БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 5, с. 706 - 717
УДК 577
СУПЕРПРОДУКЦИЯ α СИНУКЛЕИНА В КЛЕТКАХ
НЕЙРОБЛАСТОМЫ ПРИВОДИТ К НАКОПЛЕНИЮ
ТИОФЛАВИН S ПОЗИТИВНЫХ АГРЕГАТОВ
И УМЕНЬШЕНИЮ ИНТЕНСИВНОСТИ ГЛИКОЛИЗА
© 2020
А.К. Мельникова1*, Д.В. Поздышев2, К.В. Баринова2,
С.С. Кудрявцева1, В.И. Муронец1,2
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии
и биоинформатики, 119234 Москва, Россия; электронная почта: alksmelnikova@gmail.com
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико*химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119234 Москва, Россия
Поступила в редакцию 17.02.2020
После доработки 13.03.2020
Принята к публикации 25.03.2020
Важной особенностью синуклеинопатий, в том числе болезни Паркинсона, является ухудшение энергети!
ческого метаболизма пораженных клеток. Целью данной работы было изучение взаимосвязи накопления
различных форм α!синуклеина с интенсивностью гликолиза. Нами были получены стабильные клеточные
линии нейробластомы SH!SY5Y, продуцирующие α!синуклеин дикого типа и мутантный белок A53T, при!
сутствующий у больных с наследственными формами болезни Паркинсона. Было показано, что суперпро!
дукция двух типов α!синуклеина приводит к накоплению тиофлавин S!позитивных агрегатов. При этом ко!
личество агрегатов существенно выше при суперпродукции мутантной формы α!синуклеина A53T по срав!
нению с белком дикого типа. Изменения энергетического обмена, проявляющиеся в уменьшении накопле!
ния лактата и потреблении глюкозы, были обнаружены при суперпродукции двух форм α!синуклеина в ста!
бильных клеточных линиях. Кроме того, снижение интенсивности гликолиза коррелировало со снижением
активности глицеральдегид!3!фосфатдегидрогеназы (ГАФД). Проведенные с выделенными белками экспе!
рименты показали, что инактивация гликолитического фермента ГАФД происходит после его связывания с
мономерными и олигомерными формами α!синуклеина. Таким образом, было показано, что одной из при!
чин ухудшения энергетического обмена при синуклеинопатиях может быть уменьшение активности ГАФД,
индуцированное ее взаимодействием с α!синуклеином.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: α!синуклеин, глицеральдегид!3!фосфатдегидрогеназа, гликолиз, болезнь Паркин!
сона.
DOI: 10.31857/S0320972520050097
ВВЕДЕНИЕ
чения метаболизма глюкозы в нейродегенера!
тивные нарушения совсем немного. С одной
Болезнь Паркинсона - это нейродегенера!
стороны, повышенный уровень лактата был за!
тивное заболевание, характеризующееся образо!
фиксирован в мозговых тканях у больных с бо!
ванием в нервных клетках белковых агрегатов,
лезнью Паркинсона in vivo с помощью магнит!
телец Леви, преимущественно состоящих из бел!
ной резонансной спектроскопии [3], а продол!
ка α!синуклеина, а также изменениями энерге!
жительные инкубации с лактатом приводили к
тического метаболизма. В то время как многое
олигомеризации α!синуклеина в клеточной мо!
известно об ухудшении энергетического обмена
дели [4]. С другой стороны, было обнаружено,
в митохондриях и сопутствующем окислитель!
что индуцированные паракватом - веществом,
ном стрессе [1, 2], исследований на тему вовле!
вызывающим спорадические формы болезни
Паркинсона - изменения метаболизма включа!
ют снижение продукции лактата и накопление
Принятые сокращения: ГАФД - глицеральдегид!3!
фосфатдегидрогеназа; чГАФД - рекомбинантная ГАФД че! глицеральдегид!3!фосфата (Г!3!Ф), являющего!
ловека; Г!3!Ф - глицеральдегид!3!фосфат; PBS - фосфат! ся субстратом глицеральдегид!3!фосфатдегид!
но!солевой буфер, pH 7,4; α!synWT - α!синуклеин дикого
рогеназы (ГАФД) [5]. Кроме того, индукция про!
типа, α!synA53T - α!синуклеин мутантной формы A53T,
КД - круговой дихроизм, ThT - тиофлавин Т; ThS - тио!
дукции α!синуклеина дикого типа и мутанта
флавин S.
A53T с помощью аденовирусного вектора увели!
* Адресат для корреспонденции.
чивала токсичность параквата и усиливала нару!
706
НАРУШЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
707
шения метаболизма глюкозы [5]. Эти наблюде!
Университетом Катании, Италия. Клетки куль!
ния свидетельствуют о возможной роли дис!
тивировали в среде DMEM/F!12 («Панэко»,
функции ГАФД в развитии данной патологии.
Россия) с добавлением 10% эмбриональной
Важно отметить, что исходно в нейронах наибо!
бычьей сыворотки («HyClone», США) и 100×
лее активен пентозофосфатный путь метаболиз!
раствора GlutaMAX («Gibco», США), 50 ед/мл
ма глюкозы, участвующий в наработке восстано!
пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина («Па!
вительных агентов, в том числе защищающих
нэко», Россия). Клеточные культуры выращива!
клетку от окислительного стресса [6, 7]. Именно
ли в увлажненной атмосфере при 5%!ном со!
нарушения в пентозофосфатном пути считаются
держании CO2 при 37 °C и пересевали при дос!
одними из первых патологических проявлений
тижении конфлюэнтности 80-90%. В экспери!
при развитии болезни Паркинсона [8].
ментах с транзиентной трансфекцией использо!
В данной работе мы изучили зависимость из!
вали клеточную культуру до 25!го пассажа, по!
менений метаболизма глюкозы от содержания
лученные моноклональные культуры с продук!
различных форм α!синуклеина в клетке. Извест!
цией α!синуклеина использовали до 25!го пас!
но, что повышенная склонность к болезни Пар!
сажа с учетом процедур отбора.
кинсона у людей обнаруживается как в случае
Транзиентная и стабильная продукция α!си
наличия мутаций A53T, E46K, A30P, связанных с
нуклеина. Ген дикого типа α!синуклеина
аутосомно!доминантным наследованием болез!
(α*synWT) был получен, как описано ранее [19],
ни [9-11], так и в случае дупликации и трипли!
и клонирован в вектор pVax1 («Thermo Fisher»,
кации участка хромосомы, содержащего ген
США). Мутантный ген α!синуклеина А53Т
α!синуклеина дикого типа, приводящих к повы!
(α*synA53T) был получен с помощью сайт!нап!
шенной продукции белка [12, 13]. В связи с этим
равленного мутагенеза, используя Phusion site!
мы разработали клеточные модели болезни Пар!
directed mutagenesis kit («Thermo Scientific»,
кинсона на основе клеток нейробластомы SH!
США). Клетки нейробластомы SH!SY5Y были
SY5Y с повышенной продукцией α!синуклеина
трансфицированы полученными конструкция!
