БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 8, с. 1302 - 1312

УДК 57.044

АГОНИСТ КОНСТИТУТИВНОГО АНДРОСТАНОВОГО РЕЦЕПТОРА

ИНИЦИИРУЕТ МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ,

НЕОБХОДИМУЮ ДЛЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ

А.Д. Рогачев¹, Е.А. Прокопьева^1,2, Л.Ф. Гуляева^1,2, В.О. Пустыльняк^1,2*

¹ Новосибирский национальный исследовательский государственный университет,

630090 Новосибирск, Россия; электронная почта: pustylnyak@post.nsu.ru

² Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины,

630117 Новосибирск, Россия

Поступила в редакцию 10.04.2023

После доработки 22.05.2023

Принята к публикации 24.05.2023

Активация конститутивного андростанового рецептора (CAR, NR1I3) химическими соединениями

вызывает гиперплазию печени у грызунов. Чаще всего для изучения химически индуцированной

гиперплазии печени и пролиферации гепатоцитов in vivo используется 1,4-бис[2-(3,5-дихлорпири-

дилокси)] бензол (TCPOBOP), агонист мышиного CAR. TCPOBOP является мощным химическим

митогеном, который вызывает гиперплазию печени мышей. В последние годы накоплено много

данных о транскрипционных изменениях, характеризующих TCPOBOP-индуцированную проли-

ферацию гепатоцитов. Однако данных о метаболических потребностях гепатоцитов, делящихся

при воздействии ксенобиотика, немного. В настоящем исследовании мы использовали техноло-

гию высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии в сочетании со ста-

тистическим анализом для описания изменения профиля метаболитов малых биомолекул, чтобы

выявить ключевые метаболические изменения в печени самцов мышей после введения TCPOBOP.

Анализ метаболитов в печени мышей позволил обнаружить биохимические процессы, активация

которых осуществляется при воздействии химического митогена TCPOBOP. Так, сравнение мета-

боломных профилей показало, что воздействие ТСРОВОР приводит к изменению биохимических

процессов, которые имеют отношение к метаболизму нуклеотидов, аминокислот и энергетических

субстратов. Наши результаты позволяют сделать вывод о том, что агонист CAR инициирует внут-

риклеточную программу, которая способствует глобальной скоординированной метаболической

активности, необходимой для пролиферации гепатоцитов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: конститутивный андростановый рецептор, TCPOBOP, печень, гепатоцит, метабо-

ломика.

DOI: 10.31857/S032097252308002X, EDN: IHUBDC

ВВЕДЕНИЕ

широким набором функций в гепатоцитах [2].

Так, например, активация CAR значительно

Конститутивный андростановый рецеп-

усиливает пролиферацию гепатоцитов с по-

тор (CAR, NR1I3) является членом суперсе-

следующей гиперплазией печени мышей [3].

мейства ядерных рецепторов. Первоначально

Более того, показано, что активация CAR

CAR был охарактеризован как ксеносенсор,

химическими соединениями вызывает не

который в ответ на воздействие ксенобиотиков

только гиперплазию печени у грызунов, но

индуцирует их метаболизм и элиминацию [1].

и может значительно улучшить регенерацию

Маркерными генами-мишенями для CAR яв-

печени грызунов после экстремальных резек-

ляются гены, кодирующие цитохром Р450

ций (более 80% паренхимы), тем самым пред-

подсемейства 2В (CYP2B). Впоследствии было

отвращая возникновение печеночной недос-

показано, что CAR обладает гораздо более таточности из-за дефицита ткани органа [4].

Принятые сокращения: CAR - конститутивный андростановый рецептор; CYP2B - ген, кодирующий цитохром Р450

подсемейства 2В; TCPOBOP - 1,4-бис[2-(3,5-дихлорпиридилокси)] бензол.

* Адресат для корреспонденции.

1302

АГОНИСТ CAR ИЗМЕНЯЕТ МЕТАБОЛОМ В ПЕЧЕНИ

1303

Поэтому расширение научных данных, опи-

бирск, Россия). Животные прошли пятиднев-

сывающих молекулярные и биохимические

ный период акклиматизации со свободным

процессы, сопряженные с активацией проли-

доступом к пище и воде. Животным одно-

ферации гепатоцитов при участии CAR, может

кратно внутрибрюшинно вводили TCPOBOP

позволить сделать выводы о возможности кли-

(3 мг/кг массы тела), растворенный в пище-

нического использования агонистов этого ре-

вом рафинированном подсолнечном масле.

цептора для профилактики печеночной недос-

Контрольные животные получали равный

таточности при резекции или трансплантации

объем (100 мкл) подсолнечного масла. Мышей

органа.

декапитировали через

72 ч после введения

Большинство исследований in vivo, посвя-

TCPOBOP (n = 12) или подсолнечного масла

щенных CAR-опосредованной пролиферации

(n = 12). При заборе органов осуществляли

гепатоцитов, были выполнены с использова-

взвешивание печени, и с учетом массы жи-

нием 1,4-бис[2-(3,5-дихлорпиридилокси)] бен-

вотного вычисляли индекс ее относительной

зола (TCPOBOP), агониста мышиного CAR.

массы («масса печени/масса тела»). Значение

TCPOBOP является мощным химическим ми-

индекса относительной массы печени одного

тогеном у мышей, который вызывает быструю

из контрольных животных принималось за 1.

