БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 7, с. 890 - 906

УДК 577.2

МАРКЕРЫ АКТИВАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПУТЕЙ

СВЯЗАНЫ С ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ТЕРАПИИ ТРАСТУЗУМАБОМ

ПРИ HER2 ПОЗИТИВНОМ МЕТАСТАТИЧЕСКОМ РАКЕ МОЛОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ ЛУЧШЕ, ЧЕМ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ ОТДЕЛЬНЫХ ГЕНОВ*

М. Сорокин^1,2,3, К. Игнатьев⁴, В. Барбара⁴, У. Владимирова^1,3, А. Муравьева³,

М. Сунцова¹, Н. Гайфуллин⁵, И. Воротников⁶, Д. Камашев^1,3, А. Бондаренко⁷,

М. Баранова^7,8, Е. Поддубская^3,7, A. Буздин^1,2,3,9**

¹ ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН,

117997 Москва, Россия; электронная почта: buzdin@oncobox.com

² OmicsWay Corp., 91789 Walnut, CA, США

³ ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 119991 Москва, Россия

⁴ ГБУЗ Республики Карелия «Республиканский онкологический диспансер», 185016 Петрозаводск, Россия

⁵ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

факультет фундаментальной медицины, 119991 Москва, Россия

⁶ ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина»

Министерства здравоохранения Российской Федерации, 115478 Москва, Россия

⁷ Многопрофильный медицинский центр «ВитаМед», 121309 Москва, Россия

⁸ ФГБНУ «Росийский Научный Центр Хирургии им. акад. Б.В. Петровского», 119991 Москва, Россия

⁹ ФГАОУ ВО «Московский физикоGтехнический институт (национальный исследовательский университет)»,

141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Поступила в редакцию 31.03.2020

После доработки 29.05.2020

Принята к публикации 31.05.2020

Повышенная экспрессия или амплификация гена ERBB2, кодирующего тирозинкиназу HER2, - хорошо

известный и широко используемый прогностический биомаркер назначения таргетного противоопухолево"

го препарата трастузумаб и его аналогов при раке молочной железы (РМЖ). Поскольку часть опухолей с по"

вышенной экспрессией HER2 все же не отвечает на трастузумаб, мы провели клиническое исследование

NCT03521245 для выявления дополнительных экспрессионных биомаркеров трастузумаба при HER2"пози"

тивных РМЖ. С помощью РНК"секвенирования мы профилировали генную экспрессию для 23"х образцов

фиксированной в формалине парафинизированной ткани HER2"позитивного РМЖ, полученных от паци"

ентов с известным статусом ответа на трастузумаб. Для групп пациентов"ответчиков и неответчиков на ле"

чение мы обнаружили ряд дифференциально регулируемых генов и молекулярных путей. Мы сравнили эти

результаты с 42"мя профилями РНК"секвенирования пациентов"ответчиков и неответчиков на терапию

трастузумабом, ранее опубликованными по итогам клинических исследований NCT00513292 и

NCT00353483. Мы не нашли корреляции между статусом ответа и уровнем экспрессии самого гена ERBB2 в

HER2"положительных образцах РМЖ. Сравнение дифференциально регулируемых генов и молекулярных

путей в объединенном наборе данных выявило 15 активированных и 27 подавленных у ответчиков на трас"

тузумаб генов и 15/25 молекулярных путей соответственно. Тем не менее по сравнению с моделью случай"

ного распределения статистически значимым оказалось только пересечение молекулярных путей, активи"

рованных у ответчиков по сравнению с неответчиками. Классификатор, построенный нами на основе наи"

более сильно активированного дифференциального молекулярного пути «cAMP Pathway Protein Retention»,

показал наилучшую эффективность для прогнозирования ответа на трастузумаб HER2"положительного

РМЖ как для наших, так и для ранее опубликованных данных. Этот путь также статистически достоверно

(p = 0,041) предсказывал время до рецидивирования заболевания в комбинированном наборе данных.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рак молочной железы, HER2, ERBB2, транскриптомика, РНК"секвенирование,

трастузумаб, таргетная терапия, персонализированная медицина, NCT03521245.

DOI: 10.31857/S0320972520070040

Принятые сокращения: РМЖ - рак молочной железы, PR - прогестероновый рецептор, AUC - площадь под

ROC"кривой, УАП - уровень активации пути, ER - эстрогеновый рецептор.

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/

biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20"089, 24.06.2020.

** Адресат для корреспонденции.

890

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

891

ВВЕДЕНИЕ

ментальным свойством объединения экспрес"

сии отдельных генов в результирующий показа"

На исследования и лечение рака молочной

тель, называемый уровнем активации пути

железы (РМЖ) сильно повлияло открытие та"

(УАП). Объединение генных продуктов по

ких мощных прогностических биомаркеров, как

функциональному признаку в молекулярные

сверхэкспрессия или амплификация тирозин"

пути позволяет использовать УАП вместо уров"

киназы HER2, экспрессия эстрогенового (ER) и

ней экспрессии отдельных генов [5, 18]. Для

прогестеронового (PR) рецепторов. Злокачест"

многих видов рака было показано, что исполь"

венные опухоли молочной железы, где отсут"

зование УАП вместо уровней отдельных генов

ствует значительная экспрессия ER и PR, с ба"

позволяет нивелировать артефакты измерения

зальным уровнем HER2 классифицируют как

генной экспрессии за счет уменьшения значи"

тройной отрицательный РМЖ. При РМЖ ам"

мости технических ошибок основных экспери"

плификация ERBB2 и повышенная экспрессия

ментальных платформ [19, 20]. Значения акти"

кодируемого им белка HER2 наблюдаются в

вации молекулярных путей могут быть преобра"

15-35% случаев [1-3]. Амплификация ERBB2 и

зованы в клинически действенную оценку ин"

избыточная экспрессия HER2, называемая

дивидуального ответа опухоли на таргетную те"

«HER2"положительным» фенотипом опухоли,

рапию, например моноклональными антитела"

хорошо коррелирует с ответом пациента на ле"

ми

[21] или ингибиторами тирозинкиназ

чение трастузумабом - HER2"специфичным

[22-24].

моноклональным антителом, применяемым для

Для поиска дополнительных биологических

таргетной терапии РМЖ и рака желудка [4]. Для

маркеров ответа на трастузумаб при HER2"по"

HER2"положительных онкологических заболе"

зитивном метастатическом РМЖ мы иницииро"

ваний таргетная терапия трастузумабом обычно

вали клиническое исследование NCT03521245,

рекомендуется независимо от статуса ER и PR,

нацеленное на измерение экспрессии генов и

что привело к значительному увеличению вы"

УАП в раковых тканях ответчиков и неответчи"

живаемости больных в последние годы. HER2"

ков на терапию. Для определения генной

таргетная терапия часто сочетается со стандарт"

экспрессии мы использовали метод РНК"секве"

ными режимами химиотерапии или с гормо"

нирования, считающийся в настоящее время зо"

нальной терапией. И наоборот, подавляющее

лотым стандартом транскриптомики [11].

большинство HER2"отрицательных опухолей

оказываются нечувствительны к HER2"таргет"

ным препаратам [5, 6].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тем не менее клиническая практика показы"

вает, что только 25-80% женщин с HER2"поло"

Биологический материал исследования. Им"

жительным РМЖ (согласно иммуногистохими"

муногистохимическая диагностика образцов

ческим тестам и/или гибридизации in situ) отве"

РМЖ (HER2, PR, ER) была выполнена в ГБУЗ

чают на трастузумаб [7-9]. В целом, уровень от"

Республики Карелия «Республиканский онко"

вета оказывается выше, когда трастузумаб ис"

логический диспансер» (Петрозаводск, Россия)

пользуется в сочетании с химиотерапией или

с использованием наборов антител («Roche

другими таргетными препаратами, и ниже - в

Diagnostics», США). Для интерпретации статуса

случае метастатического рака [10].

HER2 была использована следующая шкала:

Следовательно, поиск дополнительных моле"

(i) базовое окрашивание (0), (ii) «+» (1), (iii) «++»

кулярных биомаркеров, связанных с ответом на

(2) и (iv) «+++» (3). Результаты «++» и «+++»

трастузумаб при HER2"положительном РМЖ,

были подтверждены с помощью набора «ISH

представляет большой фундаментальный и

DNA Probe Cocktail»

(«Roche Diagnostics»,

практический интерес. Молекулярные биомар"

США). При оценке рецепторного статуса стеро"

керы могут включать диагностически значимые

идных гормонов (PR и ER) была использована

мутации или уровни генной экспрессии на уров"

шкала от 0 до 8.

не мРНК или белка [11]. Кроме того, биомарке"

Биоматериал был получен от 23"х женщин с

рами нового поколения могут служить уровни

HER2"положительным РМЖ, средний возраст

активации молекулярных путей, рассчитанные

которых составил 53,3 г. (диапазон 33-77 лет).