дикого типа (α!synWT) или мутантной формы
ми pVax!α!synWT и pVax!α!synA53T с помощью
A53T (α!synA53T), полученными методом тран!
реагента Lipofectamine 2000 («Invitrogen», США),
зиентной трансфекции, либо методом получе!
согласно протоколу производителя. Для получе!
ния клонов со стабильной экспрессией белка.
ния моноклонов со стабильной продукцией
Мы также сосредоточились на роли глико!
α!synWT и α!synA53T были переклонированы в
литического фермента ГАФД в изменении ин!
вектор pcDNA3.1Hygro(+) («Invitrogen», США).
тенсивности гликолиза при болезни Паркинсо!
Клетки были трансфицированы TransIT!LT1
на. Уменьшение гликолитической активности
(«Mirus», США), через 2 дня после трансфекции
ГАФД уже было показано для других нейродеге!
к культуральной среде добавили 200 мкг/мл гиг!
неративных заболеваний - болезни Альцгейме!
ромицина В («Invitrogen», США) и инкубирова!
ра и болезни Хантингтона [14, 15]. Иммуноци!
ли еще 10 дней. Устойчивые клетки были ис!
тохимические данные о колокализации α!си!
пользованы для получения моноклонов и про!
нуклеина и ГАФД в тельцах Леви [16], а также
тестированы на наличие вставки гена α!синук!
формирование структур, напоминающих тельца
леина методом ПЦР на матрице геномной ДНК,
Леви при одновременной продукции этих двух
выделенной с помощью TRI REAGENT
белков [17], указывают на их возможное взаимо!
(«Molecular Research Center», США).
действие. Ранее нами были получены сведения
Иммуноцитохимическое окрашивание. Клет!
о взаимодействии ГАФД с α!синуклеином, вы!
ки нейробластомы SH!SY5Y переносили на 24!
зывающим инактивацию фермента, в системе in
луночные планшеты по 15 × 104 клеток в лунку
vitro [18].
на покровные стекла диаметром
12 мм
Таким образом, в данной работе нами было
(«Menzel», Германия). Клетки окрашивали через
изучено изменение эффективности гликолиза
3-6 дней после трансфекции или, в случае ста!
при продукции в клетках разных форм α!синук!
бильной продукции α!синуклеина, на следую!
леина, а также возможная роль взаимодействий
щий день после рассадки. Клетки промывали
между ГАФД и α!синуклеином в регуляции
холодным раствором фосфатно!солевого буфе!
энергетического обмена.
ра (10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, 2,7 мМ
KCl, 137 мМ NaCl), рН 7,4 (PBS), фиксировали
в течение 20 мин 4%!ным раствором парафор!
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
мальдегида в PBS и пермеабилизовали в течение
10 мин 0,25%!ным раствором Triton Х!100. Для
Культура клеток. Клетки нейробластомы че!
блокировки неспецифического связывания
ловека SH!SY5Y были любезно предоставлены
препарат инкубировали в течение 30 мин в
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
7*
708
МЕЛЬНИКОВА и др.
1%!ном растворе БСА в PBS (блокирующий
«Определение концентрации лактата». Для рас!
раствор). Затем клетки инкубировали с первич!
чета скорости продукции лактата концентра!
ными антителами, специфичными к α!синукле!
цию лактата в пробе без добавок вычитали из
ину, разведенными в блокирующем растворе (1 : 50,
концентрации лактата в пробе с добавлением
клон syn205, «Cell Signaling Technology», США),
глюкозы и кофакторов гликолитических фер!
в течение 1 ч, тщательно отмывали в PBS и ин!
ментов и нормализовали на содержание общего
кубировали со вторичными анти!мышиными
белка в пробе и время инкубации.
антителами козы, конъюгированными с FITC
Определение активности ГАФД. Фермента!
(1
: 1000 в блокирующем растворе, «Abcam»,
тивную активность ГАФД (1.2. 1.12) определяли,
США), в течение 1 ч. После отмывки в PBS от
как было описано ранее [22]. Для измерения ак!
вторичных антител ядра клеток в течение 10 мин
тивности в клеточных лизатах в реакционную
окрашивали 1 мкг/мл DAPI («Sigma», США).
смесь добавляли пробу, содержащую 20-40 мкг
Для окрашивания тиофлавином S (ThS)
общего белка. Для измерения скорости и степе!
(«Sigma», США) клетки после пермеабилизации
ни инактивации ГАФД α!синуклеином к реак!
инкубировали в течение 20 мин с 0,05%!ным
ционной смеси добавляли аликвоты (5 мкл), со!
раствором ThS в этаноле, дважды промывали
держащие 1 мкг рекомбинантной ГАФД челове!
70%!ным этанолом и один раз PBS перед контр!
ка (чГАФД). За единицу ферментативной актив!
окрашиванием. Покровные стекла заключали
ности принимали количество мкмоль образо!
на предметных стеклах («Menzel», Германия) с
вавшегося NADH за 1 мин в расчете на 1 мг бел!
помощью заключающей среды Mowiol («Sigma»,
ка.
США), анализировали и фотографировали с по!
Измерения глюкозы и лактата. Для измерения
мощью флуоресцентного микроскопа Axiovert
поглощения глюкозы и образования лактата
200 M («Carl Zeiss», Германия) и цифровой каме!
клетки нейробластомы SH!SY5Y переносили в
ры с охлаждением CCD camera ORCAII!ERG2
24!луночные планшеты по 15×104 клеток в лун!
(«Hamamatsu Photonics», Япония).
ку. На следующий день культуральную среду за!
Измерение гликолитических параметров в
меняли на свежую, и после 4 ч инкубации отби!
клеточных лизатах. Клетки нейробластомы SH!
рали 200 мкл среды. В отобранных аликвотах и
SY5Y переносили в 6!луночные планшеты по
некондиционированной среде измеряли концен!
1 × 106 клеток в лунку и лизировали на следую!
трацию лактата и глюкозы энзиматическим ме!
щий день (в случае стабильной продукции
тодом, как описано ниже. Клетки в каждой лун!
α!синуклеина) или через 2-3 дня после транс!
ке лизировали в 50 мкл PBS с 1%!ным раство!
фекции. Клетки открепляли от подложки с по!
ром Triton Х!100, и концентрацию общего белка
мощью 0,25%!ного раствора трипсина!версена
определяли с бицинхониновой кислотой, ис!
(«Панэко», Россия). Клетки осаждали центри!
пользуя BCA Protein Assay Kit
(«Thermo
фугированием («Eppendorf», США), клеточный
Scientific», США), согласно протоколу произво!
осадок дважды промывали холодным PBS, за!
дителя.
тем ресуспендировали в PBS с добавлением
Определение концентрации лактата. Концен!
коктейля ингибиторов протеаз
(«Amresco»,
трацию лактата определяли энзиматически с
США) и обрабатывали ультразвуком («Branson
помощью реакции с лактатдегидрогеназой
Digital Sonicator», США). Клеточные обломки
(1.1.1.27), измеряя накопление NADH спектро!