гиперплазию печени [3]. В последние годы на-

Гистологическое исследование тканей пече-

коплено много данных о транскрипционных

ни. Образцы печени фиксировали в 10%-ном

изменениях, характеризующих TCPOBOP-ин-

растворе нейтрального формалина, затем

дуцированную пролиферацию гепатоцитов [5,

обезвоживали по стандартной методике [8]

6]. Однако данных о метаболических измене-

и заливали в парафин. Парафиновые срезы

ниях, происходящих в гепатоцитах, делящих-

(4-5 мкм) получали с помощью ротацион-

ся при воздействии ксенобиотиков, немного.

ного микротома HM 340E («CarlZeiss», Гер-

Печень является одним из наиболее метабо-

мания). Срезы, полученные из ткани печени

лически активных органов в организме и иг-

мышей, окрашивали гематоксилином и эози-

рает важную роль в регулировании различных

ном (H&E). Исследование гистологических

метаболических процессов. Метаболическое

препаратов проводили на микроскопе Axio-

ремоделирование клеток необходимо для кле-

ImagerA1 («CarlZeiss»), используя программное

точного деления, и гепатоциты оснащены гиб-

обеспечение AxioVision (rel. 4.12) («CarlZeiss»).

ким метаболическим механизмом, способным

Определение маркера пролиферации. Мар-

быстро адаптироваться к изменениям во время

кер пролиферации Ki67 в образцах печени

пролиферации [7]. Ранее уже было показано,

определяли с использованием иммуногистохи-

что воздействие TCPOBOP модулирует метабо-

мического метода и кроличьего поликлональ-

лизм глюкозы и липидов в печени грызунов [6].

ного антитела против Ki67 («Abcam», Велико-

Однако глобальные эффекты воздействия

британия). Парафиновые срезы толщиной

TCPOBOP на профиль низкомолекулярных ме-

3-4 мкм подвергали депарафинизации и ре-

таболитов в печени охарактеризованы не были.

гидратации по стандартной методике [9]. Сре-

Определение путей метаболической адап-

зы прогревали на водяной бане в 10 мМ цит-

тации, которые сопряжены с пролиферацией

ратном буфере (pH 6,0) в течение 20 мин для

гепатоцитов после воздействия агониста CAR,

демаскировки антигенов. Затем, после одно-

является основной целью настоящего иссле-

кратной промывки в дистиллированной воде

дования. Технология высокоэффективной жид-

и 10 мМ фосфатно-солевом буфере (pH 7,4),

костной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спек-

блокировали эндогенную пероксидазу в тече-

трометрии (МС) использовалась для опреде-

ние 5 мин в 3%-ной охлажденной перекиси

ления профиля малых биомолекул (сахаров,

водорода. Время экспозиции с первичными

аминокислот и нуклеотидов) для выявления

антителами против Ki67 составляло 60 мин

ключевых метаболических изменений в пе-

при комнатной температуре. Затем срезы ин-

чени мышей в ответ на введение химического

кубировали со стрептавидин-пероксидазным

митогена TCPOBOP.

комплексом, в качестве субстрата применяли

диаминобензидин. Дополнительно ядра до-

крашивали гематоксилином.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение РНК, синтез кДНК и ПЦР в ре-

жиме реального времени. Выделение суммарной

Животные, использованные в исследовании.

РНК, обратную транскрипцию РНК и ПЦР

Самцы мышей (C57BL, масса 25-30 г) были

в режиме реального времени для определе-

предоставлены Научно-исследовательским ин-

ния уровней мРНК проводили согласно ранее

ститутом нейронаук и медицины (Новоси-

опубликованному протоколу [10]. Выделение

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

304

МАЗИН и др.

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использующихся при ПЦР в режиме реального

времени для исследования относительного уровня мРНК

Ген

Прямой праймер (5′→3′)

Обратный праймер (5′→3′)

Cyp2b10

CCCAGTGTTCCACGAGACTT

GGTGCCGACAAAGAAGAGAG

Cyclind1

TGAAGGAGACCATTCCCTTG

CCACTTGAGCTTGTTCACCA

cMyc

ACGAGCACAAGCTCACCTCT

TCCAGCTCCTCCTCGAGTTA

E2f1

TCTGTACCACACAGCTGCAA

GCACAGGAAAACATCAATGG

Foxm1

TCCAAGGCAAAGACAGGAGA

GCTCCTCAACCTTAACCCGA

Mrpl46

GGGAGCAGGCATTCCTACAG

GGTCCGGTCATTTTTTTTGTCA

суммарной РНК из образцов печени мышей

10 мин. Супернатант переносили в новую поли-

проводили с использованием реагента TRIzol

пропиленовую пробирку и сушили в центри-

(«Invitrogen», США), согласно рекомендаци-

фуге-концентраторе SpeedVac («Thermo Fisher

ям производителя. Обратную транскрипцию

Scientific», США). Полученный остаток разво-

осуществляли с помощью набора RT-M-MuLV-

дили в 100 мкл реконституционного раствора

RH kit («Биолабмикс», Россия) в соответствии

вода/метанол (80/20) и подвергали метаболом-

с протоколом производителя. Для определе-

ному анализу с использованием ВЭЖХ-МС/МС.

ния уровня экспрессии исследуемых генов

Анализ ВЭЖХ-МС/МС. Хроматографичес-

проводили ПЦР в режиме реального вре-

кое разделение и анализ метаболитов проводи-

мени с использованием BioMaster HS-qPCR

ли по ранее опубликованному протоколу [12].