на основе профилей генной экспрессии [5, 12,

Пациентки получали монотерапию трастузума"

13]. Они показывают большую диагностическую

бом или трастузумаб в сочетании с другими про"

значимость, чем уровни экспрессии единичных

тивоопухолевыми препаратами: доцетаксел, или

генов или наличие отдельных мутаций [14-17].

паклитаксел + карбоплатин, или паклитаксел,

Данное преимущество молекулярных путей

или доцетаксел + карбоплатин, или ингибитор

в качестве биомаркеров обусловлено их фунда"

ароматазы, или пертузумаб, или капецитабин,

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

892

СОРОКИН и др.

или винорелбин, или гемцитабин; из них 19 па"

Подготовка библиотек и РНК секвенирова

циенток получали адъювантную терапию, 4 -

ние. РНК выделяли из срезов парафиновых бло"

неоадъювантную. Более подробные клиничес"

ков толщиной 10 мкм с использованием набора

кие характеристики представлены в табл. S1 в

RNeasy FFPE («Qiagen», Нидерланды) в соответ"

Приложении.

ствии с протоколом производителя. Для измере"

Все исследованные образцы представляли

ния концентрации РНК использовали наборы

собой фиксированные в формалине парафини"

RNA 6000 Nano Assay («Agilent Technologies»,

зированные ткани РМЖ, содержание опухоле"

Германия). Целостность РНК (RIN) оценивали

вых клеток в которых превышало 70%, из них 19

с использованием биоанализатора Agilent 2100

образцов были получены в ГБУЗ Республики

(«Agilent Technologies», Германия). Для удаления

Карелия «Республиканский онкологический

рибосомной РНК и конструирования библио"

диспансер» (Петрозаводск) и 4 образца - в

тек использовали набор KAPA RNA Hyper

Многопрофильном медицинском центре «Вита"

(«Roche Sequencing Solutions Inc», США) с деп"

Мед» (Москва). 21 образец РМЖ представлял

лецией рибосомальной РНК. Для увеличения

собой фрагменты первичных опухолей и 2 - ме"

количества анализируемых образцов за один

тастазы в лимфатических узлах.

цикл секвенирования использовали лигирова"

РНК"секвенирование было проведено для

ние адаптеров с баркодами. Концентрации и ка"

всех 23"х образцов РМЖ, однако только 9 из них

чество библиотеки измеряли с использованием

соответствовали критериям включения в следую"

набора Qubit dsDNA HS

(«Thermo Fisher

щий этап работ: адъювантная терапия, отрица"

Scientific», США) и Agilent Tapestation («Agilent

тельный ER/PR"статус, метастазирование. Так"

Technologies», Германия). Всего было получено

же из дальнейших анализов были исключены

не менее 30 млн одноконцевых прочтений на

образцы с люминальным подтипом B (HER2"

каждый исследованный образец. РНК"секвени"

положительные, ER/PR"положительные), пос"

рование было выполнено компанией «Омикс"

кольку для него характерен лучший прогноз,

Лаб», Россия и Кафедрой патологии и лабора"

чем для остальной части HER2"положительных

торной медицины Калифорнийского универси"

опухолей молочной железы [25, 26].

тета (Department of Pathology and Laboratory

В итоге 9 образцов, отобранных для дальней"

Medicine, University), США с использованием

шего анализа, были получены от женщин с

секвенатора Illumina HiSeq

3000

(«Illumina,

HER2"положительным ER/PR"отрицательным

Inc.», США). Проверку качества данных прово"

РМЖ, средний возраст которых составлял 55,2 г.

дили с помощью программного обеспечения

(диапазон 44-77 лет). Больные получали моно"

(ПО) Illumina SAV («Illumina, Inc.», США), а де"

терапию трастузумабом в адъювантном режиме

мультиплексирование - с помощью ПО Illumina

или трастузумаб в сочетании с другими терапев"

bcl2fastq2 v 2.17 («Illumina, Inc.», США). Данные

тическими средствами: доцетаксел или пакли"

секвенирования были депонированы в NCBI

таксел, + карбоплатин или паклитаксел или до"

Sequencing Read Archive (SRA) с кодами доступа

цетаксел, + карбоплатин или капецитабин или

PRJNA565016 и PRJNA578290.

винорелбин или гемцитабин (табл. 1). Восемь

Обработка данных РНК секвенирования. По"

отобранных образцов были получены в ГБУЗ

лученные в результате РНК"секвенирования

Республики Карелия «Республиканский онко"

FASTQ"файлы обрабатывались с помощью ПО

логический диспансер» (Петрозаводск), и один

STAR aligner [27] в режиме «GeneCounts» с анно"

образец - в Многопрофильном медицинском

тацией транскриптома человека Ensembl (версия

центре «ВитаМед» (Москва).

GRCh38.89). Генные идентификаторы Ensembl

Восемь образцов соответствовали первич"

были преобразованы в генные символы с ис"

ным опухолям и один - метастазированию в

пользованием набора данных HGNC (https://

лимфатический узел (BC"20). Данная проба бы"

www.genenames.org/, версия базы данных от 13

ла включена в анализ, поскольку мы стремились

июля 2017 г.). Всего были определены уровни

определить надежные биомаркеры устойчивос"

экспрессии для 36 596 генов с уникальными

ти к трастузумабу, которые потенциально могли

идентификаторами HGNC. Минимальное число

бы быть применимы не только для биопсий, по"

уникально картированных прочтений составило

лученных из первичного очага, но и для мета"

1,40 млн со средним значением 7,35 млн. для 9

стазов. Пациентов считали ответчиками на те"

отобранных образцов (8,03 - для всех 23"х образ"

рапию, если ремиссия регистрировалась, по

цов). Дифференциальный анализ генной экс"

крайней мере, за период до 25"го месяца после

прессии был выполнен с использованием ПО

биопсии включительно. Пять пациентов были

DESeq2 [28]. Дифференциально экспрессиро"

классифицированы как ответчики и четыре -

ванные гены у ответчиков и неответчиков на те"

как неответчики на терапию.

рапию использовали для дальнейшего анализа.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

893

Таблица 1. Клинические данные 9 отобранных для эксперимента пациентов

Ответчик/

Продолжи"

№

Возраст

Стадия

неответчик

тельность

Схема терапии

на терапию

безрецидивного

ремиссии

(О/НО)

периода (мес.)

(мес.)

BC"3

T2N1M0, IIIa

2 курса: доксорубицин + цикло"

фосфамид, затем 6 курсов: доце"

таксел + трастузумаб; монотера"

пия трастузумабом (каждые 3 не"

дели, 18 инъекций)

BC"4

T2N1M0, IIB

6 курсов: паклитаксел + доксору"

бицин; монотерапия трастузума"

бом (18 инъекций)

BC"7

T2N3M0, IIIC

НО

без

3 курса: адъювантная химиотера"

ремиссии

пия, лучевая терапия; монотера"

пия трастузумабом

BC"14

T2N2M0, IIIA

6 курсов: доксорубицин + цикло"

фосфамид; паклитаксел

(12 инъекций); монотерапия

трастузумабом каждые 21 день

BC"20

T2N0M0, II

6 курсов: доцетаксел + карбопла"

тин + трастузумаб; монотерапия

трастузумабом (каждые три неде"

ли в течение 12 мес.)

BC"21

T1N3M0, IIIC

НО

без

2 курса: паклитаксел + доксору"

ремиссии

бицин; 3 курса: паклитаксел; мо"

нотерапия трастузумабом (5 мес.)

BC"25

T1N1M0, IIA

НО

без

6 курсов: доксорубицин + цикло"

ремиссии

фосфамид; паклитаксел + кар"

боплатин + трастузумаб; моноте"

рапия трастузумабом

BC"27

T2N0M0, IIA

паклитаксел (12 инъекций) +

трастузумаб

BC"71

T2N0M0

НО

без

5 курсов АС (доксорубицин +

ремиссии

циклофосфамид); паклитаксел +

трастузумаб; монотерапия трас"

тузумабом

Литературные данные генной экспрессии.

2 группы. Первая получала фторурацил

Данные генной экспрессии пациентов с РМЖ

500 мг/м², эпирубицин 75 мг/м² и циклофосфа"

были получены из Базы данных генотипов и фе"

мид 500 мг/м² (FEC"75) в 1"й день 21"дневного

нотипов (dbGAP), код доступа: phs001291.v1.p1

цикла для четырех циклов с последующим пак"

[4]. 31 случай РМЖ был изучен в исследовании

литакселом 80 мг/м² и трастузумабом 2 мг/кг

Z1041 Американской коллегии хирургов"онко"

(после нагрузки 4 мг/кг) один раз в неделю в те"

логов (NCT00513292), где сравнивали частоту

чение 12 недель. Вторая группа получала пакли"

полного патологического ответа пациентов с

таксел и трастузумаб один раз в неделю в тече"

HER2"положительным РМЖ. В исследование

ние 12 недель, а затем - четыре цикла FEC"75

были включены небеременные женщины с ин"

(в 1"й день каждого 21"дневного цикла) и один

вазивным РМЖ со средним возрастом 50,14 г.

