить не только роль

КС GPI модифицируемых белков штамма ди

белков в молекулярной организации клеточной

кого типа. В везикулах C. albicans [1] также обна

стенки дрожжей, но и дополнить представления

ружены Bgl2 и GPI белки адгезин Als4 и хитина

о ее структуре. КС изменяется в зависимости от

за Cht2, которая является аналогом обнаружен

стадии и условий роста культуры, а также стадии

ных нами хитинтрансгликозилаз Crh1 и Crh2. На

клеточного цикла дрожжей. В то же время она

основании сказанного можно предположить,

является весьма стабильной структурой, общий

что ковалентно незакрепленные на высокомоле

план строения и функциональная дееспособ

кулярных полисахаридах КС GPI модифициру

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

1874

РЕКСТИНА и др.

емые белки могут являться содержимым везикул

жей дикого типа хорошо согласуется с отсут

или иных липидных микрокомпартментов. Об

ствием значимых отличий в скорости роста при

наруженные белки становятся доступными для

нормальных условиях культивирования клеток

экстракции из КС после делипидизации.

этих двух штаммов, что описано во многих ра

Следует отметить, что нековалентно связан

ботах. Вопрос о встраивании указанных белков

ные с высокомолекулярными полисахаридами

в клеточную стенку дрожжей, в том числе в ус

GPI модифицируемые белки выявлены не толь

ловиях стресса, остается открытым и требует

ко в КС родительского штамма, но и в КС дрож

дальнейшего исследования.

жей, лишенных белка Bgl2. Данный факт свиде

тельствует о том, что путь встраивания обнару

женного пула белков не зависит от функциони

Финансирование. Данная работа выполнена

рования глюканозилтрансгликозилазы Bgl2, как

при финансовой поддержке гранта РФФИ (18

это было показано ранее для ковалентно закреп

34 00915мол_а).

ленных на высокомолекулярных полисахаридах

Конфликт интересов. Авторы заявляют об от

GPI белков КС [21]. В свою очередь, обнару

сутствии конфликта интересов.

женное в данной работе отсутствие отличий в

Соблюдение этических норм. В данной работе

содержании функционально значимых GPI

не было исследований с использованием в каче

белков в КС дрожжей, лишенных Bgl2, и дрож стве объектов людей или животных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Vargas, G., Rocha, J.D., Oliveira, D.L., Albuquerque, P.C.,

11.

Loibl, M., and Strahl, S. (2013) Protein O mannosylation:

Frases, S., Santos, S.S., Nosanchuk, J.D., Gomes, A.M.,

what we have learned from baker’s yeast, Biochim. Biophys.

Medeiros, L.C., Miranda, K., Sobreira, T.J., Nakayasu, E.S.,

Acta, 1833, 2438-2446, doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.02.008.

Arigi, E.A., Casadevall, A., Guimaraes, A.J., Rodrigues, M.L.,

12.

Ecker, M., Deutzmann, R., Lehle, L., Mrsa, V., and

Freire de Lima, C.G., Almeida, I.C., and Nimrichter, L.

Tanner, W. (2006) Pir proteins of Saccharomyces cerevisiae

(2015) Compositional and immunobiological analyses of

are attached to beta 1,3 glucan by a new protein carbohy

extracellular vesicles released by Candida albicans, Cell

drate linkage, J. Biol. Chem.,

281,

11523-11529,

Microbiol., 17, 389-407, doi: 10.1111/cmi.12374.

doi: 10.1074/jbc.M600314200.

Levin, D.E. (2011) Regulation of cell wall biogenesis in

13.

Zhao, H., Shen, Z.M., Kahn, P.C., and Lipke, P.N. (2001)

Saccharomyces cerevisiae: the cell wall integrity signaling

Interaction of alpha agglutinin and a agglutinin, Saccha/

pathway, Genetics, 189, 1145-1175, doi: 10.1534/genet

romyces cerevisiae sexual cell adhesion molecules, J. Bacteriol.,

ics.111.128264.

183, 2874-2880, doi: 10.1128/JB.183.9.2874 2880.2001.

Orlean, P. (2012) Architecture and biosynthesis of the

14.

Zhang, M., Liang., Y, Zhang, X., Xu, Y., Dai, H., and

Saccharomyces cerevisiae cell wall, Genetics, 192,775-818,

Xiao, W. (2008) Deletion of yeast CWP genes enhances cell

doi: 10.1534/genetics.112.144485.

permeability to genotoxic agents, Toxicol. Sci., 103, 68-76,

Vallejo, J.A., Sánchez Pérez, A., Mart nez, J.P., and

doi: 10.1093/toxsci/kfn034.

Villa, T.G. (2013) Cell aggregations in yeasts and their

15.