SYBR Blue (2×) («Биолабмикс») на амплифи-

Пробы анализировали на хроматографе

каторе CFX96™ («Bio-Rad Laboratories», США).

Shimadzu LC-20AD Prominence

(«Shimadzu

Для ПЦР использовали специфические оли-

Corporation», Япония), оснащенном автодо-

гонуклеотиды (табл.

1). Подбор специфич-

затором SIL-20AC («Shimadzu Corporation»).

ных праймеров осуществляли с использова-

Хроматографическое разделение проводили

нием онлайн-сервиса Primer-BLAST (https://

на колонке Prontosil 120-5-Amino (2,1 × 75 мм)

www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.

(«Эконова», Россия). Сбор данных проводи-

cgi?GROUP_TARGET=on). Оптимальная кон-

ли на масс-спектрометре API 6500 QTRAP

центрация всех пар праймеров в реакционной

(«AB SCIEX», США) c использованием про-

смеси составила 300 нМ. ПЦР проводили в

граммного обеспечения Analyst

1.6.2

(«AB

следующих условиях: предварительный про-

SCIEX»). Масс-спектрометрическую детекцию

грев при 95 °С - 3 мин; после этого следовали

проводили в режиме MRM в положительной и

40 основных циклов: денатурация при 95 °С -

отрицательной ионизации. Полученные хро-

15 с, отжиг при 59 °С - 20 с, элонгация при

матограммы обрабатывались в программе

72 °С - 20 с, сбор данных по флюоресценции

MultiQuantTM 2.1 Software («AB SCIEX») с

при 80 °С - 10 с. Для контроля специфичности

экспортированием данных в таблицы Microsoft

ПЦР использовали кривые плавления. Уровни

Excel. Последующий мультивариантный ана-

экспрессии мРНК рассчитывали на основе эф-

лиз и анализ биохимических путей проводи-

фективности ПЦР и Ct. Нормирование про-

лись с использованием онлайн-сервиса Metabo-

водили по гену Mrpl46. Уровень экспрессии

Analyst (http://www.metaboanalyst.ca). Анализ

гена в печени одного из контрольных живот-

биохимических путей был проведен на основе

ных принимался за 1.

данных о метаболитах, нанесенных на карту в

Подготовка проб для метаболомного иссле-

соответствии с идентификаторами Киотской

дования. Все образцы печени обрабатывали

энциклопедии генов и геномов (KEGG).

одновременно в соответствии с протоколом,

Статистическая обработка результатов. Ста-

описанным ранее Yuan et al. [11]. Образцы пе-

тистический анализ проводился с использо-

чени (20-30 мг) гомогенизировали в 500 мкл

ванием t-критерия Стьюдента. Расчеты про-

80%-ного (v/v) охлажденного метанола для

изводились с использование программного

ВЭЖХ и инкубировали в течение ночи при

обеспечения GraphPad Prism 5.0 («GraphPad

-80 °C для осаждения белка. Затем образцы

Software Inc.», США). Значение р < 0,05 счита-

центрифугировали при 4 °С и 17 000 g в течение

лось статистически значимым.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

АГОНИСТ CAR ИЗМЕНЯЕТ МЕТАБОЛОМ В ПЕЧЕНИ

1305

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ночной дольки вокруг собирательных вен. Об-

разцы из контрольной группы животных были

В первую очередь была подтверждена

без явных Ki67-положительных ядер, тогда как

TCPOBOP-опосредованная активация CAR

в образцах, полученных от ТСРОВОР-индуци-

в печени мышей путем изучения экспрессии

рованных мышей, выявлялось до 40% Ki67-по-

гена Cyp2b10, ключевого биомаркера для изме-

ложительных ядер гепатоцитов от общего чис-

рения активации CAR. Как и ожидалось, экс-

ла гепатоцитов в 5 случайно выбранных полях.

прессия гена Cyp2b10 в печени мышей увеличи-

Кроме того, воздействие TCPOBOP достовер-

лась после воздействия TCPOBOP (рис. 1, а).

но увеличивало экспрессию генов, кодирую-

Далее были проведены эксперименты по

щих регуляторы клеточного цикла, Cyclind1,

оценке гиперплазии печени при воздействии хи-

cMyc, E2f1 и Foxm1, в печени мышей по срав-

мического митогена. Увеличение экспрессии

нению с контрольными животными (рис. 1, г).

гена Cyp2b10 после воздействия ТСРОВОР со-

С помощью ВЭЖХ-МС/МС анализа об-

провождалось достоверным увеличением ин-

разцов печени были изучены различия в мета-

декса относительной массы печени, который

боломном профиле контрольных и ТСРОВОР-

определяли как масса печени по отношению

индуцированных мышей. Мультивариантный

к массе тела животного (рис. 1, б). Гистологи-

анализ полученных результатов методом анали-

ческий анализ печени мышей и иммуноокра-

за главных компонент (PCA) продемонстри-

шивание срезов печени с использованием ан-

ровал наличие различий в метаболомном

тител против Ki67 показали, что воздействие

профиле печени, вызванных воздействием

TCPOBOP усиливало митотические процессы

TCPOBOP. Проведенный анализ не показал

в гепатоцитах (рис. 1, в). Так, на срезах, полу-

перекрытия контрольной группы и группы,

ченных от ТСРОВОР-индуцированных мышей,

получавшей TCPOBOP, что указывает на чет-

наблюдались фигуры митоза, особенно среди

кую кластеризацию двух групп образцов пече-

гепатоцитов, расположенных в центре пече-

ни (рис. 2, а).