раз в неделю трастузумаб, в той же дозировке,

(диапазон 36-70 лет), которые получали нео"

что и для первой группы. Помимо пациентов из

адъювантную химиотерапию и трастузумаб. Па"

исследования Z1041, в phs001291.v1.p1 были

циенты были случайным образом разделены на

включены также профили для 11 HER2"поло"

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

894

СОРОКИН и др.

жительных случаев РМЖ, участвующих в иссле"

Oncobox [29]. Для анализа были отобраны 1754

довании Медицинской школы Вашингтонского

пути, содержащие по крайней мере 10 генных

университета (NCT00353483), получавших нео"

продуктов, доступные в открытых базах данных

адъювантную терапию трастузумабом в сочета"

Reactome [30], NCI Pathway Interaction Database

нии с химиотерапией: трастузумаб + паклитак"

[31], Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

сел + карбоплатин, или доксорубицин + кар"

[32], HumanCyc [33], Biocarta [34] и Qiagen

боплатин, затем трастузумаб + паклитаксел, или

Pathway Central, перечисленых в табл. S3 в При"

FEC"75, затем трастузумаб + паклитаксел [4].

ложении.

HER2"положительный статус для всех случа"

Для расчета УАП все экспериментальные

ев определялся иммуногистохимически и/или с

профили генной экспрессии для ответчиков бы"

помощью флуоресцентной гибридизации in situ

ли нормализованы на профили неответчиков.

(FISH). Образцы РНК выделяли из заморожен"

Таким же образом были нормализованы и лите"

ных биоптатов опухоли, полученных до лечения

ратурные профили генной экспрессии. Молеку"

пациентов, и секвенировали. Опубликованный

лярные пути были визуализированы с использо"

набор данных (табл. S2 в Приложении) содер"

ванием методов визуализации путей Oncobox

жал профили РНК"секвенирования для 42"х па"

[16, 29, 35-37].

циентов, из которых 17 соответствовали крите"

риям включения в исследование - двойной от"

рицательный ER и PR статус. Из них 12 пациен"

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЕЛЕДОВАНИЙ

тов продемонстрировали полный патологичес"

кий ответ (ППО) после лечения, а у 5 обнаружи"

В настоящем исследовании мы сравнили

ли остаточное заболевание. Клиническая анно"

экспериментальные и литературные данные по

тация исследованного набора образцов приве"

дифференциальной экспрессии генов и актива"

дена в табл. 2.

ции молекулярных путей при РМЖ в зависи"

Анализ молекулярных путей. Уровни актива"

мости от успешности лечения трастузумабом.

ции молекулярных путей были рассчитаны с ис"

Клинические данные. В ходе клинического

пользованием метода и аналитического ПО испытания NCT03521245 «Маркеры активации

Таблица 2. Клиническая аннотация 17"ти HER2+/ER-/PR- образцов РМЖ из литературного набора phs001291.v1.p1

Гистологи"

Полный

Время до

№

Источник

Возраст

T"стадия

N"стадия

ческая степень

патологи"

Иденти"

рецидива

злокачествен"

ческий ответ

фикатор

болезни

ности

(да/нет)

(дни)

BRC251

Z1041

да

SRR6447437

1679

BRC261

Z1041

да

SRR6498562

1665

BRC262

Z1041

да

SRR6447573

1674

BRC263

Z1041

да

SRR6447580

1582

BRC271

Z1041

да

SRR6447458

1285

BRC272

Z1041

нет

SRR6447472

112

BRC274

Z1041

нет

SRR6447567

1064

BRC276

Z1041

да

SRR6498531

BRC277

Z1041

да

SRR6498535

936

BRC278

Z1041

да

SRR6498552

874

BRC279

Z1041

да

SRR6498528

352

BRC280

Z1041

нет

SRR6498538

216

BRC284

NCT00353483

нет

SRR6498557

BRC286

NCT00353483

да

SRR6447563

BRC288

NCT00353483

нет

SRR6447558

BRC290

NCT00353483

да

SRR6447556

BRC295

Z1041

да

SRR6447565

1674

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

895

молекулярных путей, прогнозирующие эффек"

тивность терапии трастузумабом HER2"пози"

тивного рака молочной железы» мы получили

набор экспериментальных данных для настоя"

щего исследования. Пациенты были жителями

Северо"Западной и Центральной частей Рос"

сийской Федерации, которые проходили лече"

ние в ГБУЗ Республики Карелия «Республика"

нский онкологический диспансер» (Петроза"

водск) или Многопрофильном медицинском

центре «ВитаМед» (Москва). Использовали сле"

дующие критерии включения: взрослые женщи"

ны с гистологически подтвержденным HER2"

Рис. 1. Репрезентативная гистологическая микрофотогра"

положительным РМЖ и доступными образцами

фия исследуемой ткани РМЖ. Показан умеренно диффе"

опухоли молочной железы; пациенты, получав"

ренцированный инфильтрированный протоковый рак (об"

шие трастузумаб отдельно или в комбинации с

разец BC71; HER2+/ER-/PR-). Окрашивание гематокси"

другими схемами химиотерапии с известным

лином и эозином, масштабный отрезок приведен на ри"

сунке. (С цветными вариантами рис. 1-6 можно ознако"

ответом, согласно критериям RECIST 1.1; паци"

миться в электронной версии статьи на сайте: http://

енты с РМЖ II или более поздней стадии, кото"

sciencejournals.ru/journal/biokhsm/.)

рые подписали информированное доброволь"

ное согласие на участие в этом клиническом ис"

следовании. Критерием исключения являлось

наличие менее 70% опухолевых клеток в доступ"

кодом доступа phs001291.v1.p1 (табл. S2 в При"

ных образцах ткани РМЖ (рис. 1). На первом

ложении). Из них 31 случай был описан в иссле"

этапе в исследование было включено 23 пациен"

довании Американской коллегии хирургов

та, опухолевые образцы которых профилирова"

Z1041 (NCT00513292). В этом исследовании па"

ли с помощью РНК"секвенирования (табл. S1 в

циенты были случайным образом распределены

Приложении). Средний возраст в группе паци"

между двумя группами, где первая получала те"

ентов составил 53 года. В качестве критерия от"

рапию в режиме FEC"75 (фторурацил, эпируби"

вета опухоли на терапию использовали ремис"

цин, циклофосфамид), затем паклитаксел +

сию в течение не менее 25 мес. после биопсии. В

трастузумаб, а вторая - в режиме паклитаксел +

соответствии с этим пациенты были классифи"

трастузумаб, затем трастузумаб + FEC"75. Кро"

цированы как отвечающие или не отвечающие

ме того, набор phs001291.v1.p1 содержал 11 про"

(ответчики/неответчики) на лечение трастузу"

филей HER2"положительного РМЖ, включен"

мабом. Тем не менее мы не могли напрямую

ных в исследование Медицинского университе"

сравнивать статусы ответа на трастузумаб для

те штата Вашингтон (NCT00353483), участники

всех включенных пациентов, поскольку они

которого получали неоадъювантную терапию

принадлежали к разным подтипам HER2"поло"

трастузумабом в сочетании с химиотерапией в

жительного РМЖ: люминальный B или

режимах: трастузумаб + паклитаксел + карбо"

ER-/PR- фенотип. Эти два подтипа имеют су"

платин, или доксорубицин + карбоплатин, за"

щественно различающиеся прогнозы по ответу

тем трастузумаб + паклитаксел, или FEC, затем

на терапию и общую выживаемость [25, 26], что

трастузумаб + паклитаксел [4]. Пациентами бы"

препятствует их объединению в одну группу.

ли женщины с инвазивным РМЖ, средний воз"

Для дальнейшего анализа мы отобрали группу

раст группы составлял 50 лет. Для дальнейшего

из 9 пациентов, которые имели ER-/PR- фено"

исследования мы отобрали образцы с ER-/PR-

тип, получали адъювантную терапию и имели

статусом. Пациенты также были классифициро"

метастазы: пять ответчиков и четыре неответчи"

ваны как ответчики (патологический полный

ка. Все пациенты получали трастузумаб в раз"

ответ) и неответчики (остаточное заболевание).

личных схемах лечения. Наиболее распростра"

Всего для последующего анализа было отобрано

ненные комбинации с трастузумабом (табл. 1)

17 литературных профилей, соответствующих 12

включали таксаны (паклитаксел или доцетак"

ответчикам и пяти неответчикам на терапию

сел, n = 7) и доксорубицин (n = 6).

(табл. 2).

В качестве данных для сравнения мы ис"

Дифференциально регулируемые гены и моле

пользовали ранее опубликованную коллекцию

кулярные пути. На массивах экспериментальных

[4] из 42"х клинически аннотированных профи"

и литературных данных мы отобрали гены, диф"

лей РНК"секвенирования РМЖ, доступных в

ференциально экспрессируемые при РМЖ у от"

базе данных генотипов и фенотипов (dbGAP) с

ветчиков и неответчиков на терапию. Для экс"

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

897

периментальных данных статистический уро"

нако как было указано ранее, пересечение по"

вень значимости (р < 0,05) был пройден для 1600

давленных путей между экспериментальной и

генов, из которых 402 были активированы и

литературной выборками имеет признаки слу"

1198 подавлены в группе ответчиков на тера"

чайного совпадения (рис. 3, в).