отделяли центрифугированием, концентрацию
фотометрически при длине волны
340
нм
общего белка измеряли по методу Брэдфорда
(«Shimadzu», Япония), как описано ранее [21].
[20]. Каждую пробу разбавляли буфером PBS
Определение концентрации глюкозы. Концен!
для достижения одинаковой конечной концен!
трацию глюкозы определяли энзиматически,
трации общего белка. Далее каждую пробу раз!
используя набор Glucose Assay Kit («Sigma»,
деляли на две части: к первой части добавляли
США), согласно инструкции производителя.
субстрат гликолиза (10 мМ глюкозы) и смесь
Иммуноблоттинг. Для подтверждения про!
кофакторов гликолитических ферментов
дукции α!синуклеина в моноклонах со вставкой
(0,5 мМ ATP, 1 мМ ADP, 0,5 мМ NAD+,
рекомбинантного гена клетки лизировали в бу!
0,8 мМ Mg2+), ко второй части вместо указан!
фере RIPA (25 мМ Tris!HCl, pH 7,6, 150 мМ
ной смеси добавляли такой же объем раствори!
NaCl, 1%!ный NP!40, 1%!ный дезоксихолат
теля субстратов (воды). Пробы инкубировали
натрия,
0,1%!ный Ds!Na,
1
мМ PMSF)
при 25 °C и измеряли ферментативную актив!
(«Sigma», США) с добавлением коктейля инги!
ность ГАФД. Через 2 ч инкубации для останов!
биторов протеаз. Концентрацию общего белка в
ки гликолиза белки осаждали, как было описа!
растворимой части лизатов определяли спект!
но ранее [21], и определяли концентрацию лак!
рофотометрически при длине волны 280 нм и
тата энзиматически, как описано в подразделе
разбавляли до одинакового значения перед на!
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
НАРУШЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
709
несением на гель. Для детекции олигомеров
YM!100 с пределом пропускания
100
кДа
α!синуклеина в лунку наносили 3 мкг общего
(«Millipore», США) для обогащения олигомер!
белка. Ds!Na!ПААГ электрофорез в восстанав!
ной фракции. Концентрацию олигомеров опре!
ливающих условиях проводили в 16%!ном раз!
деляли либо спектрофотометрически, используя
деляющем геле (в случае клеточных лизатов)
удельный коэффициент поглощения А1%280 nm 4,12,
или 4-20%!ном градиентном разделяющем геле
либо методом с использованием бицинхонино!
(в случае олигомеров) с последующим перено!
вой кислоты (BCA Protein Assay Kit, «Thermo
сом на нитроцеллюлозную мембрану («BioRad»,
Scientific», США), согласно протоколу произво!
США) в течение 2 ч при постоянной силе тока
дителя. Для получения фибрилл раствор α!си!
150 мА. Перед окрашиванием антителами мем!
нуклеина (1 мг/мл) в PBS pH 4,0 инкубировали
брану фиксировали в 0,4%!ном растворе пара!
при
37
°C при перемешивании
600 rpm
формальдегида в PBS [23]. Мембрану блокиро!
(«Biosan», Латвия) в течение 72 ч. Образование
вали в 5%!ном растворе молока в Tris!солевом
фибрилл контролировали с помощью измене!
буфере (20 мМ Tris!HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl,
ния флуоресценции тиофлавина Т (ThT) («BMG
0,05%!ный (v/v) раствор Tween 20) и согласно
LABTECH GmbH», Германия). Для определе!
стандартной методике окрашивали мышиными
ния концентрации белка равный объем 6 М гид!
моноклональными антителами к α!синуклеину
рохлорида гуанидина добавляли к пробе фиб!
(1
:
1000, клон syn205,
«Cell Signaling
рилл, инкубировали в течение 24 ч при 25 °C, за!
Technology», США или 1 : 2000, клон LB509,
тем измеряли концентрацию белка спектрофо!
«Аbcam», США) в течение ночи при 4 °C, затем
тометрически при длине волны 280 нм.
инкубировали со вторичными антителами, конъ!
Анализ флуоресценции ThT. Для записи спект!
югированными с пероксидазой хрена (1 : 2000,
ра эмиссии флуоресценции ThT пробы, содер!
«Jackson ImmunoResearch», США) в течение 1 ч
жащие 7 мкМ белка (в расчете на мономер) и
при 25 °C и проявляли с помощью усиленной хе!
150 мкМ ThT, инкубировали в течение 10 мин
милюминесценции
(«Advansta WesternBright
при 25 °C. Спектр прописывали в диапазоне
ECL», США) на ChemiDoc XRS+ («BioRad»,
450-600 нм при длине волны возбуждающего
США).
света
435
нм на спектрофлуориметре
Выделение и анализ рекомбинантных белков.
FluoroMax!3 («Horiba Jobin Yvon», Франция).
чГАФД. Рекомбинантная ГАФД человека была
Для контроля образования фибрилл отбирали
выделена согласно ранее опубликованному про!
аликвоты 5 мкл от пробы (70 мкМ (1 мг/мл)
токолу [22]. чГАФД хранили в виде сульфат!ам!
α!синуклеина в PBS pH 4,0), добавляли к 95 мкл
монийной суспензии при 4 °C и обессоливали
25 мкМ раствора ThT и измеряли флуоресцен!
непосредственно перед экспериментом на гель!
цию на планшетном ридере CLARIOstar («BMG
фильтрационной колонке с G!50 сефарозой
LABTECH GmbH», Германия), как описано ра!
(«GE Healthcare», США). Концентрацию белка
нее [24].
определяли по методу Брэдфорда [20].
Спектроскопия кругового дихроизма (КД). Об!
α!синуклеин. Рекомбинантный α!синуклеин
разцы с концентрацией белка 70 мкМ в PBS,
человека дикого типа и мутантная форма A53T
pH 7,4 исследовали с помощью спектроскопии
были выделены по ранее описанному протоколу
КД, регистрируя спектры в диапазоне
[24]. Концентрацию белка определяли спектро!
200-240 нм при 20 °C в кюветах с длиной опти!
фотометрически, используя удельный коэффи!
ческого пути 0,1 мм на спектрометре Applied
циент поглощения А1%280 nm 4,12.
Photophysics Chirascan («Applied Photophysics»,
Получение олигомеров и фибрилл α!синуклеи*
Великобритания). Каждый представленный
на. Сульфат!аммонийную суспензию α!синук!
спектр получали усреднением 5 записей.
леина осаждали с помощью центрифугирования
Нативный электрофорез в щелочной среде.
(«Eppendorf», США) и диализовали против бу!
Пробы белка в буфере для образцов (состав 4×
фера PBS, pH 7,4 (для получения олигомеров),
буфера: 0,2 М Tris!HCl, рН 6,8; 20%!ный (v/v)
или PBS, pH 4,0 (для получения фибрилл). По!
глицерин; 0,02%!ный бромфеноловый синий),
сле диализа раствор белка центрифугировали
содержащие 10 мкг белка, наносили на 3%!ный
(«Eppendorf», США) в течение 10 мин при
концентрирующий гель (pH 6,8) и разделяли в
12 000 g для избавления от потенциальных агре!