Рис. 1. Влияние TCPOBOP на мишень CAR - ген Cyp2b10 (а), размер печени (б), гистопатологию и иммуноокраши-

вание Ki67 (в) и гены, кодирующие регуляторы клеточного цикла (г). * Достоверное отличие от контрольных живот-

ных (р < 0,05). Мышей обрабатывали 1,4-бис [2-(3,5-дихлорпиридилокси)] бензолом (TC) или только подсолнечным

маслом (К)

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

1306

МАЗИН и др.

Рис. 2. Изменение метаболомного профиля в печени мышей после воздействия TCPOBOP (TC) по сравнению с кон-

трольными животными (К). a - Мультивариантный анализ методом анализа главных компонент; б - ортогональный

дискриминантный анализ методом наименьших квадратов образцов печени на основе всех метаболитов. Каждый

символ представляет один образец одной мыши. Образцы одной группы показаны одним цветом. Цветное поле пред-

ставляет 95%-ный доверительный интервал группы с кружками одного цвета. в - Вулканическая диаграмма показы-

вает метаболиты, уровень которых достоверно изменяется при воздействии TCPOBOP. Метаболиты, уровень которых

достоверно снижается, обозначены синим. Метаболиты, уровень которых достоверно повышен, обозначены красным

Дополнительно был проведен ортогональ-

30 метаболитов уровень снижался, а у 28 - по-

ный дискриминантный анализ методом наи-

вышался (рис. 2, в; табл. 2).

меньших квадратов (OPLS-DA). Данный ана-

В заключении был проведен анализ биохи-

лиз позволил лучше выделить метаболические

мических путей, на которые повлиял агонист

различия между двумя группами образцов

мышиного CAR. Результаты анализа проде-

печени мышей (рис. 2, б). Данные результаты

монстрировали перепрограммирование мета-

свидетельствуют о том, что контрольные мыши

болической сети после воздействия TCPOBOP.

и мыши, получавшие TCPOBOP, имеют раз-

Как показано на рис. 3, TCPOBOP-индуциро-

ные метаболомные профили печени. Сравне-

ванная пролиферация гепатоцитов сопрово-

ние уровней метаболитов между группами жи-

ждается изменениями в метаболизме нуклео-

вотных показало, что воздействие TCPOBOP

тидов (как пиримидиновых, так и пуриновых),

приводит к достоверному изменению уровней

метаболизме аминокислот (тирозина, глици-

58 метаболитов в печени мышей, из которых у

на, серина и треонина, глутамина и глутамата,

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

АГОНИСТ CAR ИЗМЕНЯЕТ МЕТАБОЛОМ В ПЕЧЕНИ

1307

Таблица 2. Метаболиты, уровень которых достоверно изменяется в печени мышей после воздействия TCPOBOP

TCPOBOP-опосредованное снижение уровня

TCPOBOP-опосредованное увеличение уровня

метаболит

количество раз

метаболит

количество раз

ксантиловая кислота

0,25000

2-аминооктановая кислота

1,5766

гиппуровая кислота

0,27108

никотинамид мононуклеотид

1,5854

глицерофосфохолин

0,36442

1-метилгистидин

1,5886

акадезин

0,37370

N-ацетилорнитин

1,5961

бетаин

0,39950

гуанозинмонофосфат

1,6758

лактоза

0,42146

пантотеновая кислота

1,7183

аргининосукцинат

0,42503

изобутирилглицин

1,7203

цитруллин

0,43072

дезоксиинозин

1,7443

3-метилгистидин

0,43746

уридин-5′-дифосфат

1,7756

аскорбиновая кислота

0,45287

3-фосфоглицериновая кислота

1,8045

ксантозин

0,46816

пировиноградная кислота

1,8142

гипоксантин

0,48508

2-изопропилмалат

1,8303

инозин

0,48643

уреидосукцинат

1,8442

1-метилникотинамид

0,49199

цитидин

1,8486

оротидиловая кислота

0,52455

триптофанол

1,8527

аденозин

0,52988

глутамат

1,9878

3-гидроксиантраниловая кислота

0,56541

D-глицеральдегид-3-фосфат

2,0244

ксантин

0,57976

фосфоенолпируват

2,0415

5-аминоимидазол-4-карбоксамид

гипотаурин

0,59937

2,0675

рибонуклеотид

L-серин

0,60573

дезоксиуридинмонофосфат (dUMP)

2,0697

N-ацетил-L-аланин

0,62012

спермидин

2,1151

дофамин

0,62094

L-кинуренин

2,1205

метанефрин

0,62424

уреидопропионат

2,2277

имидазолуксусная кислота

0,63156

аллантоиновая кислота

2,2815

5′-метилтиоаденозин

0,63666

глутатиондисульфид

2,6520

фосфорилхолин

0,64681

глюконовая кислота

3,0366

дезокситимидинмонофосфат

2-арахидоноилглицерин

0,64719

4,2578

(dTMP)

гуанин

0,64855

D-седогептулозо-7-фосфат

4,4718

O-ацетилсерин

0,65384

цистин

0,65976

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

1308

МАЗИН и др.