пию. Для литературных данных было выявлено

Затем для каждого из 15 общих путей, акти"

2235 дифференциальных генов (p < 0,05), где

вированных у ответчиков, мы исследовали спо"

1049 были активированы и 1186 - подавлены у

собность дискриминировать ответчиков от не"

ответчиков (табл. S4 в Приложении). В свою

ответчиков на терапию трастузумабом. Для это"

очередь, пересечение экспериментальных и ли"

го вычисляли отношения рисков (от англ.

тературных данных дало 15 активированных и

Hazard Ratio) и p"значения теста Log"rank. Для

27 подавленных генов в группе ответчиков

этого анализа мы объединили пациентов из обе"

(рис. 2, а и б).

их выборок, для которых была доступна инфор"

Статистическая значимость этого пересече"

мация о времени до прогрессии заболевания.

ния была исследована путем пересечения слу"

Затем пациенты были разделены на две группы с

чайных групп генов того же размера со случай"

уровнями активации пути выше и ниже, чем ме"

ной перестановкой названий генов. Как для ак"

дианное значение. Мы обнаружили, что 12 ис"

тивированных, так и для подавленных генов мы

следованных дифференциально активирован"

обнаружили, что число пересекшихся генов со"

ных путей могут служить маркерами выживае"

ответствовало модели случайного распределе"

мости без прогрессирования заболевания. Для

ния и не показало статистически значимого

путей «PPAR», «noradrenaline and adrenaline

обогащения (рис. 2, в и г). Мы также сравнили

degradation» и «Drug metabolism cytochrome P450

экспрессию гена ERBB2, кодирующего молеку"

pathway» p"значение Log"rank теста превышало

лярную мишень трастузумаба, между ответчика"

0,05 (табл. 3). При этом путь «cAMP Protein

ми и неответчиками, но не обнаружили сущест"

Retention pathway» показал лучшую эффектив"

венных различий как для экспериментальных,

ность как для предсказания ответа на терапию,

так и для литературных данных (рис. S1 в При"

так и для прогнозирования времени до прогрес"

ложении).

сии (рис. 6). Дополнительно мы рассчитали

Для дифференциально регулируемых генов с

площадь под ROC"кривой (AUC), которая явля"

помощью ПО Oncobox [29] мы вычислили УАП

ется универсальной характеристикой качества

для 1754 внутриклеточных молекулярных путей,

биомаркеров, основанной на значениях

имеющих, по крайней мере, 10 генных продук"

чувствительности и специфичности [38]. Этот

тов в своем составе. Мы провели поиск статис"

статистический подход широко применим к

тически значимо дифференциально регулируе"

различным типам биомаркеров в онкологии [14,

мых путей (р < 0,05) и обнаружили 246 путей для

16, 17, 39-41]. AUC положительно коррелирует

экспериментальных данных (79 активирован"

с качеством биомаркера и изменяется в интер"

ных и 167 подавленных в группе ответчиков) и

вале 0,5-1. Стандартный порог дискриминации

424 - для литературных данных (161 активиро"

составляет 0,7, и биомаркеры с большим значе"

ванных и 263 подавленных в группе ответчи"

нием AUC считаются высококачественными, и

ков), (табл. S5 в Приложении). При пересече"

наоборот [42]. Путь «cAMP Pathway Protein

нии дифференциально регулируемых путей для

Retention» показал самое высокое значение

групп ответчиков и неответчиков мы получили

AUC и самое низкое наблюдаемое отношение

случайное значение для подавленных путей, но

рисков [AUC равно 1 для экспериментального и

неслучайное (qGзначение = 0,002) для 15 активи"

0,867 - для литературного набора данных; отно"

рованных путей (рис. 3).

шение рисков 0,34 (95% доверительный интер"

Среди этих

15 активированных путей

вал: 0,11-1, р"значение = 0,05)] (табл. 3).

(табл. 3) наиболее статистически значимыми по

критерию Уилкоксона-Манна-Уитни были

следующие два:

«PPAR Pathway» и

«cAMP

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Protein Retention Pathway». Профиль активации

пути для «cAMP Protein Retention Pathway», ко"

В этой статье мы получили экспрессионные

торый также был связан со временем до прог"

профили для 23 образцов фиксированной в

рессирования в последующем анализе, предс"

формалине парафинизированной ткани РМЖ,

тавлен для ответчиков и неответчиков на рис. 4.

полученных от HER2"положительных пациен"

Кроме того, среди пересечения молекуляр"

тов"ответчиков или неответчиков на лечение

ных путей, подавленных в группе ответчиков,

трастузумабом. Для групп, отвечающих и не от"

присутствовал путь

«ErbB Family Pathway»,

вечающих на лечение, мы определили диффе"

включающий продукт гена ERBB2 (рис. 5). Од"

ренциально регулируемые гены и молекулярные

4 БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

898

СОРОКИН и др.

пути. Затем мы сравнили полученные результа"

бом, которые ранее участвовали в клинических

ты с 42 опубликованными профилями РНК"

исследованиях NCT00513292 и NCT00353483

секвенирования тканей РМЖ пациентов с изве"

[4]. Интересно, что мы не обнаружили корреля"

стным статусов ответа на терапию трастузума"

ции между статусом ответа и уровнем экспрес"

Рис. 3. Пересечение дифференциально регулируемых молекулярных путей между экспериментальными и литературными

наборами данных. Диаграммы Венна показывают пересечение групп подавленных (а) и активированных (б) путей между

экспериментальным (NCT03521245) и литературным (dbGAP: phs001291.v1.p1) наборами данных. Гистограммы (в и г) по"

казывают фактически наблюдаемое, а также теоретически ожидаемое количество дифференциально регулируемых путей

исходя из модели случайного распределения, число случайных перестановок 1000. в - Распределение пересечения подав"

ленных путей, qGзначение для реально наблюдаемого пересечения составляет 0,53. г - Распределение пересечения акти"

вированных путей, qGзначение для реально наблюдаемого пересечения составляет 0,002

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

899

Рис. 4. Профиль дифференциальной активации молекулярного пути «cAMP Protein Retention Pathway» у ответчиков на те"

рапию трастузумабом против неответчиков в экспериментальном (а) и литературном (б) наборах данных

сии гена ERBB2. При пересечении наборов вы"

Кроме того, в большинстве таких исследований

явленных дифференциально регулируемых ге"

для молекулярного профилирования использо"

нов и молекулярных путей в обеих выборках, мы

вали технологию микрочипирования [45-47]. В

обнаружили 15 активированных и 27 подавлен"

нашем исследовании для этого применяли

ных генов и 15/25 путей соответственно. Тем не

РНК"секвенирование, которое в настоящее вре"

менее статистически значимым по сравнению с

мя считается золотым стандартом профилиро"

моделью случайного распределения оказалось

вания генной экспрессии [48, 49]. Кроме того,

только пересечение молекулярных путей, акти"

мы использовали секвенирование тотальной

вированных у ответчиков по сравнению с неот"

РНК без поли(А) обогащения, и в будущих ис"

ветчиками. При использовании классификато"

следованиях наш набор данных может быть ис"

ра, построенного на основе наиболее активиро"

пользован также для изучения связи некодиру"

ванного молекулярного пути «cAMP Pathway

ющих РНК с устойчивостью к трастузумабу. На"

Protein Retention», мы получили AUC равное 1 и

конец, это единственный набор данных по об"

0,87 для прогнозирования ответа HER2"положи"

разцам РМЖ, связанным с ответом на трастузу"

тельного метастатического РМЖ на трастузумаб

маб, который полностью совместим с базой дан"

в экспериментальной и литературной выборках

ных здоровых нормальных тканей ANTE в силу

соответственно. При объединении выборок этот

использования того же экспериментального

путь также являлся прогностическим маркером

протокола [50].

времени до рецидивирования (p = 0,041).

Мы сравнили гены и пути, которые разделя"

Опубликовано множество исследований, где

ли ответчиков и неответчиков на терапию трас"

профилировали экспрессию генов для образцов

тузумабом, как по нашим экспериментальным,

пациентов с РМЖ, получавших трастузумаб [40,

так и по литературным данным [4]. Предыдущее

43, 44]. Но лишь малая их часть содержит статус

исследование было направлено на выявление

ответа на терапию, связанный с профилем

биомаркеров ответа на трастузумаб на геномном

экспрессии, а также данные о выживаемости

и транскриптомном уровне. Авторы не нашли

для зарегистрированных клинических случаев.