Borovikova, D., Teparić, R., Mrša, V., and Rapoport, A.

applications, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97, 2305-2318,

(2016) Anhydrobiosis in yeast: cell wall mannoproteins are

doi: 10.1007/s00253 013 4735 y.

important for yeast Saccharomyces cerevisiae resistance to

Klis, F.M., Mol, P., Hellingwerf, K., and Brul, S. (2002)

dehydration, Yeast, 33, 347-353, doi: 10.1002/yea.3164.

Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae,

16.

Abe, F. (2007) Induction of DAN/TIR yeast cell wall

FEMS Microbiol. Rev., 26, 239-256, doi: 10.1111/j.1574

mannoprotein genes in response to high hydrostatic pres

6976.2002.tb00613.x.

sure and low temperature, FEBS Lett., 581, 4993-4998,

Lesage, G., and Bussey, H. (2006) Cell wall assembly in

doi: 10.1016/j.febslet.2007.09.039.

Saccharomyces cerevisiae, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70,

17.

Inokuma, K., Bamba, T., Ishii, J., Ito, Y., Hasunuma, T.,

317-343, doi: 10.1128/MMBR.00038 05.

and Kondo, A. (2016) Enhanced cell surface display and

Chaffin, W.L. (2008) Candida albicans cell wall proteins,

secretory production of cellulolytic enzymes with

Microbiol.

Mol.

Biol.

Rev.,

72,

495-544,

Saccharomyces cerevisiae Sed1 signal peptide, Biotechnol.

doi: 10.1128/MMBR.00032 07.

Bioeng., 113, 2358-2366, doi: 10.1002/bit.26008.

Kalebina, T.S., Farkas, V., Laurinavichiute, D.K.,

18.

Umekawa, M., Ujihara, M., Nakai, D., Takematsu, H.,

Gorlovoy, P.M., Fominov, G.V., Bartek, P., and Kulaev, I.S.

and Wakayama, M. (2017) Ecm33 is a novel factor involved

(2003) Deletion of BGL2 results in an increased chitin level in

in efficient glucose uptake for nutrition responsive TORC1

the cell wall of Saccharomyces cerevisiae, Antonie Van

signaling in yeast, FEBS Lett.,

591,

3721-3729,

Leeuwenhoek, 84, 179-184, doi: 10.1023/A:1026034123673.

doi: 10.1002/1873 3468.12882.

Kinoshita, T., and Fujita, M. (2016) Biosynthesis of GPI

19.

Martinez Lopez, R., Monteoliva, L., Diez Orejas, R.,

anchored proteins: special emphasis on GPI lipid remodel

Nombela, C., and Gil, C. (2004) The GPI anchored pro

ing, J. Lipid Res., 57, 6-24, doi: 10.1194/jlr.R063313.

tein CaEcm33p is required for cell wall integrity, morpho

10.

Mrsă, V., Seidl, T., Gentzsch, M., and Tanner, W. (1997)

genesis and virulence in Candida albicans, Microbiology,

Specific labelling of cell wall proteins by biotinylation.

150, 3341-3354, doi: 10.1099/mic.0.27320 0.

Identification of four covalently linked O mannosylated pro

20.

Blanco, N., Reidy, M., Arroyo, J., and Cabib, E. (2012)

teins of Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 30, 1145-1154, doi:

Crosslinks in the cell wall of budding yeast control mor

10.1002/(SICI)1097 0061(19970930)13:12<1145::AID

phogenesis at the mother bud neck, J. Cell. Sci., 125,

YEA163>3.0.CO;2 Y.

5781-5789, doi: 10.1242/jcs.110460.

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019

GPI БЕЛКИ В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ ДРОЖЖЕЙ

1875

21.

Плотникова Т.А., Селях И.О., Калебина Т.С., Кулаев И.С.

29. Ryzhova, T.A., Sopova, J.V., Zadorsky, S.P., Siniukova, V.A.,

(2006) Bgl2p и Gas1p - основные глюкантрансферазы,

Sergeeva, A.V., Galkina, S.A., Nizhnikov, A.A., Shenfeld, A.A.,

формирующие молекулярный ансамбль клеточной

Volkov, K.V., and Galkin, A.P. (2018) Screening for amy

стенки дрожжей, Докл. Акад. Наук, 409, 828-831.

loid proteins in the yeast proteome, Curr. Genet., 64,

22.

Sabirzyanov, F.A., Sabirzyanova, T.A., Rekstina, V.V.,

469-478, doi: 10.1007/s00294 017 0759 7.

Adzhubei, A.A., and Kalebina, T.S. (2018) C terminal

30. Kock, C., Arlt, H., Ungermann, C., and Heinisch, J.J.

sequence is involved in the incorporation of Bgl2p glu

(2016) Yeast cell wall integrity sensors form specific plasma

canosyltransglycosylase in the cell wall of Saccharomyces

membrane microdomains important for signaling, Cell.

cerevisiae, FEMS Yeast Res., 18, doi: 10.1093/femsyr/fox093.

Microbiol., 18, 1251-1267, doi: 10.1111/cmi.12635.