точного цикла (Cyclind1, cMyc, E2f1 и Foxm1),

что коррелировало с увеличением массы пече-

ни животных. Известно, что некоторые регу-

ляторы клеточного цикла, такие как Cyclin D1

и E2F1, принимают участие в регуляции экс-

прессии генов, кодирующих метаболические

ферменты, и тем самым контролируют метабо-

лизм [14]. Эти ферменты участвуют в разнооб-

разных биохимических путях синтеза метабо-

лических предшественников для роста клеток.

Пролиферация гепатоцитов требует уве-

личения внутриклеточной биомассы [7]. Соот-

ветственно, производство белков, липидов и

нуклеиновых кислот необходимо для успешно-

го деления гепатоцитов. Более того, производ-

ство биомассы гепатоцитов должно быть ско-

ординировано с событиями клеточного цикла,

чтобы получить две здоровые дочерние клет-

ки. Таким образом, характеристика принци-

пов, лежащих в основе этих путей, может

дать важную информацию для понимания

Рис. 3. Метаболические пути, активность которых изме-

няется после воздействия TCPOBOP в печени мышей.

роста и пролиферации гепатоцитов. В настоя-

Размер (диаметр круга) и цвет (оттенок) каждого круга

щем исследовании был проведен комплекс-

основан на значимости воздействия ТСРОВОР на мета-

ный метаболомный анализ с использованием

болический путь. Анализ путей проводился с использо-

ВЭЖХ-МС/МС, который позволил выявить

ванием онлайн-сервиса MetaboAnalyst. 1 - Пиримиди-

новый обмен; 2 - метаболизм тирозина; 3 - пуриновый

58 метаболитов, уровень которых изменяется

обмен; 4 - метаболизм глицина, серина и треонина;

при TCPOBOP-индуцированной гиперплазии

5 - метаболизм пирувата; 6 - метаболизм D-глютами-

печени у мышей. Анализ путей этих дифферен-

на и D-глутамата; 7 - метаболизм аргинина и пролина;

циально затронутых метаболитов в печени мы-

8 - биосинтез аргинина; 9 - метаболизм цистеина и ме-

тионина; 10 - пентозофосфатный путь

шей продемонстрировал значительное, опо-

средованное TCPOBOP, обогащение ряда био-

химических процессов. Так, в работе было

аргинина и пролина, цистеина и метионина) и

продемонстрировано, что большинство изме-

биосинтезе аргинина. Кроме того, показано,

ненных под действием химического митогена

что пути метаболизма энергетических субстра-

метаболитов вовлечены в пути биосинтеза

тов (метаболизм пентозофосфата) участвуют в

и метаболизма нуклеотидов и аминокислот.

метаболической адаптации печени мышей при

В совокупности эти данные указывают на ме-

воздействии TCPOBOP.

таболические предпочтения, лежащие в основе

высокой способности к пролиферации гепато-

цитов после введения TCPOBOP.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Глюкоза является основным субстратом

для пролиферирующих клеток, обеспечивая

Хорошо известно, что TCPOBOP-опосре-

клетки как ATP в качестве источника энергии,

дованная активация CAR вызывает гиперпла-

так и мономерными блоками для макромоле-

зию печени мышей [3]. CAR-опосредованная

кулярного синтеза [15]. В связи с этим гли-

гиперплазия печени связана с изменением экс-

колиз считают биохимической платформой,

прессии большого набора генов, кодирующих

поддерживающей пролиферацию клеток [16].

регуляторы пролиферации гепатоцитов [13].

В настоящем исследовании обнаружено, что

В настоящем исследовании доза и схема вве-

TCPOBOP-индуцированная пролиферация ге-

дения ТСРОВОР полностью соответствовали

патоцитов сопровождается увеличением со-

ранее опубликованным данным, в которых

держания метаболитов, которые образуются

впервые было показано, что ТСРОВОР-опо-

за счет гликолитического разрушения глюко-

средованная активация CAR приводит к ги-

зы, таких как глицеральдегид-3-фосфат, фос-

перплазии печени мышей [3]. Наши резуль-

фоенолпируват и пировиноградная кислота.

таты подтвердили, что активация CAR при

Это может свидетельствовать об активации

воздействии ТСРОВОР сопровождается уве-

гликолиза при TCPOBOP-индуцированной про-

личением экспрессии генов-регуляторов кле-

лиферации гепатоцитов мышей.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

АГОНИСТ CAR ИЗМЕНЯЕТ МЕТАБОЛОМ В ПЕЧЕНИ

1309

Накопление гликолитических промежу-

нокислоты служат субстратами для энергети-

точных соединений может приводить к их

ческого метаболизма. По-видимому, наблю-

перераспределению в другие биохимические

даемое снижение уровня серина, аланина,

пути, ответвляющиеся от гликолиза. Одним

метионина и тирозина связано с тем, что гли-

из таких путей является пентозофосфатный

когенные аминокислоты выступают субстра-

путь (PPP), который играет важную роль в

тами для биосинтеза углеводов и нуклеотидов.

биосинтезе нуклеотидов. РРР использует про-

Метионин также является основным ис-

межуточные продукты гликолиза в реакциях,

точником метильных групп, превращаясь в

производящих рибозо-5-фосфат для синтеза

универсальный донор метильных групп S-аде-

нуклеиновых кислот и NADPH для анаболиз-

нозилметионин (SAM). SAM обеспечивает

ма [17]. Наши данные показали, что воздей-

метильную группу для метилирования ДНК и

ствие TCPOBOP на печень мышей значительно

гистонов. После переноса метильной груп-

увеличивало уровень седогептулозо-7-фосфа-

пы SAM превращается в S-аденозилгомоци-

та, который связывает гликолиз, пентозофос-

стеин (SAH). Наши результаты показали опо-

фатный путь и биосинтез нуклеотидов [18].