гены или их сигнатуры, связанные с ответом на

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

901

трастузумаб по данным секвенирования РНК

[4]. Вероятно, это связано с тем, что авторы не

стратифицировали пациентов по статусу рецеп"

торов гормонов ER и PR, как было сделано в

настоящем исследовании. Тогда как общие для

обеих групп данных дифференциальные гены с

высокой вероятностью представляют результат

случайного совпадения, фактическое число ак"

тивированных у ответчиков молекулярных пу"

тей оказалось существенно выше, чем можно

было бы ожидать исходя из модели случайного

пересечения. В частности, лучшая связь с

чувствительностью к трастузумабу наблюдалась

для одной из ветвей сигнального пути цАМФ

(табл. 3).

цAMФ является первым описанным вторич"

ным мессенджером, который играет фундамен"

тальную роль в клеточном ответе на самые раз"

ные внешние стимулы [51]. Одной из функций

молекулярного пути цАМФ является активация

рецептора KDEL (Lys"Asp"Glu"Leu), отвечаю"

щего за ретроградный транспорт белков из

комплекса Гольджи в эндоплазматический рети"

кулум, что необходимо для поддержания устой"

чивого гомеостаза клетки [52]. Ранее было пока"

зано, что изменения в этом комплексе процес"

сов могут приводить к метастазированию РМЖ

посредством измененной локализации рецепто"

ров [53]. Кроме того, внутренние дефекты меха"

низма эндоцитоза, ответственного за деграда"

цию HER2, коррелируют с невосприимчи"

востью к терапии трастузумабом [54]. Однако,

насколько нам известно, настоящее исследова"

ние впервые указывает на возможную связь

между ретроградным транспортом и устойчи"

востью к трастузумабу.

Предыдущие исследования показали не"

сколько других возможных механизмов устой"

чивости к трастузумабу при раке молочной же"

лезы [55]. Во"первых, с такой резистентностью

могут быть связаны другие рецепторы семейства

HER, например HER2"позитивные, но негатив"

ные по HER3 пациенты в основном выживают

без метастазирования [56]. Рецепторы семейств,

отличных от HER, такие как FGFR и IGF"1R,

Рис. 6. Прогностическая значимость УАП молекулярного

также могут играть важную роль в устойчивости

пути «cAMP Pathway Protein Retention» для ответа РМЖ на

к трастузумабу [57, 58]. Существует также воз"

терапию трастузумабом и предсказания времени до про"

можная роль андрогенного рецептора (AR), по"

грессии. Площадь под ROC"кривой (AUC) для разделения

скольку экспрессия AR отрицательно коррели"

ответчиков и неответчиков для экспериментальной (а) и

литературной (б) выборки пациентов. в - Прогностичес"

рует с инфильтрацией иммунными клетками,

кая значимость уровня активации пути «cAMP Pathway

что, в свою очередь, связано с устойчивостью к

Protein Retention» для предсказания времени до прогрес"

трастузумабу [59, 60].

сии пациентов с РМЖ для объединенной эксперименталь"

В нашем исследовании уровень активации

ной и литературной выборки. Отдельно показаны группы

пациентов с УАП ниже или выше медианы. Отношение

пути «cAMP Pathway Protein Retention» оказался

рисков (Hazard ratio) = 0,34 (95% доверительный интервал:

надежным биомаркером, разделяющим ответ"

0,11-1; р"значение = 0,05). Общее количество генов в пу"

чиков и неответчиков на терапию трастузума"

тях, а также количество дифференциальных генов в обоих

бом. Более того, активация этого пути оказалась

наборах приведены в табл. S6 в Приложении

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

902

СОРОКИН и др.

Таблица 3. Характеристика качества биомаркеров для 15 пересекшихся молекулярных путей, дифференциально активи"

рованных в группе ответчиков на терапию трастузумабом

AUC,

Соотношение

p"значение

Название молекулярного пути

экспериментальная

литературная

рисков (95% CI)

соотношения

теста Log"

выборка

рисков

rank

cAMP Pathway Protein Retention

0,867

0,34 (0,11-1)

0,05

0,041

PPAR Pathway

0,867

0,46 (0,16-1,4)

0,16

0,155

cAMP Pathway Cell Proliferation

0,85

0,34 (0,11-1)

0,05

0,041

cAMP Pathway eNOS Signaling

0,85

0,34 (0,11-1)

0,05

0,041

Cardiovascular Homeostasis

cAMP Pathway Glycogen

0,85

0,17 (0,043-0,64)

0,0094

0,004

Synthesis

cAMP Pathway Lipolysis

0,85

0,34 (0,11-1)

0,05

0,041

cAMP Pathway Oncogenesis

0,85

0,34 (0,11-1)

0,05

0,041

Noradrenaline and adrenaline

0,95

0,9

0,59 (0,21-1,7)

0,32

0,316

degradation

Reactome PRC2 methylates his"

0,85

0,17 (0,045-0,66)

0,01

0,004

tones and DNA Main Pathway

cAMP Pathway Degradation

0,817

0,34 (0,11-1)

0,05

0,041

of Cell Cycle Regulators

Reactome Amyloids Main

0,95

0,85

0,17 (0,045-0,66)

0,01

0,004

Pathway

Reactome Condensation

0,95

0,85

0,17 (0,045-0,66)

0,01

0,004

of Prophase Chromosomes

Main Pathway

Reactome DNA Damage

0,95

0,85

0,17 (0,045-0,66)

0,01

0,004

Telomere Stress Induced

Senescence Main Pathway

Reactome Packaging of

0,95

0,85

0,17 (0,045-0,66)

0,01

0,004

Telomere Ends Main Pathway

KEGG Drug metabolism

0,95

0,817

0,47 (0,16-1,4)

0,17

0,158

cytochrome P450 Main Pathway

связана с благоприятным

прогнозом в плане

Финансирование.

Это

исследование было

предсказания времени до рецидива опухоли.

поддержано Российским научным фондом

Мы предполагаем, что уровень активации этого

(грант № 18"15"00061) (Антон Буздин, Дмитрий

пути может служить для дальнейшей разработки

Камашев, Ульяна Владимирова, Максим Соро"

молекулярно"диагностических инструментов

кин, Мария Сунцова) и исследовательской

для раннего выявления пациентов, не отвечаю"

программой OmicsWay в области онкологии.

щих на HER2"таргетную терапию. Этот путь со"

Конфликт интересов. Авторы М. Сорокин и

держит 14 генов; таким образом, такой диагнос"

А. Буздин работают в компании OmicsWay

тический инструмент может основываться на

Corp., США. Это исследование получило фи"

RT"PCR, таргетном РНК"секвенировании, под"

нансирование от компании Omicsway Corp.,

ходе NanoString или любой другой платформе

США. Компания принимала участие в анализе

для профилирования экспрессии генов. Тем не

данных, их интерпретации и написании текста.

менее для продвижения по этому пути потребу"

Компания не принимала участия в разработке

ется дальнейшая клиническая валидация этого

дизайна исследования, сборе данных и решении

подхода.

опубликовать данную статью. Остальные авто"

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

903

ры заявляют, что исследование проводилось в

нии и публикацию его результатов в обезличен"

отсутствие каких"либо коммерческих или фи"

ной форме. Форма информированного согласия

нансовых отношений, которые могут быть ис"

и дизайн исследования были одобрены этичес"

толкованы как потенциальный конфликт инте"

кими комитетами ГБУЗ Республики Карелия

ресов.

«Республиканский онкологический диспансер»

Соблюдение этических норм. От всех пациен"

(г. Петрозаводск) и Многопрофильного медици"

тов, биоматериал которых был включен в кли"

нского центра «ВитаМед» (г. Москва).

ническое исследование NCT03521245, озаглав"

Дополнительные материалы. Приложение к

ленное «Маркеры активации молекулярных пу"

статье на английском языке опубликовано на

тей, прогнозирующие эффективность терапии

сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) (http://

трастузумабом HER2"позитивного рака молоч"

protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) и на сайте изда"

ной железы», было получено информированное

тельства Springer (https://link.springer.com/

добровольное согласие на участие в исследова"

journal/10541), том 85, вып. 7, 2020.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F.,

(2017) Do all patients with advanced HER2 positive breast

Zhou, J. Y., Ma, Y., Hung, G., Robinson, R. A., Harris, C.,

cancer need upfront"chemo when receiving trastuzumab?

El"Naggar, A., Slamon, D. J., Phillips, R. N., Ross, J. S.,

Randomized phase III trial SAKK 22/99, Ann. Oncol., 28,

Wolman, S. R., and Flom, K. J. (1997) HER"2/neu gene

305"312, doi: 10.1093/annonc/mdw622.

amplification characterized by fluorescence in situ

Schmid, S., Klingbiel, D., Aebi, S., Goldhirsch, A.,

hybridization: poor prognosis in node"negative breast car"

Mamot, C., Munzone, E., Nolè, F., Oehlschlegel, C.,

cinomas, J. Clin. Oncol., 15, 2894"2904, doi: 10.1200/JCO.

Pagani, O., Pestalozzi, B., Rochlitz, C., Thürlimann, B.,

1997.15.8.2894.

von Moos, R., Weder, P., Zaman, K., and Ruhstaller, T.