3-15%!ном градиентном разделяющем геле
гатов. Для получения олигомеров 8-12 мг/мл
(pH 8,8) без Ds!Na. Электрофорез проводили
раствор α!синуклеина в PBS pH 7,4 инкубиро!
при максимальном напряжении 120 В в течение
вали при 37 °C в течение 20-24 ч без перемеши!
3-4 ч в охлажденном до 4 °C буфере (0,025 М
вания, далее центрифугировали в течение
Tris!HCl, 0,192 М глицин, рН 8,3).
10 мин при 12 000 g, после чего супернатант
Статистическая обработка результатов. Дан!
фильтровали через центрифужные фильтры
ные представлены либо в виде диаграммы раз!
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
710
МЕЛЬНИКОВА и др.
маха, усы которой показывают возможные вы!
клетки мы определяли активность гликолити!
бросы согласно расчету: Х1 = Q1 - k(Q3 - Q1),
ческого фермента ГАФД (рис. 1, д) и скорость
Х2 = Q3 + k(Q3 + Q1), где Х1 и Х2 - нижняя и
накопления лактата (рис. 1, е) в лизатах клеток
верхняя границы усов соответственно; Q1 и Q3 -
SH!SY5Y. В качестве отрицательного контроля
первый и третий квартили; k = 1,5. Для статис!
использовали клетки, трансфицированные пус!
тического анализа был использован програм!
тым вектором. При измерении активности
мный пакет OriginPro b9.2.196 (2015) («OriginLab
ГАФД мы предварительно подтвердили, что в
Corporation», США). Для определения наличия
отсутствие избытка субстрата ГАФД (Г!3!Ф) ак!
статически значимого отличия между выборка!
тивность не регистрируется. Мы также убеди!
ми с использованием всех полученных данных
лись, что добавление глюкозы и смеси кофакто!
был использован однофакторный дисперсион!
ров гликолитических ферментов, которые до!
ный анализ с апостериорными множественны!
бавляли для запуска гликолиза и регистрации
ми сравнениями по критерию Фишера (крите!
накопления лактата, не влияло на активность
рию наименьших значимых различий) (https://
ГАФД. Как можно видеть из рис. 1, д, актив!
ность ГАФД в лизатах статистически значимо
снижена только в случае транзиентной экс!
com/doc/Origin!Help/OneWayANOVA!Algorithm#
прессии α*synA53T, но не α*synWT. При этом
Homogeneity_of_Variance) на гомогенность дис!
скорость накопления лактата при добавлении к
персий с уровнем значимости 0,05. Нормаль!
лизатам избытка глюкозы и смеси кофакторов
ность распределения определяли с помощью
гликолитических ферментов статистически
достоверно не отличалась для разных типов
originlab.com/doc/Origin!Help/NormalityTest!
клеток.
Algorithm). В случае невозможности использо!
Отсутствие значительных изменений интен!
вания дисперсионного анализа был применен
сивности гликолиза в опытах с использованием
непараметрический U!критерий Манна-Уитни
транзиентной трансфекции могло быть связано
с тем, что только в 20-25% клеток происходила
MW!Test!Algorithm) c уровнем статистической
продукция α!синуклеина, и нетрансфициро!
значимости p = 0,05.
ванные клетки вносили основной вклад в ко!
нечный результат. Для того чтобы исключить
влияние нетрансфицированных клеток на изме!
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ряемые параметры, нами были получены ста!
бильные клеточные линии, экспрессирующие
Для оценки возможного влияния разных
α*synWT или α*synA53T, на основе транзиентно
форм α!синуклеина на интенсивность гликоли!
трансфицированных клеток с помощью метода
за нами были получены клетки нейробластомы
отбора клонов.
SH!SY5Y, транзиентно трансфицированные
Результаты оценки продукции α!синуклеина
вектором pVax, содержащим ген α!синуклеина
в различных стабильных клонах клеточной ли!
дикого типа (α*synWT) или мутантной формы
нии SH!SY5Y с помощью иммуноблоттинга
А53Т (α*synA53T), склонной к агрегации. На
представлены на рис. 2, а. Как следует из приве!
рис. 1 представлены данные по иммуноцитохи!
денных на рис. 2, а результатов, нами было по!
мическому окрашиванию транзиентно транс!
лучено несколько клонов с высокой продукцией
фицированных клеток антителами к α!синукле!
α!synWT или α!synA53T. Однако, стоит отме!
ину (рис. 1, а и в) и флуоресцентным красителем
тить, что продукция α!synWT была в среднем
ThS (рис. 1, б и г), связывающимся с амилоид!
выше, чем α!synA53T. Возможно, это связано с
ными агрегатами, имеющими вторичную струк!
высокой токсичностью a!synA53T при супер!
туру бета!листа. При окрашивании антителами
продукции для клетки, что было показано ранее
к α!синуклеину мы наблюдали диффузное ци!
[25]. Для дальнейшей работы мы выбрали клон 1,
топлазматическое окрашивание у 20-25% кле!
продуцирующий α!synWT, и клон 4, продуциру!
ток, продуцирующих α!синуклеин в результате
ющий α!synA53T (рис. 2, а), как наиболее близ!
успешной трансфекции. ThS!позитивные агре!
кие друг к другу по уровню продукции белка.
гаты при этом наблюдали только в клетках,
При использовании стабильных клеточных
трансфицированных α*synA53T, склонным к аг!
линий после окраски антителами, специфичны!
регации. Точечные скопления имели перинук!
ми к α!синуклеину, положительное окрашива!
леарную и цитоплазматическую локализацию
ние было обнаружено во всех клетках. При этом
(рис. 1, г).
происходило скопление α!синуклеина в точеч!
Для оценки влияния продукции и агрегации
ные агрегаты как в случае продукции α!synWT,
α!синуклеина на энергетические процессы
так и α!synA53T (рис. 2, б и г). Наличие внут!
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
НАРУШЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
711
Рис. 1. Образование амилоидных агрегатов и оценка гликолитических параметров в клетках нейробластомы SH!SY5Y при
транзиентной экспрессии α*synWT или α*synA53T. а-г - Иммуноцитохимическое окрашивание клеток SH!SY5Y, транс!
фицированных плазмидами pVax! α!synWT (+synWT) (а, б) или pVax! α!synA53T (+synA53T) (в, г), через 72 ч после транс!
фекции. а и в - Клетки окрашивали мышиными моноклональными антителами к α!синуклеину (α!syn) в разведении
1 : 50 (клон syn204), затем вторичными анти!мышиными антителами козы, конъюгированными с FITC (зеленый цвет), в
разведении 1 : 500. б и г - После фиксации и пермеабилизации клетки окрашивали 0,05%!ным раствором ThS в этиловом
спирте. Белые стрелки указывают на ThS!позитивные агрегаты. Полученные препараты исследовали с помощью флуорес!
центного микроскопа при 20× увеличении. Отрезок шкалы равен 20 мкм. Во всех препаратах ядра были окрашены DAPI
(синий цвет). д и е - Для определения активности ГАФД (д) и скорости накопления лактата (е) клетки лизировали через
48 ч после трансфекции pVax! α!synWT (+synWT) или pVax! α!synA53T (+synA53T), в качестве контроля были использо!