средованное TCPOBOP снижение в печени

Более того, наши результаты показали, что при

мышей уровня метионина, а также увеличение

воздействии ТСРОВОР происходит измене-

уровня SAH. Этот факт может указывать на то,

ние уровней метаболитов, связанных с мета-

что TCPOBOP может вызывать метилирование

болизмом пиримидинов (UDP, dUMP, dTMP

ДНК и гистонов, что может способствовать

и цитидин) и пуринов (ксантозин, ксантин,

регуляции транскрипции. Предыдущие иссле-

гипоксантин, инозин, GMP и IMP). Эти мета-

дования показали, что активация CAR связана

болиты связаны с биосинтезом нуклеотидов.

с эпигенетическими изменениями, такими как

По-видимому, TCPOBOP-индуцированные пути

метилирование ДНК и гистонов, что нарушает

метаболизма, связанные с синтезом пирими-

регуляцию экспрессии генов в печени [24, 25].

дина и пурина, поддерживают пролиферацию

гепатоцитов за счет предоставления нуклеоти-

дов, которые являются необходимыми пред-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

шественниками для биосинтеза РНК и ДНК.

Ранее было показано, что высокая регене-

Ранее с использованием технологии

ративная способность органов сочетается с

RNA-seq установлено, что активация CAR

высоким уровнем метаболизма пиримиди-

под действием TCPOBOP вызывает измене-

нов, а пиримидиновые нуклеозиды могут спо-

ние экспрессии более чем 2000 генов в печени

собствовать регенерации различных тканей

мышей [26]. В настоящей работе показано,

in vivo [19].

что при воздействии TCPOBOP наблюдается

Наше исследование показало, что после

скоординированный контроль метаболизма и

воздействия TCPOBOP также наблюдаются

пролиферации гепатоцитов. По всей видимо-

изменения в биосинтезе и метаболизме ряда

сти, активация CAR инициирует внутрикле-

аминокислот в печени мышей. Так, в печени

точную программу, которая способствует гло-

мышей, получавших TCPOBOP, наблюдалось

бальной скоординированной метаболической

увеличение метаболитов, участвующих в био-

активности, необходимой для пролиферации

синтезе аргинина. Аргинин является предше-

гепатоцитов. Эти данные могут свидетельство-

ственником не только для синтеза белков, но

вать о том, что CAR-опосредованные сигналь-

и полиаминов. В этом исследовании воздей-

ные каскады образуют сеть сигнальных цепей,

ствие TCPOBOP повышало уровень двух поли-

ведущих к сложной регуляции пролифера-

аминов, путресцина и спермидина, в печени

ции гепатоцитов не только на транскриптом-

мышей. И путресцин, и спермидин являются

ном, но и на метаболомном уровне. Требуются

хорошо известными прорегенеративными ме-

дальнейшие углубленные исследования для

таболитами [20], способными усиливать реге-

выявления более нисходящих селективных

нерацию печени после частичной гепатэкто-

метаболических путей, которые участвуют в

мии [21-23].

метаболическом гомеостазе во время проли-

Аминокислоты также могут выступать в

ферации гепатоцитов после TCPOBOP-опо-

качестве субстратов для разнообразных био-

средованной активации CAR. Тем не менее

химических путей. Результаты, полученные в

наши метаболомные данные могут дать но-

этом исследовании, показали снижение глико-

вое представление о биологических механиз-

генных аминокислот, таких как серин, аланин,

мах, которые происходят во время TCPOBOP-

метионин и тирозин, при воздействии химиче-

индуцированной пролиферации гепатоцитов

ского митогена TCPOBOP. Гликогенные ами-

у мышей.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

1310

МАЗИН и др.

Вклад авторов. В.О. Пустыльняк, Л.Ф. Гу-

Минобрнауки России (соглашение № 075-15-

ляева - концепция и руководство работой;

2021-691).

М.Э. Мазин, А.М. Перевалова, А.А. Ярушкин,

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

Ю.А. Пустыльняк, А.Д. Рогачев, Е.А. Прокопь-

отсутствии конфликта интересов.

ева - проведение экспериментов и статисти-

Соблюдение этических норм. Содержание

ческая обработка результатов; М.Э. Мазин,

животных и все эксперименты с животными

А.А. Ярушкин, В.О. Пустыльняк, Л.Ф. Гуляе-

проводились в соответствии с позицией по

ва - обсуждение результатов исследования;

этике использования животных в исследова-

М.Э. Мазин

- написание текста; В.О. Пу-

ниях, выполняемых при поддержке Россий-

стыльняк -редактирование текста статьи.

ского научного фонда, а также в соответствии

Финансирование. Работа выполнена при

с Директивой 2010/63/ЕС Европейского пар-

поддержке Российского научного фонда

ламента и Совета Европейского Союза от

(грант № 18-15-00021).