Slamon, D. J., Clark, G. M., Wong, S. G., Levin, W. J.,

(2019) Long"term responders to trastuzumab monotherapy

Ullrich, A., and McGuire, W. L. (1987) Human breast

in first"line HER"2+ advanced breast cancer: characteris"

cancer: correlation of relapse and survival with amplifica"

tics and survival data, BMC Cancer, 19, 902, doi: 10.1186/

tion of the HER"2/neu oncogene, Science, 235, 177"182,

s12885"019"6105"3.

doi: 10.1126/science.3798106.

Zhu, X., and Verma, S. (2015) Targeted therapy in her2"

Hammond, M. E. H., Hayes, D. F., Dowsett, M.,

positive metastatic breast cancer: a review of the literature,

Allred, D. C., Hagerty, K. L., et al. (2010) American

Curr. Oncol., 22, S19"28, doi: 10.3747/co.22.2363.

Society of Clinical Oncology/College of American

10.

Slamon, D. J., Leyland"Jones, B., Shak, S., Fuchs, H.,

Pathologists guideline recommendations for immunohisto"

Paton, V., Bajamonde, A., Fleming, T., Eiermann, W.,

chemical testing of estrogen and progesterone receptors in

Wolter, J., Pegram, M., Baselga, J., and Norton, L. (2001)

breast cancer, Arch. Pathol. Lab. Med., 134, 907"922,

Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against

doi: 10.1043/1543"2165"134.6.907.

HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses

Lesurf, R., Griffith, O. L., Griffith, M., Hundal, J., Trani, L.,

HER2, N. Engl. J. Med., 344, 783"792, doi: 10.1056/

Watson, M. A., Aft, R., Ellis, M. J., Ota, D., Suman, V. J.,

NEJM200103153441101.

Meric"Bernstam, F., Leitch, A. M., Boughey, J. C.,

11.

Buzdin, A., Sorokin, M., Garazha, A., Glusker, A.,

Unzeitig, G., Buzdar, A. U., Hunt, K. K., and Mardis, E.

Aleshin, A., Poddubskaya, E., Sekacheva, M., Kim, E.,

R. (2017) Genomic characterization of HER2"positive

Gaifullin, N., Giese, A., Seryakov, A., Rumiantsev, P.,

breast cancer and response to neoadjuvant trastuzumab

Moshkovskii, S., and Moiseev, A. (2019) RNA sequencing

and chemotherapy"results from the ACOSOG Z1041

for research and diagnostics in clinical oncology, Semin.

(Alliance) trial, Ann. Oncol., 28, 1070"1077, doi: 10.1093/

Cancer Biol., doi: 10.1016/j.semcancer.2019.07.010.

annonc/mdx048.

12.

Artcibasova, A. V., Korzinkin, M. B., Sorokin, M. I.,

Buzdin, A., Sorokin, M., Garazha, A., Sekacheva, M.,

Shegay, P. V., Zhavoronkov, A. A., Gaifullin, N.,

Kim, E., Zhukov, N., Wang, Y., Li, X., Kar, S., Hartmann, C.,

Alekseev, B. Y., Vorobyev, N. V., Kuzmin, D. V., Kaprin, А. D.,

Samii, A., Giese, A., and Borisov, N. (2018) Molecular

Borisov, N. M., and Buzdin, A. A. (2016) MiRImpact, a

pathway activation - New type of biomarkers for tumor

new bioinformatic method using complete microRNA

morphology and personalized selection of target drugs,

expression profiles to assess their overall influence on the

Semin. Cancer Biol.,

53,

110"124, doi:

10.1016/

activity of intracellular molecular pathways, Cell Cycle, 15,

j.semcancer.2018.06.003.

689"698, doi: 10.1080/15384101.2016.1147633.

Artemov, A., Aliper, A., Korzinkin, M., Lezhnina, K.,

13.

Buzdin, A. A., Prassolov, V., Zhavoronkov, A. A., and

Jellen, L., Zhukov, N., Roumiantsev, S., Gaifullin, N.,

Borisov, N. M. (2017) Bioinformatics meets biomedicine:

Zhavoronkov, A., Borisov, N., and Buzdin, A. (2015) A

OncoFinder, a quantitative approach for interrogating

method for predicting target drug efficiency in cancer

molecular pathways using gene expression data, Methods

based on the analysis of signaling pathway activation,

Mol. Biol., 1613, 53"83, doi: 10.1007/978"1"4939"7027"

Oncotarget, 6, 29347"29356, doi: 10.18632/oncotarget.

8_4.

5119.

14.

Borisov, N. M., Terekhanova, N. V., Aliper, A. M.,

Pagani, O., Klingbiel, D., Ruhstaller, T., Nolè, F.,

Venkova, L. S., Smirnov, P. Y., Roumiantsev, S.,

Eppenberger, S., Oehlschlegel, C., Bernhard, J., Brauchli, P.,

Korzinkin, M. B., Zhavoronkov, A. A., and Buzdin, A. A.

Hess, D., Mamot, C., Munzone, E., Pestalozzi, B.,

(2014) Signaling pathways activation profiles make better

Rabaglio, M., Aebi, S., Ribi, K., Rochlitz, C., Rothgiesser, K.,

markers of cancer than expression of individual genes,

Thürlimann, B., von Moos, R., Zaman, K., Goldhirsch, A.,

Oncotarget, 5, 10198"10205, doi: 10.18632/oncotarget.

and Swiss Group for Clinical Cancer Research (SAKK)

2548.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

904

СОРОКИН и др.

15.

Buzdin, A., Sorokin, M., Poddubskaya, E., and Borisov, N.

25.

Howlader, N., Cronin, K. A., Kurian, A. W., and

(2019) High"throughputm data now complement tran"

Andridge, R. (2018) Differences in breast cancer survival

scriptomic profiling: advances in molecular pathway acti"

by molecular subtypes in the United States, Cancer

vation analysis approach in cancer biology, Cancer Inform.,

Epidemiol. Biomarkers Prev., 27, 619"626, doi: 10.1158/

18, 1176935119838844, doi: 10.1177/1176935119838844.

1055"9965.EPI"17"0627.

16.

Zolotovskaia, M. A., Sorokin, M. I., Roumiantsev, S. A.,

26.

Prat, A., Carey, L. A., Adamo, B., Vidal, M., Tabernero, J.,

Borisov, N. M., and Buzdin, A. A. (2018) Pathway instabil"

Cortés, J., Parker, J. S., Perou, C. M., and Baselga, J.

ity is an effective new mutation"based type of cancer bio"

(2014) Molecular features and survival outcomes of the

markers, Front. Oncol., 8, 658, doi: 10.3389/fonc.2018.

intrinsic subtypes within HER2"positive breast cancer, J.

00658.

Natl. Cancer Inst., 106, doi: 10.1093/jnci/dju152.

17.

Lezhnina, K., Kovalchuk, O., Zhavoronkov, A. A.,

27.

Dobin, A., Davis, C. A., Schlesinger, F., Drenkow, J.,

Korzinkin, M. B., Zabolotneva, A. A., Shegay, P. V.,

Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and

Sokov, D. G., Gaifullin, N. M., Rusakov, I. G., Aliper, A. M.,

Gingeras, T. R. (2013) STAR: ultrafast universal RNA"seq

Roumiantsev, S. A., Alekseev, B. Y., Borisov, N. M., and

aligner, Bioinformatics,

29,

15"21, doi:

10.1093/

Buzdin, A. A. (2014) Novel robust biomarkers for human

bioinformatics/bts635.

bladder cancer based on activation of intracellular signaling

28.

Love, M. I., Huber, W., and Anders, S. (2014) Moderated

pathways, Oncotarget, 5, 9022"9032, doi: 10.18632/

estimation of fold change and dispersion for RNA"seq data

oncotarget.2493.

with DESeq2, Genome Biol., 15, 550, doi: 10.1186/s13059"

18.

Ozerov, I. V., Lezhnina, K. V., Izumchenko, E., Artemov, A. V.,

014"0550"8.

Medintsev, S., Vanhaelen, Q., Aliper, A., Vijg, J.,

29.

Sorokin, M., Kholodenko, R., Suntsova, M., Malakhova, G.,

Osipov, A. N., Labat, I., West, M. D., Buzdin, A.,

Garazha, A., Kholodenko, I., Poddubskaya, E., Lantsov, D.,

Cantor, C. R., Nikolsky, Y., Borisov, N., Irincheeva, I.,

Stilidi, I., Arhiri, P., Osipov, A., and Buzdin, A. (2018)

Khokhlovich, E., Sidransky, D., Camargo, M. L., and

Oncobox bioinformatical platform for selecting potentially

Zhavoronkov, A. (2016) In silico Pathway Activation

effective combinations of target cancer drugs using high"

Network Decomposition Analysis (iPANDA) as a method

throughput gene expression data, Cancers,

10,

for biomarker development, Nat. Commun., 7, 13427,

doi: 10.3390/ cancers10100365.

doi: 10.1038/ncomms13427.

30.

Croft, D., Mundo, A. F., Haw, R., Milacic, M., Weiser, J.,

19.