ваны клетки, трансфицированные пустым вектором pVax1 (контроль). Данные представлены в виде диаграммы размаха c
указанием точками конкретных экспериментальных значений, для определения активности ГАФД n = 7 (д) и для опреде!
ления продукции лактата n = 5 (е). * p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ с апостериорными множественны!
ми сравнениями с помощью критерия наименьших значимых различий). (С цветным вариантом рис. 1, 2, 4 и 5 можно оз!
риклеточных амилоидных агрегатов в обоих
ствующие мономерному α!синуклеину полосы.
случаях было подтверждено окрашиванием ThS
Полос, соответствующих высокомолекулярным
(рис. 2, в и д). Несмотря на повышенную про!
олигомерным формам, обнаружено не было, в
дукцию α!синуклеина во всех клетках стабиль!
том числе в нерастворимых фракциях (данные
ной линии, амилоидные агрегаты наблюдали
не приведены), однако их образование было по!
только в отдельных клетках. При этом содержа!
казано аналогичным методом в других работах
ние агрегатов было приблизительно вдвое выше
[26, 27].
в клетках, содержащих мутантную форму белка,
При измерении активности ГАФД (рис. 2, е)
согласно ручному подсчету количества агрега!
и скорости накопления лактата (рис. 2, ж) в ка!
тов на количество клеток при микроскопичес!
честве контрольных использовали лизаты не
ком исследовании. Для дальнейшего исследова!
подвергавшихся модификации клеток. Актив!
ния содержания различных форм α!синуклеина
ность ГАФД была снижена на 20% как в клетках,
в лизатах мы проанализировали лизаты, исполь!
продуцирующих α!synWT, так и в клетках, про!
зованные для измерения активности ГАФД, и
дуцирующих α!synA53T. Скорость генерации
скорости накопления лактата методом имму!
лактата в трансгенных клетках была также за!
ноблоттинга после электрофореза в денатуриру!
метно снижено (на 50-60%) относительно конт!
ющих условиях и обнаружили только соответ!
роля.
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
712
МЕЛЬНИКОВА и др.
Рис. 2. Образование амилоидных агрегатов и оценка гликолитических параметров в клетках нейробластомы SH!SY5Y при
стабильной экспрессии α*synWT или α*synA53T. а - Оценка уровня продукции α!synWT и α!synA53T в отобранных мо!
ноклонах SH!SY5Y методом иммуноблоттинга. 1-4 - Номера моноклонов. б-д - Иммуноцитохимическое окрашивание
клеток SH!SY5Y, стабильно продуцирующих α!synWT (+synWT) (б, в) или α!synA53T (+synA53T) (г, д). б, г - Клетки ок!
рашивали мышиными моноклональными антителами к α!синуклеину (α!syn) в разведении 1 : 50 (клон syn204), затем вто!
ричными анти!мышиными антителами козы, конъюгированными с FITC (зеленый цвет), в разведении 1 : 500. В белом
прямоугольнике в левом верхнем углу приведено цифровое увеличение фрагмента изображения. в, д - После фиксации и
пермеабилизации клетки окрашивали 0,05%!ным раствором ThS в этиловом спирте. Белые стрелки указывают на ThS!
позитивные агрегаты. Полученные препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа при 20× увеличе!
нии. Отрезок шкалы равен 20 мкм. Во всех препаратах ядра были окрашены DAPI (синий цвет). е, ж - Для анализа ак!
тивности ГАФД (е) и скорости накопления лактата (ж) клетки SH!SY5Y, стабильно продуцирующие α!synWT (+synWT)
или α!synA53T (+synA53T), лизировали через 48 ч после пересаживания, в качестве контроля были использованы немо!
дифицированные клетки (контроль). Данные представлены в виде диаграммы размаха c указанием точками конкретных
экспериментальных значений, для определения активности ГАФД n = 5 (д) и для определения продукции лактата n = 4.
Статистически значимое отличие от контроля с *p < 0,05 (однофакторный дисперсионный анализ с апостериорными
множественными сравнениями с помощью критерия наименьших значимых различий)
Для дополнительного подтверждения изме!
бильно экспрессирующих α!синуклеин, - гли!
нения метаболизма в клетках нейробластомы
колиз, а следовательно, и снабжение клетки
SH!SY5Y, стабильно продуцирующей α!synWT
энергией в данных случаях нарушено. Более то!
или α!synA53T, мы провели измерение скорос!
го, снижение уровня поглощения глюкозы от!
ти поглощения глюкозы и продукции лактата
носительно контроля более выражено, чем про!
непосредственно в культуральной среде и об!
дукции лактата. Затрудненная утилизация глю!
наружили снижение обоих параметров в клет!
козы может помимо нарушения гликолиза сви!
ках с повышенной продукцией α!синуклеина
детельствовать о нарушениях в захвате глюкозы
(рис. 3).
клетками или дисфункции пентозофосфатного
Полученные данные подтверждают измене!
пути, особо важного для жизнедеятельности
ния в энергетическом метаболизме клеток, ста! нервных клеток [6, 7].
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
НАРУШЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
713
Полученные результаты показывают, что су!
спектроскопии КД, иммуноблоттинга с антите!
ществует корреляция между уменьшением ин!
лами, специфичными к α!синуклеину, и натив!
тенсивности гликолиза и присутствием в иссле!
ного электрофореза (рис. 4, а-г). Формирова!
дованных клетках различных форм α!синукле!
ние фибрилл подтверждали изменением флуо!
ина, прежде всего, мономеров α!синуклеина и
ресценции ThT (данные не приведены). Затем
агрегатов, выявляемых при цитохимическом
мы протестировали взаимодействие чГАФД с
окрашивании (рис. 2, в, д). Мы предположили,
различными формами α!synWT и α!synA53T
что основной причиной уменьшения активнос!
(рис. 4, д).
ти ГАФД, а следовательно, и эффективности
Полученные нами олигомеры α!синуклеина
гликолиза в целом, может быть ее инактивация
имели в своем составе бета!структуру, что было
из!за взаимодействия с разными формами
подтверждено повышением интенсивности
α!синуклеина. Ранее нами была показана инак!
флуоресценции ThT в их присутствии по срав!
тивация человеческой ГАФД в системе in vitro в
нению с мономерными формами белка (рис. 4, а,
присутствии мономерного α!синуклеина дико!
кривые 1 и 2 по сравнению с кривыми 3 и 4), а
го типа; необходимым условием было частич!
также снижением молярной эллиптичности
ное окисление сульфигидрильной группы в ак!
кривой олигомера (3) относительно кривой мо!
тивном центре чГАФД [18]. В клеточных лиза!
номера α!synА53Т
(1) при длинах волн
тах всех использованных клеточных линий
218-220 нм и 230 нм (рис. 4, б). При этом исход!
ГАФД находится в частично окисленной форме,
ная смесь мономера и олигомера до разделения
так как ее активность увеличивается на 30-40%
на центрифужном фильтре с пределом пропус!