23.

Kalebina, T.S., Plotnikova, T.A., Gorkovskii, A.A.,

31. Koch, M.R., and Pillus, L. (2009) The glucanosyltrans

Selyakh, I.O., Galzitskaya, O.V., Bezsonov, E.E., et al.

ferase Gas1 functions in transcriptional silencing, Proc.

(2008) Amyloid like properties of Saccharomyces cerevisiae

Natl. Acad. Sci. USA, 106, 11224-11229, doi: 10.1073/

cell wall glucantransferase Bgl2p: prediction and experimen

pnas.0900809106.

tal evidences, Prion, 2, 91-96, doi: 10.4161/pri.2.2.6645.

32. Gil Bona, A., Lama Palacios, A., Parra, C.M., Vivanco, F.,

24.

Bezsonov, E.E., Groenning, M., Galzitskaya, O.V.,

Nombela, C., Monteoliva, L., and Gil, C. (2015) Pro

Gorkovskii, A.A., Semisotnov, G.V., Selyakh, I.O., et al. (2013)

teomics unravels extracellular vesicles as carriers of classi

Amyloidogenic peptides of yeast cell wall glucantransferase

cal cytoplasmic proteins in Candida albicans, J. Proteome

Bgl2p as a model for the investigation of its pH dependent fib

Res., 14, 142-153, doi: 10.1021/pr5007944.

ril formation, Prion, 7, 175-184, doi: 10.4161/pri.22992.

33. Tsiomenko, A.B., Plekhanov, P.G., Tuymetova, G.P., and

25.

Folch, J., Lees, M., and Sloane Stanley, G.H. (1957) A

Kononova, S.V. (1997) Secretory heat shock protein of the

simple method for the isolation and purification of total

thermotolerant yeast Hansenula polymorpha. Identification

lipides from animal tissues, J. Biol. Chem., 226, 497-509.

and comparative characteristics, Biochemistry (Moscow),

26.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins dur

62, 123-128.

ing the assembly of the head of bacteriophage, Nature, 227,

34. Tsiomenko, A.B., Ratner, E.N., Tuimetova, G.P., and

680-685, doi: 10.1038/227680a0.

Kulaev, I.S. (2000) Localization of the secretory heat

27.

Mruk, D.D., and Cheng, C.Y. (2011) Enhanced chemilu

shock protein gp280 in the cell envelope of thermotolerant

minescence (ECL) for routine immunoblotting,

yeast Hansenula polymorpha, Dokl. Biol. Sci.,

372,

Spermatogenesis, 1,121-122, doi: 10.4161/spmg.1.2.16606.

325-328.

28.

Kulak, N.A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., and

35. Basu, A., Chaudhuri, P., Malakar, D., and Ghosh, A.K.

Mann, M. (2014) Minimal, encapsulated proteomic sample

(2007) Co purification of glucanase with acid trehalase

processing applied to copy number estimation in eukaryotic

invertase aggregate in Saccharomyces cerevisiae, Biotechnol.

cells, Nat. Methods, 3, 319-324, doi: 10.1038/nmeth.2834.

Lett., 30, 299-304, doi: 10.1007/s10529 007 9535 y.

GPI MODIFIED PROTEINS NON COVALENTLY

ATTACHED TO Saccharomyces cerevisiae YEAST CELL WALL

V. V. Rekstina¹, A. A. Bykova¹, R. H. Ziganshin², and T. S. Kalebina¹*

¹ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, 119991 Moscow, Russia; E/mail: kalebina@gmail.com

² Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 117997 Moscow, Russia

Received March 20, 2019

Revised August 5, 2019

Accepted August 6, 2019

Yeast cell wall GPI proteins lack a lipid part of an anchor and are covalently attached to high molecular weight poly

saccharides glucan and/or chitin through mannose residues. They perform many functions, including participation in

the cell wall molecular ensemble formation and providing cell resistance to stress. In this work, we identified a pool of

GPI modified proteins firmly bound to the cell wall by non covalent interactions to high molecular weight structur

al polysaccharides. We believe that the detected proteins are intermediate form in the processing of GPI proteins of

the cell wall, since they have already lost the lipid part of the GPI anchor and are absent in the lipoprotein fraction

extracted according to Folch, but were not yet incorporated into the cell wall by the covalent bonding to high molecular

weight polysaccharides because they could be extracted into water from delipidized cell walls. This group of previous

ly unknown proteins might be present in the cell wall in the form of lipid associated microcompartments represented

by transport vesicles recently found in yeast. GPI modified proteins non covalently attached to high molecular weight

polysaccharides were found in the cell wall of both the parent yeast strain and strain devoid of glucanosyltransglyco

sylase Bgl2, which indicates that the pathway of their incorporation into the cell wall is independent of the functions

of this protein.

Keywords: yeast, cell wall, GPI proteins, lipid associated microcompartment

БИОХИМИЯ том 84 вып. 12 2019