Buzdin, A. A., Zhavoronkov, A. A., Korzinkin, M. B.,

Wu, G., Caudy, M., Garapati, P., Gillespie, M.,

Roumiantsev, S. A., Aliper, A. M., Venkova, L. S.,

Kamdar, M. R., Jassal, B., Jupe, S., Matthews, L., May, B.,

Smirnov, P. Y., and Borisov, N. M. (2014) The OncoFinder

Palatnik, S., Rothfels, K., Shamovsky, V., Song, H.,

algorithm for minimizing the errors introduced by

Williams, M., Birney, E., Hermjakob, H., Stein, L., and

the high"throughput methods of transcriptome ana"

D’Eustachio, P.(2014) The Reactome pathway knowledge"

lysis, Front. Mol. Biosci., 1, 8, doi: 10.3389/fmolb.2014.

base, Nucleic Acids Res., 42, D472"477, doi: 10.1093/

00008.

nar/gkt1102.

20.

Borisov, N., Suntsova, M., Sorokin, M., Garazha, A.,

31.

Schaefer, C. F., Anthony, K., Krupa, S., Buchoff, J., Day, M.,

Kovalchuk, O., Aliper, A., Ilnitskaya, E., Lezhnina, K.,

Hannay, T., and Buetow, K. H. (2009) PID: the Pathway

Korzinkin, M., Tkachev, V., Saenko, V., Saenko, Y.,

Interaction Database, Nucleic Acids Res., 37, D674"D679,

Sokov, D. G., Gaifullin, N. M., Kashintsev, K.,

doi: 10.1093/nar/gkn653.

Shirokorad, V., Shabalina, I., Zhavoronkov, A., Mishra, B.,

32.

Kanehisa, M. (2000) KEGG: Kyoto Encyclopedia of

Cantor, C. R., and Buzdin, A. (2017) Data aggregation at

Genes and Genomes, Nucleic Acids Res., 28, 27"30,

the level of molecular pathways improves stability of exper"

doi: 10.1093/nar/28.1.27.

imental transcriptomic and proteomic data, Cell Cycle, 16,

33.

Romero, P., Wagg, J., Green, M. L., Kaiser, D.,

1810"1823, doi: 10.1080/15384101.2017.1361068.

Krummenacker, M., and Karp, P. D. (2005) Computational

21.

Zhu, Q., Izumchenko, E., Aliper, A. M., Makarev, E., Paz, K.,

prediction of human metabolic pathways from the com"

Buzdin, A. A., Zhavoronkov, A. A., and Sidransky, D.

plete human genome, Genome Biol., 6, R2, doi: 10.1186/

(2015) Pathway activation strength is a novel independent

gb"2004"6"1"r2.

prognostic biomarker for cetuximab sensitivity in colorec"

34.

Nishimura, D. (2001) BioCarta, Biotech Software and

tal cancer patients, Hum. Genome Var.,

15009,

Internet

Report,

117"120, doi:

10.1089/

doi: 10.1038/hgv.2015.9.

152791601750294344.

22.

Poddubskaya, E. V., Baranova, M. P., Allina, D. O.,

35.

Igolkina, A. A., Zinkevich, A., Karandasheva, K. O.,

Sekacheva, M. I., Makovskaia, L. A., Kamashev, D. E.,

Popov, A. A., Selifanova, M. V., Nikolaeva, D., Tkachev, V.,

Suntsova, M. V., Barbara, V. S., Kochergina"Nikitskaya, I. N.,

Penzar, D., Nikitin, D. M., and Buzdin, A.

(2019)

and Aleshin, A. A. (2019) Personalized prescription of ima"

H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac, H3K27me3 and

tinib in recurrent granulosa cell tumor of the ovary: case

H3K9me3 histone tags suggest distinct regulatory evolu"

report, Cold Spring Harb. Mol. Case Stud., 5, doi: 10.1101/

tion of open and condensed chromatin landmarks, Cells, 8,

mcs.a003434.

doi: 10.3390/cells8091034.

23.

Poddubskaya, E. V., Baranova, M. P., Allina, D. O.,

36.

Marggraf, M. B., Panteleev, P. V., Emelianova, A. A.,

Smirnov, P. Y., Albert, E. A., Kirilchev, A. P., Aleshin, A. A.,

Sorokin, M. I., Bolosov, I. A., Buzdin, A. A., Kuzmin, D. V.,

Sekacheva, M. I., and Suntsova, M. V. (2018) Personalized

and Ovchinnikova, T. V. (2018) Cytotoxic potential of the

prescription of tyrosine kinase inhibitors in unresectable

novel horseshoe crab peptide polyphemusin III, Mar.

metastatic cholangiocarcinoma, Exp. Hematol. Oncol., 7,

Drugs, 16, doi: 10.3390/md16120466.

21, doi: 10.1186/s40164"018"0113"x.

37.

Buzdin, A., Garazha, A., Sorokin, M., Glusker, A.,

24.

Poddubskaya, E., Bondarenko, A., Boroda, A., Zotova, E.,

Aleshin, A., Allina, D., Suntsova, M., Tkachev, V., Borger, P.,

Glusker, A., Sletina, S., Makovskaia, L., Kopylov, P.,

Borisov, N., and Gaifullin, N. (2019) RNA sequencing

Sekacheva, M., Moisseev, A., and Baranova, M. (2019)

analysis for profiling activation of cancer"associated mole"

Transcriptomics"guided personalized prescription of tar"

cular pathways, J. Clin. Oncol., 37, e13032"e13032,

geted therapeutics for metastatic ALK"positive lung cancer

doi: 10.1200/jco.2019.37.15_suppl.e13032.

case following recurrence on ALK inhibitors, Front. Oncol.,

38.

Green, D. M., Swets, J. A. (1966) Signal Detection Theory

9, 1026, doi: 10.3389/fonc.2019.01026.

and Psychophysics, New York.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАСТУЗУМАБА ПРИ РМЖ

905

39.

Chen, L., Zhou, Y., Tang, X., Yang, C., Tian, Y., Xie, R.,

49.

SEQC/MAQC"III Consortium (2014) A comprehensive

Chen, T., Yang, J., Jing, M., Chen, F., Wang, C., Sun, H.,

assessment of RNA"seq accuracy, reproducibility and

and Huang, Y. (2019) EGFR mutation decreases FDG

information content by the Sequencing Quality Control

uptake in non"small cell lung cancer via the NOX4/

Consortium, Nat. Biotechnol., 32, 903"914, doi: 10.1038/

ROS/GLUT1 axis, Int. J. Oncol.,

54,

370"380,

nbt.2957.

doi: 10.3892/ijo.2018.4626.

50.

Suntsova, M., Gaifullin, N., Allina, D., Reshetun, A., Li, X.,

40.

Tanioka, M., Fan, C., Parker, J. S., Hoadley, K. A., Hu, Z.,

Mendeleeva, L., Surin, V., Sergeeva, A., Spirin, P.,

Li, Y., Hyslop, T. M., Pitcher, B. N., Soloway, M. G.,

Prassolov, V., Morgan, A., Garazha, A., Sorokin, M., and

Spears, P. A., Henry, L. N., Tolaney, S., Dang, C. T.,

Buzdin, A. (2019) Atlas of RNA sequencing profiles for

Krop, I. E., Harris, L. N., Berry, D. A., Mardis, E. R.,

normal human tissues, Sci. Data, 6, 36, doi: 10.1038/

Winer, E. P., Hudis, C. A., Carey, L. A., and

s41597"019"0043"4.

Perou, M.(2018) Integrated analysis of RNA and DNA

51.

Kumar, N., Prasad, P., Jash, E., Saini, M., Husain, A.,

from the phase III trial CALGB 40601 identifies predictors

Goldman, A., and Sehrawat, S. (2018) Insights into

of response to trastuzumab"based neoadjuvant chemother"

exchange factor directly activated by cAMP (EPAC) as

apy in HER2"positive breast cancer, Clin. Cancer Res., 24,

potential target for cancer treatment, Mol. Cell. Biochem.,

5292"5304, doi: 10.1158/1078"0432.CCR"17"3431.

447, 77"92, doi: 10.1007/s11010"018"3294"z.

41.

Liu, T., Cheng, G., Kang, X., Xi, Y., Zhu, Y., Wang, K.,

52.

Capitani, M., and Sallese, M. (2009) The KDEL receptor:

Sun, C., Ye, J., Li, P., and Yin, H. (2018) Noninvasively

new functions for an old protein, FEBS Lett., 583, 3863"

evaluating the grading and IDH1 mutation status of diffuse

3871, doi: 10.1016/j.febslet.2009.10.053.

gliomas by three"dimensional pseudo"continuous arterial

53.

Maisel, S. A., and Schroeder, J. (2019) Wrong place at the

spin labeling and diffusion"weighted imaging,

wrong time: how retrograde trafficking drives cancer

Neuroradiology, 60, 693"702, doi: 10.1007/s00234"018"

metastasis through receptor mislocalization, J. Cancer

2021"5.

Metastasis Treat., 2019, doi: 10.20517/2394"4722.2018.82.