после инкубации с ДТТ. Вероятно, взаимодей!
кания 100 кДа (рис. 4, б кривая 2) имеет спектр,
ствие α!синуклеина именно с такими формами
идентичный спектру мономера белка, что ука!
ГАФД приводит к дополнительному снижению
зывает на маленький процент образовавшегося
активности фермента и к изменению интенсив!
олигомера в исходной смеси. Схожую картину
ности гликолиза. Чтобы дополнительно иссле!
можно наблюдать (рис. 4, в) при окрашивании
довать влияние различных форм α!синуклеина
антителами, специфичными к α!синуклеину,
на активность ГАФД, нами были получены ре!
нитроцеллюлозной мембраны после проведе!
комбинантные α!synWT и α!synA53T, а также
ния электрофоретического разделения в восста!
их олигомеры и фибриллы. Полученные олиго!
навливающих условиях в присутствии Ds!Na.
меры α!синуклеина были охарактеризованы с
На дорожке, соответствующей смеси мономера
помощью изменения флуоресценции ThT,
и олигомера (рис. 4, в, дорожка 2), можно видеть
а
б
Рис. 3. Оценка интенсивности гликолиза в клетках нейробластомы SH!SY5Y, стабильно продуцирующих α!synWT
(+synWT) или α!synA53T (+synA53T), по поглощению глюкозы (а) и продукции лактата (б) в культуральной среде. На сле!
дующий день после пересаживания клеток культуральную среду заменяли на свежую и измеряли изменение концентра!
ции глюкозы и лактата в среде за 4 ч энзиматическим методом. Данные представлены в виде диаграммы размаха c указа!
нием точками конкретных экспериментальных значений, n = 4. Статистически значимое отличие от контроля с *p < 0,05
(U!критерий Манна-Уитни)
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
714
МЕЛЬНИКОВА и др.
дополнительную полосу, соответствующую по
мощью нативного фореза мономеров и олиго!
молекулярной массе (∼36 кДа) димеру α!синук!
меров α!синуклеина (рис. 4, г, дорожки 1 и 2 со!
леина. Однако полоса, соответствующая высо!
ответственно) мы подтвердили, что препарат
комолекулярным олигомерам (∼190-220 кДа),
мономера содержит преимущественно моно!
появляется только на дорожке, соответствую!
мерную форму белка, а препарат олигомера -
щей олигомерам, отделенным от низкомолеку!
преимущественно олигомерную форму. Оце!
лярных форм с помощью фильтрования (рис. 4, в,
нить молекулярную массу олигомера данным
дорожка 3). Также, согласно данным иммуно!
методом представляется затруднительным, пос!
блоттинга, можно сделать вывод о том, что по!
кольку мономер α!синуклеина имеет кажущую!
лученные олигомеры, по крайней мере частич!
ся массу 60 кДа на нативном электрофорезе
но, устойчивы к воздействию Ds!Na. С по!
вместо теоретических 14,4 кДа [28].
Рис. 4. Получение и анализ различных форм рекомбинантных α!synWT и α!synA53T (M - мономеры; М + О - неразде!
ленная смесь мономеров и олигомеров; О - олигомеры; Ф - фибриллы). а - Интенсивность флуоресценции ThT в при!
сутствии мономеров α!synWT и α!synA53T (1 и 2) и олигомеров α!synWT и α!synA53T (3 и 4). 7 мкМ белка (в расчете на
мономер) и 150 мкМ ThT инкубировали в течение 10 мин при 25 °C перед записью спектра возбуждения ThT. б - Спект!
роскопия КД различных форм α!synA53T (1 - мономеры, 2 - неразделенная смесь мономеров и олигомеров, 3 - олиго!
меры) с концентрацией белка 70 мкМ в расчете на мономер в фосфатно!солевом буфере, рН 7,4. в - Анализ методом им!
муноблоттинга антителами, специфичными к α!синуклеину (клон LB509), мономера (1), неразделенной смеси мономе!
ра и олигомера (2) и полученного с помощью 100 кДа фильтра олигомера (3) α!synA53T. г - Нативный электрофорез в ще!
лочных условиях мономерных (1) и олигомерных (2) форм α!synWT или α!synA53T. На дорожку наносили 10 мкг белка.
д - Степень инактивации 140 мкM чГАФД в контрольном образце (1) или в присутствии молярного избытка 1 : 40 = тет!
рамер чГАФД : мономер α!синуклеина мономеров (2, 3), олигомеров (4, 5) или фибрилл (6, 7) α!synWT (2,4,6) или
α!synA53T (3, 5 и 7). Данные представлены как экспериментальные значения (n = 3) с указанием стандартного
отклонения от среднего
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
НАРУШЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
715
Рис. 5. Принципиальная схема полученных результатов. Инактивация ГАФД, происходящая вследствие взаимодействия
с мономерными и олигомерными формами α!синуклеина, коррелирует со снижением интенсивности гликолиза, в част!
ности, со снижением скорости генерации L!лактата
При исследовании снижения активности
при развитии болезни Паркинсона [8], что в на!
чГАФД в присутствии разных форм α!синуклеи!
шей работе косвенно подтверждается снижени!
на (рис. 4, д) нами было обнаружено, что наибо!
ем потребления глюкозы при стабильно повы!
лее сильно активность чГАФД снижалась при
шенной экспрессии α!синуклеина (рис. 3, а).
инкубации с олигомерными формами (сниже!
Таким образом, можно предположить, что сни!
ние на 12%), чуть менее выраженно на актив!
жение восстановительного потенциала клетки
ность влияли мономеры α!синуклеина (сниже!
вследствие нарушения регуляции пентозофос!
ние на 5%), а фибриллярные формы на актив!
фатного пути может приводить к частичному
ность чГАФД практически не влияли; самоинак!
окислению ферментов, в том числе ГАФД, что, в
тивации чГАФД в тестируемом временном ин!
свою очередь, является одним из механизмов
тервале также практически не происходило.
нарушения снабжения клетки энергией путем
Поскольку мы видим выраженное падение
гликолиза, ведет к накоплению субстрата
активности ГАФД в случаях, когда при помощи
ГАФД - глицеральдегид!3!фосфата - и сниже!
иммуноцитохимии мы наблюдаем образование
нию продукции лактата, что было показано и на
амилоидных агрегатов, но при этом мы не наб!
нашей клеточной модели (рис. 2, ж и 3, б).
людаем влияния больших фибриллярных агре!
Полученные результаты позволяют нам сде!
гатов на активность чГАФД in vitro, можно пред!
лать выводы о том, что стабильная суперпро!
положить, что основное влияние на изменение
дукция α!синуклеина в клетках нейробластомы
активности ГАФД в клетках оказывают моно!
SH!SY5Y приводит к накоплению амилоидных
мерные и олигомерные формы белка. Более то!
агрегатов, причем продукция α!synA53T приво!
го, мы наблюдали снижение активности ГАФД
дит к накоплению большего количества агрега!
при работе с растворимой фракцией клеточных
тов, чем α!synWT. Повышенная продукция
лизатов, не содержащей больших агрегатов.
α!синуклеина также вызывает изменения мета!