22 сентября 2010 г. и одобрены Комиссией по

Благодарности. Работа выполнена с исполь-

биоэтике Федерального исследовательского

зованием оборудования ЦКП «Протеомный

центра фундаментальной и трансляционной

анализ», поддержанного финансированием

медицины (протокол № 23-17).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Yan, J., and Xie, W. (2016) A brief history of the

Solhi, R., Lotfinia, M., Gramignoli, R., Najimi, M.,

discovery of PXR and CAR as xenobiotic receptors,

and Vosough, M. (2021) Metabolic hallmarks of liver

Acta Pharm. Sin. B, 6, 450-452, doi: 10.1016/j.apsb.

regeneration, Trends Endocrinol. Metab., 32, 731-745,

2016.06.011.

doi: 10.1016/j.tem.2021.06.002.

Cai, X., Young, G. M., and Xie, W. (2021) The xe-

Cardiff, R. D., Miller, C. H., and Munn, R. J. (2014)

nobiotic receptors PXR and CAR in liver phys-

Manual hematoxylin and eosin staining of mouse

iology, an update, Biochim. Biophys. Acta Mol.

tissue sections, Cold Spring Harb. Protoc.,

2014,

Basis Dis.,

1867,

166101, doi:

10.1016/j.bbadis.

655-658, doi: 10.1101/pdb.prot073411.

2021.166101.

Graefe, C., Eichhorn, L., Wurst, P., Kleiner, J.,

Blanco-Bose, W. E., Murphy, M. J., Ehninger, A.,

Heine, A., Panetas, I., Abdulla, Z., Hoeft, A., Frede, S.,

Offner, S., Dubey, C., Huang, W., Moore, D. D.,

Kurts, C., Endl, E., and Weisheit, C. K. (2019) Opti-

and Trumpp, A. (2008) C-Myc and its target FoxM1

mized Ki-67 staining in murine cells: a tool to deter-

are critical downstream effectors of constitutive

mine cell proliferation, Mol. Biol. Rep., 46, 4631-4643,

androstane receptor (CAR) mediated direct liver

doi: 10.1007/s11033-019-04851-2.

hyperplasia, Hepatology, 48, 1302-1311, doi: 10.1002/

10.

Mazin, M. E., Yarushkin, A. A., Pustylnyak, Y. A.,

hep.22475.

Prokopyeva, E. A., and Pustylnyak, V. O. (2022) Pro-

Tschuor, C., Kachaylo, E., Limani, P., Raptis, D. A.,

motion of NR1I3-mediated liver growth is accompa-

Linecker, M., Tian, Y., Herrmann, U., Grabliaus-

nied by STAT3 activation, Mol. Biol. Rep., 49, 4089-

kaite, K., Weber, A., Columbano, A., Graf, R.,

4093, doi: 10.1007/s11033-022-07340-1.

Humar, B., and Clavien, P. A. (2016) Constitutive

11.

Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., and Asara, J. M.

androstane receptor (Car)-driven regeneration protects

(2012) A positive/negative ion-switching, targeted

liver from failure following tissue loss, J. Hepatol., 65,

mass spectrometry-based metabolomics platform for

66-74, doi: 10.1016/j.jhep.2016.02.040.

bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue, Nat.

Lodato, N. J., Melia, T., Rampersaud, A., and

Protoc., 7, 872-881, doi: 10.1038/nprot.2012.024.

Waxman, D. J. (2017) Sex-differential responses of

12.

Rogachev, A. D., Alemasov, N. A., Ivanisenko, V. A.,

tumor promotion-associated genes and dysregulation

Ivanisenko, N. V., Gaisler, E. V., Oleshko, O. S.,

of novel long noncoding RNAs in constitutive

Cheresiz, S. V., Mishinov, S. V., Stupak, V. V., and

androstane receptor-activated mouse liver, Toxicol.

Pokrovsky, A. G. (2021) Correlation of metabolic pro-

Sci., 159, 25-41, doi: 10.1093/toxsci/kfx114.

files of plasma and cerebrospinal fluid of high-grade

Skoda, J., Dohnalova, K., Chalupsky, K., Stahl, A.,

glioma patients, Metabolites, 11, 133, doi: 10.3390/

Templin, M., Maixnerova, J., Micuda, S., Grøntved, L.,

metabo11030133.

Braeuning, A., and Pavek, P. (2022) Off-target lip-

13.

Kazantseva, Y. A., Pustylnyak, Y. A., and Pustylnyak,

id metabolism disruption by the mouse constitu-

V. O. (2016) Role of nuclear constitutive androstane

tive androstane receptor ligand TCPOBOP in hu-

receptor in regulation of hepatocyte proliferation and

manized mice, Biochem. Pharmacol., 197, 114905,

hepatocarcinogenesis, Biochemistry (Moscow),

81,

doi: 10.1016/j.bcp.2021.114905.

338-347, doi: 10.1134/S0006297916040040.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023

АГОНИСТ CAR ИЗМЕНЯЕТ МЕТАБОЛОМ В ПЕЧЕНИ

1311

14.

Huber, K., Mestres-Arenas, A., Fajas, L., and Leal-

polyamines, spermidine and spermine, causes a

Esteban, L. C. (2021) The multifaceted role of cell cycle

total arrest in translation and growth in mammalian

regulators in the coordination of growth and metabo-

cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 2169-2174,

lism, FEBS J., 288, 3813-3833, doi: 10.1111/febs.15586.

doi: 10.1073/pnas.1219002110.

15.

Locasale, J. W., and Cantley, L. C. (2011) Metabolic

22.