42.

Boyd, J. C. (1997) Mathematical tools for demonstrating

54.

Valabrega, G., Montemurro, F., Sarotto, I., Petrelli, A.,

the clinical usefulness of biochemical markers, Scand. J.

Rubini, P., Tacchetti, C., Aglietta, M., Comoglio, P. M.,

Clin. Lab. Invest. Suppl., 227, 46"63.

and Giordano, S. (2005) TGFα expression impairs

43.

Hendricks, W. P. D., Briones, N., Halperin, R. F., Facista, S.,

Trastuzumab"induced HER2 downregulation, Oncogene,

Heaton, P. R., Mahadevan, D., and Kim, S. (2019) PD"1"

24, 3002"3010, doi: 10.1038/sj.onc.1208478.

associated gene expression signature of neoadjuvant

55.

Ahmad, A. (2019) Current updates on trastuzumab resis"

trastuzumab"treated tumors correlates with patient survival

tance in HER2 overexpressing breast cancers, Adv. Exp.

in HER2"positive breast cancer, Cancers, 11, doi: 10.3390/

Med. Biol., 1152, 217"228, doi: 10.1007/978"3"030"20301"

cancers11101566.

6_10.

44.

Okuma, H. S., Koizumi, F., Hirakawa, A., Nakatochi, M.,

56.

Adamczyk, A., Kruczak, A., Harazin"Lechowska, A.,

Komori, O., Hashimoto, J., Kodaira, M., Yunokawa, M.,

Ambicka, A., Grela"Wojewoda, A., Domagala"Haduch,

Yamamoto, H., Yonemori, K., Shimizu, C., Fujiwara, Y.,

M., Janecka"Widla, A., Majchrzyk, K., Cichocka, A., Rys, J.,

and Tamura, K. (2016) Clinical and microarray analysis of

and Niemiec, J. (2018) Relationship between HER2 gene

breast cancers of all subtypes from two prospective preop"

status and selected potential biological features related to

erative chemotherapy studies, Br. J. Cancer, 115, 411"419,

trastuzumab resistance and its influence on survival of

doi: 10.1038/bjc.2016.184.

breast cancer patients undergoing trastuzumab adjuvant

45.

Popovici, V., Chen, W., Gallas, B. G., Hatzis, C., Shi, W.,

treatment, Onco Targets Ther.,

11,

4525"4535,

Samuelson, F. W., Nikolsky, Y., Tsyganova, M., Ishkin, A.,

doi: 10.2147/OTT.S166983.

Nikolskaya, T., Hess, K. R., Valero, V., Booser, D.,

57.

Hanker, A. B., Garrett, J. T., Estrada, M. V., Moore, P. D.,

Delorenzi, M., Hortobagyi, G. N., Shi, L., Symmans, W. F.,

Ericsson, P. G., et al. (2017) HER2"overexpressing breast

and Pusztai, L. (2010) Effect of training"sample size and

cancers amplify FGFR signaling upon acquisition of resis"

classification difficulty on the accuracy of genomic predic"

tance to dual therapeutic blockade of HER2, Clin. Cancer

tors, Breast Cancer Res., 12, R5, doi: 10.1186/bcr2468.

Res., 23, 4323"4334, doi: 10.1158/1078"0432.CCR"16"

46.

Shi, L., Campbell, G., Jones, W. D., Campagne, F., Wen, Z.,

2287.

et al. (2010) The MicroArray Quality Control (MAQC)"II

58.

Lenz, G., Hamilton, A., Geng, S., Hong, T., Kalkum, M.,

study of common practices for the development and vali"

Momand, J., Kane, S. E., and Huss, J. M. (2018) t"Darpp

dation of microarray"based predictive models, Nat.

activates IGF"1R signaling to regulate glucose metabolism

Biotechnol., 28, 827"838, doi: 10.1038/nbt.1665.

in trastuzumab"resistant breast cancer cells, Clin. Cancer

47.

Sonnenblick, A., Brohée, S., Fumagalli, D., Rothé, F.,

Res., 24, 1216"1226, doi: 10.1158/1078"0432.CCR"17"

Vincent, D., Ignatiadis, M., Desmedt, C., Salgado, R.,

0824.

Sirtaine, N., Loi, S., Neven, P., Loibl, S., Denkert, C.,

59.

Martinez, V. G., O’Neill, S., Salimu, J., Breslin, S.,

Joensuu, H., Piccart, M., and Sotiriou, C.

(2015)

Clayton, A., Crown, J., and O’Driscoll, L.

(2017)

Integrative proteomic and gene expression analysis identi"

Resistance to HER2"targeted anti"cancer drugs is associat"

fy potential biomarkers for adjuvant trastuzumab resis"

ed with immune evasion in cancer cells and their derived

tance: analysis from the Fin"her phase III randomized

extracellular vesicles, Oncoimmunology, 6, e1362530,

trial, Oncotarget,

30306"30316, doi:

10.18632/

doi: 10.1080/2162402X.2017.1362530.

oncotarget.5080.

60.

Van Rooijen, J. M., Qiu, S. Q., Timmer"Bosscha, H., van der

48.

Nault, R., Fader, K. A., and Zacharewski, T. (2015) RNA"

Vegt, B., Boers, J. E., Schroder, C. P., and de Vries, E. G. E.

Seq versus oligonucleotide array assessment of dose"

(2018) Androgen receptor expression inversely correlates

dependent TCDD"elicited hepatic gene expression in

with immune cell infiltration in human epidermal growth

mice, BMC Genomics, 16, 373, doi: 10.1186/s12864"015"

factor receptor 2"positive breast cancer, Eur. J. Cancer,

1527"z.

103, 52"60, doi: 10.1016/j.ejca.2018.08.001.

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020

906

СОРОКИН и др.

MOLECULAR PATHWAY ACTIVATION MARKERS ARE LINKED

WITH EFFICACY OF TRASTUZUMAB THERAPY IN METASTATIC

HER2 POSITIVE BREAST CANCER BETTER THAN INDIVIDUAL

GENE EXPRESSION LEVELS*

M. Sorokin^1,2,3, K. Ignatev⁴, V. Barbara⁴, U. Vladimirova^1,3, A. Muraveva³, M. Suntsova¹,

N. Gaifullin⁵, I. Vorotnikov⁶, D. Kamashev^1,3, A. Bondarenko⁷, M. Baranova^7,8,

E. Poddubskaya^3,7, and A. Buzdin^1,2,3,9**

¹ Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, 117997 Moscow, Russia; EGmail: buzdin@oncobox.com

² OmicsWay Corp., 91789 Walnut, CA, USA

³ Institute of Molecular Medicine of the Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University),

119991 Moscow, Russia

⁴ Republican Oncological Dispensary of Karelia Republic, 185016 Petrozavodsk, Russia

⁵ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Fundamental Medicine, 119991 Moscow, Russia

⁶ Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation,

115478 Moscow, Russia

⁷ VitaMed Medical Center, 121309 Moscow, Russia

⁸ Russian Scientific Center of Surgery named after B. V. Petrovsky, 119991 Moscow, Russia

⁹ Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University),

141701 Dolgoprudny, Moscow Region, Russia

Received March 31, 2020

Received May 29, 2020

Accepted May 31, 2020

Increased expression or amplification of HER2 receptor tyrosine kinase gene ERBB2 is well"known and widely used

as a prognostic biomarker of breast cancer (BC) response to the targeted treatment with trastuzumab and its analogs.

Considering that part of the BC patients overexpressing HER2 does not respond to trastuzumab, clinical trial

NCT03521245 was initiated to identify additional gene expression and molecular pathway activation response bio"

markers to trastuzumab treatment in HER2"positive BC. Using RNA sequencing gene expression in 23 formalin"

fixed, paraffin embedded HER2 positive BC tissue blocks from patients who either responded or not responded to

trastuzumab treatment was profiled. Differentially regulated genes and molecular pathways were identified in the

groups of trastuzumab responders and non"responders. These results were next compared with the 42 previously pub"

lished BC trastuzumab responder and non"responder RNA sequencing profiles from the clinical trials NCT00513292

and NCT00353483. No correlation was observed between the response status and the expression levels of ERBB2 gene

in the HER2 positive BC samples. Analysis of the differentially expressed genes and molecular pathways in the com"

bined dataset revealed 15/27 commonly up/down regulated genes and 15/25 pathways, respectively. However, only the

intersection of molecular pathways upregulated in trastuzumab responders vs nonGresponders was statistically signifi"

cantly enriched compared to the random expectation model. A classifier built using the most significantly upregulat"

ed molecular pathway—cAMP Pathway Protein Retention—demonstrated the best performance for prediction of the

HER2 positive BC response to trastuzumab for both our experimental and previously reported data. This pathway also

predicted time to recurrence in the combined dataset with Log"rank p"value 0.041.

Keywords: breast cancer, HER2, ERBB2, transcriptomics, RNA sequencing, trastuzumab, targeted therapy, personal"

ized medicine, NCT03521245

БИОХИМИЯ том 85 вып. 7 2020