Несмотря на то, что мы не смогли обнаружить
болизма, в частности, снижение скорости гене!
олигомерные формы α!синуклеина методом
рации лактата и потребления глюкозы. Обнару!
иммуноблоттинга, их образование при повы!
женные нарушения гликолиза также коррели!
шенной экспрессии этого белка было показано
руют со снижением ферментативной активнос!
в других работах [27]. Вероятно, не только мо!
ти ГАФД. Эксперименты, проведенные на изо!
номеры α!синуклеина, но и его олигомерные
лированных белках в системе in vitro, позволяют
формы, даже присутствующие в относительно
предположить, что инактивация ГАФД проис!
небольшом количестве, оказывают выраженное
ходит вследствие взаимодействия с мономер!
инактивирующее воздействие на ГАФД и, та!
ными и олигомерными формами α!синуклеина
ким образом, вносят вклад в подавление глико!
(рис. 5).
лиза.
Как упоминалось ранее, нарушения в пенто!
зофосфатном пути могут быть одними из пер!
Финансирование. Исследование выполнено
вых патологических изменений метаболизма
при финансовой поддержке Российского фонда
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
716
МЕЛЬНИКОВА и др.
фундаментальных исследований в рамках науч!
Соблюдение этических норм. Настоящая
ного проекта № 18!34!00132.
статья не содержит описания выполненных ав!
Конфликт интересов. Авторы сообщают об
торами исследований с участием людей или ис!
отсутствии конфликта интересов.
пользованием животных в качестве объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Schapira, A., Cooper, J., Dexter, D., Clark, J., Jenner, P.,
Atarés, B., Llorens, V., Tortosa, E., Ser, T., Muñoz, D.,
and Marsden, C. (1990) Mitochondrial complex I defi!
and Yebenes, J. (2004 ) The new mutation, E46K, of alpha!
ciency in Parkinson’s disease, J. Neurochem., 54, 823!827,
synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia. Ann.
doi: 10.1111/j.1471!4159.1990.tb02325.x.
Neurol., 55, 164!173, doi: 10.1002/ana.10795.
2.
Nakamura, K. (2013) α!Synuclein and mitochondria:
12.
Chartier!Harlin, M.!C., Kachergus, J., Roumier, C.,
partners in crime? Neurotherapeutics,
10,
391!9,
Mouroux, V., Douay, X., Lincoln, S., Levecque, C.,
doi: 10.1007/s13311!013!0182!9.
Larvor, L., Andrieux, J., Hulihan, M., Waucquier, N.,
3.
Henchcliffe, C., Shungu, D., Mao, X., Huang, C.,
Defebvre, L., Amouyel, P., Farrer, M., and Destée A.
Nirenberg, M., Jenkins, B., and Beal, M.
(2008)
(2004) Alpha!synuclein locus duplication as a cause of
Multinuclear magnetic resonance spectroscopy for in vivo
familial Parkinson’s disease, Lancet (London, England),
assessment of mitochondrial dysfunction in Parkinson’s
364, 1167!1169, doi: 10.1016/S0140!6736(04)17103!1.
disease, Ann. N. Y. Acad. Sci.,
1147,
206!220,
13.
Singleton, A. B., Farrer, M., Johnson, J., Singleton, A.,
doi: 10.1196/annals.1427.037.
Hague, S., Kachergus, J., Hulihan, M., Peuralinna, T.,
4.
Jiang, P., Gan, M., Ebrahim, A., Castanedes!casey, M.,
Dutra, A., Nussbaum, R., Lincoln, S., Crawley, A.,
Dickson, D., and Yen, S. (2013) Adenosine monophos!
Hanson, M., Maraganore, D., Adler, C., Cookson, M.,
phate!activated protein kinase overactivation leads to
Muenter, M., Baptista, M., Miller, D., Blancato, J., Hardy, J.,
accumulation of α!synuclein oligomers and decrease of
and Gwinn!Hardy, K. (2003) Alpha!synuclein locus tripli!
neurites, Neurobiol. Aging, 34, 1504!1515, doi: 10.1016/
cation causes Parkinson’s disease, Science, 302, 841,
j.neurobiolaging.2012.11.001.
doi: 10.1126/science.1090278.
5.
Anandhan, A., Lei, S., Levytskyy, R., Pappa, A.,
14.
Shalova, I., Cechalova, K., Rehakova, Z., Dimitrova, P.,
Panayiotidis, M., Cerny, R., Khalimonchuk, O.,
Ognibene, E., Caprioli, A., Schmalhausen, E., Muronetz, V.,
Powers, R., and Franco, R. (2017) Glucose metabolism
and Saso, L. (2007) Decrease of dehydrogenase activity of
and AMPK signaling regulate dopaminergic cell death
cerebral glyceraldehyde!3!phosphate dehydrogenase in differ!
induced by gene (α!synuclein)-environment (paraquat)
ent animal models of Alzheimer’s disease, Biochim. Biophys.
interactions, Mol. Neurobiol., 54, 3825!3842, doi: 10.1007/
Acta, 1770, 826!832, doi: 10.1016/j.bbagen.2007.01.014.
s12035!016!9906!2.
15.
Mazzola, J., and Sirover, M. (2001) Reduction of glycer!
6.
Anandhan, A., Jacome, M., Lei, S., Hernandez!Franco, P.,
aldehyde!3!phosphate dehydrogenase activity in
Pappa, A., Panayiotidis, M., Powers, R., and Franco, R.
Alzheimer’s disease and in Huntington’s disease fibrob!
(2017) Metabolic dysfunction in Parkinson’s disease:
lasts, J. Neurochem., 76, 442!449, doi: 10.1046/j.1471!
bioenergetics, redox homeostasis and central carbon
4159.2001.00033.x.
metabolism, Brain Res. Bull., 133, 12!30, doi: 10.1016/
16.
Tatton, N. (2000) Increased caspase 3 and Bax immunore!
j.brainresbull.2017.03.009.
activity accompany nuclear GAPDH translocation and
7.
Herrero!Mendez, A., Almeida, A., Fernández, E.,
neuronal apoptosis in Parkinson’s disease, Exp. Neurol.,
Maestre, C., Moncada, S., and Bolaños, J. (2009) The
166, 29!43, doi: 10.1006/exnr.2000.7489.
bioenergetic and antioxidant status of neurons is controlled
17.
Tsuchiya, K., Tajima, H., Kuwae, T., Takeshima, T.,
by continuous degradation of a key glycolytic enzyme by
Nakano, T., Tanaka, M., Sunaga, K., Fukuhara, Y.,
APC/C!Cdh1, Nat. Cell Biol.,
11,
747!52,
Nakashima, K., Ohama, E., Mochizuki, H., Mizuno, Y.,
doi: 10.1038/ncb1881.
Katsube, N., and Ishitani, R. (2005) Pro!apoptotic protein
8.
Dunn, L., Allen, G., Mamais, A., Ling, H., Li, A.,
glyceraldehyde!3!phosphate dehydrogenase promotes the
Duberley, K., Hargreaves, I., Pope, S., Holton, J.,
formation of Lewy body!like inclusions, Eur. J. Neurosci.,
Lees, A., Heales, S., and Bandopadhyay, R.