Alhonen, L., Räsänen, T.L., Sinervirta, R., Parkkinen,

flux and the regulation of mammalian cell growth, Cell

J. J., Korhonen, V. P., Pietilä, M., and Jänne, J.

Metab., 14, 443-451, doi: 10.1016/j.cmet.2011.07.014.

(2002) Polyamines are required for the initiation of

16.

Lunt, S. Y., and Vander Heiden, M. G. (2011) Aerobic

rat liver regeneration, Biochem. J., 362, 149-153,

glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell

doi: 10.1042/0264-6021:3620149.

proliferation, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 27, 441-464,

23.

Chattopadhyay, M. K., Park, M. H., and Tabor, H.

doi: 10.1146/annurev-cellbio-092910-154237.

(2008) Hypusine modification for growth is the major

17.

Ge, T., Yang, J., Zhou, S., Wang, Y., Li, Y., and

function of spermidine in Saccharomyces cerevisiae

Tong, X. (2020) The role of the pentose phosphate

polyamine auxotrophs grown in limiting spermidine,

pathway in diabetes and cancer, Front Endocrinol.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

105,

6554-6559,

(Lausanne), 11, 365, doi: 10.3389/fendo.2020.00365.

doi: 10.1073/pnas.0710970105.

18.

Jin, L., and Zhou, Y. (2019) Crucial role of the pentose

24.

Lempiäinen, H., Müller, A., Brasa, S., Teo, S. S.,

phosphate pathway in malignant tumors, Oncol. Lett.,

Roloff, T. C., Morawiec, L., Zamurovic, N., Vicart, A.,

17, 4213-4221, doi: 10.3892/ol.2019.10112.

Funhoff, E., Couttet, P., Schübeler, D., Grenet, O.,

19.

Liu, Z., Li, W., Geng, L., Sun, L., Wang, Q., Yu, Y.,

Marlowe, J., Moggs, J., and Terranova, R. (2011)

Yan, P., Liang, C., Ren, J., Song, M., Zhao, Q., Lei, J.,

Phenobarbital mediates an epigenetic switch at

Cai, Y., Li, J., Yan, K., Wu, Z., Chu, Q., Li, J.,

the constitutive androstane receptor (CAR) tar-

Wang, S., Li, C., Han, J. J., Hernandez-Benitez, R.,

get gene Cyp2b10 in the liver of B6C3F1 mice,

Shyh-Chang, N., Belmonte, J. C. I., Zhang, W., Qu, J.,

PLoS One,

6, e18216, doi:

10.1371/journal.pone.

and Liu, G. H. (2022) Cross-species metabolom-

0018216.

ic analysis identifies uridine as a potent regeneration

25.

Rampersaud, A., Lodato, N.J., Shin, A., and Wax-

promoting factor, Cell Discov., 8, 6, doi: 10.1038/

man, D. J. (2019) Widespread epigenetic changes to

s41421-021-00361-3.

the enhancer landscape of mouse liver induced by a

20.

Doi, J., Fujimoto, Y., Teratani, T., Kasahara, N.,

specific xenobiotic agonist ligand of the nuclear re-

Maeda, M., Tsuruyama, T., Iida, T., Yagi, S., and

ceptor CAR, Toxicol. Sci., 171, 315-338, doi: 10.1093/

Uemoto, S. (2019) Bolus administration of polyamines

toxsci/kfz148.

boosts effects on hepatic ischemia-reperfusion injury

26.

Cui, J. Y., and Klaassen, C. D. (2016) RNA-Seq

and regeneration in rats, Eur. Surg. Res., 60, 63-73,

reveals common and unique PXR- and CAR-target

doi: 10.1159/000497434.

gene signatures in the mouse liver transcriptome,

21.

Mandal, S., Mandal, A., Johansson, H. E., Orjalo,

Biochim. Biophys. Acta, 1859, 1198-1217, doi: 10.1016/

A. V., and Park, M. H. (2013) Depletion of cellular

j.bbagrm.2016.04.010.

CONSTITUTIVE ANDROSTANE RECEPTOR AGONIST

INITIATES METABOLIC ACTIVITY

REQUIRED FOR HEPATOCITE PROLIFERATION

M. E. Mazin^1,2, A. M. Perevalova¹, A. A. Yarushkin², Y. A. Pustylnyak¹,

A. D. Rogachev¹, E. A. Prokopyeva^1,2, L. F. Gulyaeva^1,2, and V. O. Pustylnyak^1,2*

¹ Novosibirsk State University, 630090 Novosibirsk, Russia; e-mail: pustylnyak@post.nsu.ru

² Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine,

630117 Novosibirsk, Russia

Constitutive androstane receptor (CAR, NR1I3) activation by chemical compounds evokes liver hyperplasia

in rodent. 1,4-Bis[2-(3,5-dichloropyridyloxy)] benzene (TCPOBOP), a mouse CAR agonist, is most com-

monly used to study chemically induced liver hyperplasia and hepatocyte proliferation in vivo. TCPOBOP

is potent murine liver chemical mitogen, which induces rapid direct liver hyperplasia independent of liver

injury. In recent years, a lot of data has been accumulated on the transcription program that characterizes

TCPOBOP-induced hepatocyte proliferation. However, there are scarce data about metabolic requirements

of hepatocytes dividing upon treatment with xenobiotics. In present study, we employed liquid chromatog-

raphy - mass spectrometry technology combined with statistical analysis to develop a metabolite profile of

БИОХИМИЯ том 88 вып. 8 2023