(2014)
21, 317!326, doi: 10.1111/j.1460!9568.2005.03870.x.
Dysregulation of glucose metabolism is an early event in
18.
Barinova, K., Khomyakova, E., Semenyuk, P.,
sporadic Parkinson’s disease, Neurobiol. Aging, 35, 1111!
Schmalhausen, E., and Muronetz, V. (2018) Binding of
1115, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2013.11.001.
alpha!synuclein to partially oxidized glyceraldehyde!3!
9.
Polymeropoulos, M., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S.,
phosphate dehydrogenase induces subsequent inactivation
Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J.,
of the enzyme, Arch. Biochem. Biophys., 642, 10!22,
Boyer, R., Stenroos, E., Chandrasekharappa, S.,
doi: 10.1016/j.abb.2018.02.002.
Athanassiadou, A., Papapetropoulos, T., Johnson, W.,
19.
Barinova, K., Kuravsky, M., Arutyunyan, A.,
Lazzarini, A., Duvoisin, R., Iorio, G., Golbe, L., and
Serebryakova, M., Schmalhausen, E., and Muronetz, V.
Nussbaum, R. (1997) Mutation in the alpha!synuclein
(2017) Dimerization of Tyr136Cys alpha!synuclein pre!
gene identified in families with Parkinson’s disease,
vents amyloid transformation of wild!type alpha!synucle!
Science,
276,
2045!2047, doi:
10.1126/science.276.
in, Int. J. Biol. Macromol., 96, 35!43, doi: 10.1016/j.ijbiomac.
5321.2045.
2016.12.011.
10.
Krüger, R., Kuhn, W., Müller, T., Woitalla, D., Graeber, M.,
20.
Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the
Kösel, S., Przuntek, H., Epplen, J., Schöls, L., and Riess,
quantitation of microgram quantities of protein utilizing
O. (1998) Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha!
the principle of protein!dye binding, Anal. Biochem., 72,
synuclein in Parkinson’s disease, Nat. Genet., 18, 106!108,
248!254, doi: 10.1006/abio.1976.9999.
doi: 10.1038/ng0298!106.
21.
Danshina, P., Schmalhausen, E., Avetisyan, A., and
11.
Zarranz, J., Alegre, J., Gómez Esteban, J., Lezcano, E.,
Muronetz, V. (2001) Mildly oxidized glyceraldehyde!3!
Ros, R., Ampuero, I., Vidal, L., Hoenicka, J., Rodriguez, O.,
phosphate dehydrogenase as a possible regulator of glycol!
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
НАРУШЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
717
ysis, IUBMB Life,
51,
309!314, doi:
10.1080/
toxicity in a PC12 inducible cell model for Parkinsonism,
152165401317190824.
Pharmacol. Res., 63, 439!444, doi: 10.1016/j.phrs.2011.
22. Barinova, K., Eldarov, M., Khomyakova, E., Muronetz, V.,
01.004.
and Schmalhausen, E. (2017) Isolation of recombinant
26. Mishizen, A. J., Lynch, D. R., Nakashima, A., Nagatsu, T.,
human untagged glyceraldehyde!3!phosphate dehydroge!
Giasson, B. I., Ota, A., Thomas, S. A., Mazzulli, J. R., and
nase from E. coli producer strain, Protein Expr. Purif., 137,
Ischiropoulos, H. (2006) Cytosolic catechols inhibit α!
1!6, doi: 10.1016/j.pep.2017.06.009.
synuclein aggregation and facilitate the formation of intra!
23. Lee, B., and Kamitani, T. (2019) Improved immunodetec!
cellular soluble oligomeric intermediates, J. Neurosci., 26,
tion of endogenous α!synuclein, PLoS One, 6, e23939,
10068!78, doi: 10.1523/jneurosci.0896!06.2006.
doi: 10.1371/journal.pone.0023939.
27. Marmolino, D., Foerch, P., Atienzar, F., Staelens, L.,
24. Medvedeva, M., Barinova, K., Melnikova, A., Semenyuk, P.,
Michel, A., and Scheller, D. (2016) Alpha!synuclein
Kolmogorov, V., Gorelkin, P., Erofeev, A., and Muronetz, V.
dimers and oligomers are increased in overexpressing con!
(2020) Naturally occurring cinnamic acid derivatives pre!
ditions in vitro and in vivo, Mol. Cell. Neurosci., 71, 92!101,
vent amyloid transformation of alpha!synuclein, Biochimie,
doi: 10.1016/J.MCN.2015.12.012.
170, 128!139, doi: 10.1016/j.biochi.2020.01.004.
28. Burré, J., Vivona, S., Diao, J., Sharma, M., Brunger, A.,
25. Liu, Z., Yu, Y., Li, X., Ross, C., and Smith, W. (2011)
and Südhof, T. (2013) Properties of native brain α!synucle!
Curcumin protects against A53T alpha!synuclein!induced
in, Nature, 498, 1!6, doi: 10.1038/nature12125.
ALPHA SYNUCLEIN OVEREXPRESSION IN SH SY5Y
HUMAN NEUROBLASTOMA CELLS LEADS TO ACCUMULATION
OF THIOFLAVIN S POSITIVE AGGREGATES
AND IMPAIRMENT OF GLYCOLYSIS
A. K. Melnikova1*, D. V. Pozdyshev2, K. V. Barinova2,
S. S. Kudryavtseva1, and V. I. Muronetz1,2
1 Lomonosov Moscow State University, Faculty of Bioengineering and Bioinformatics,
119234, Moscow, Russia; E*mail: alksmelnikova@gmail.com
2 Lomonosov Moscow State University, Belozersky Institute of Physico*Chemical Biology, 119234, Moscow, Russia
Received February 17, 2020
Revised March 13, 2020
Accepted March 25, 2020
Deterioration of energy metabolism in affected cells is an important feature of synucleinopathies, including
Parkinson’s disease. Here, we studied the association between α!synuclein accumulation and glycolysis using SH!
SY5Y neuroblastoma cell lines stably expressing wild!type α!synuclein or its A53T mutant linked to the autosomal
dominant form of the disease. Overexpression of both proteins led to the accumulation of thioflavin S!positive aggre!
gates, more pronounced for α!synuclein A53T. It also caused changes in the cell energy metabolism manifested as a
decrease in the lactate accumulation and glucose uptake. Impairments in glycolysis were also accompanied by a
decrease in the activity of the glycolytic enzyme glyceraldehyde!3!phosphate dehydrogenase (GAPDH). In vitro
experiments with purified proteins indicated that GAPDH inactivation might be caused by its binding to the
monomeric and oligomeric forms of α!synuclein. Therefore, a decrease in the GAPDH activity induced by its inter!
action with α!synuclein, might be one of the causes of glucose metabolism deterioration in synucleinopathies.
Keywords: α!synuclein, glyceraldehyde!3!phosphate dehydrogenase, glycolysis, Parkinson’s disease
БИОХИМИЯ том 85 вып. 5 2020
