ПАРАЗИТОЛОГИЯ, 2019, том 53, № 5, с. 355-369.

УДК 578.833.28:578.427(571.1)

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КЛЕЩЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ

В КЛЕЩАХ DERMACENTOR RETICULATUS,

СОБРАННЫХ В ГОРОДСКИХ БИОТОПАХ г. ТОМСКА

Е. И. Кривошеина^a,b, А. И. Кузнецов^a,b, В. Н. Романенко^c,

Н. С. Москвитина^c, В. А. Терновой^a, В. Б. Локтев^a,b,*

^a Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора,

р. п. Кольцово, Новосибирская обл. 630559, Россия

^bНациональный исследовательский Новосибирский государственный университет

ул. Пирогова 2, Новосибирск 630090, Россия

^cНациональный исследовательский Томский государственный университет,

пр. Ленина 36, Томск 634050, Россия

*е-mail: loktev@vector.nsс.ru; valeryloktev@gmail.com

Поступила в редакцию 18.07.2019 г.

После доработки 22.08.2019 г.

Принята к публикации 28.08.2019 г.

Осенью 2015 г. было обнаружено более чем 200-кратное увеличение численности клещей

Dermacentor reticulatus (Fabric., 1794) в городских биотопах г. Томска. Собранные в городских

биотопах в 2016-2017 гг. клещи D. reticulatus исследованы на наличие генетических маркеров

шести возбудителей клещевых инфекций с помощью ПЦР. Инфицированность клещей соста-

вила приблизительно 44-48 % для Rickettsia spp., 0.7-0.9 % для вируса клещевого энцефали-

та (ВКЭ) и достигала 0.6 % для Anaplasma phagocytophilum. Генетический материал вируса

Кемерово, Borrelia spp. и Coxiella burnetii не обнаружен. Все выявленные изоляты риккетсий

при генотипировании по пяти генам (gltA, 16S рРНК, ompA, ompB, geneD) были отнесены

к Rickettsia raoultii. Томские изоляты R. raoultii наиболее генетически близки к риккетсиям, цир-

кулирующим во Франции. Анализ полных нуклеотидных последовательностей groESL-оперона

A. phagocytophilum показал их схожесть (99 %) с изолятами, выделенными ранее в Томском ре-

гионе. Генотипирование ВКЭ выявило циркуляцию сибирского и дальневосточного генотипов

ВКЭ. Таким образом, показано, что клещи D. reticulatus активно участвуют в формировании

городских очагов клещевых инфекций в Томске.

Ключевые слова: Dermacentor reticulatus, клещевые инфекции, Rickettsia raoultii, Anaplasma

phagocytophilum, вирус клещевого энцефалита, городские биотопы, Томск.

DOI: 10.1134/S0031184719050016

В последнее время в биотопах многих городов России отмечается увеличение чис-

ленности иксодовых клещей, изменение их видового состава и увеличение их инфици-

рованности возбудителями клещевых инфекций (Романенко, Кондратьева, 2011; Маль-

355

кова и др., 2012; Ястребов и др., 2012). Ранее в парках г. Томска и на его окраинах были

обнаружены клещи, относящиеся к семейству Ixodidae: Ixodes persulcatus (Schulze,

1930), Ixodes pavlovskyi (Pomerantzev, 1946), Dermacentor reticulates (Fabric, 1794),

Haemaphysalis concinna (Koch, 1844), среди которых доминировали клещи I. pavlovskyi

(Романенко, 2009). В последние годы D. reticulatus в окрестностях г. Томска обнару-

живали в небольшом количестве, чаще всего в городской пойме реки Томь. Осенью

2015 г. впервые был обнаружен участок с высокой численностью клеща этого вида

на склонах высокого берега р. Томь, биотоп «Лагерный сад» (Романенко и др., 2017).

В предшествующие годы D. reticulatus встречался в этом городском биотопе в учётах

только в 2012 и 2014 гг., при этом средняя сезонная численность в эти годы составляла

0.17 особей/уч. км. В середине сентября 2015 г. численность D. reticulatus достигла

уровня 42 особей/уч. км., а в 2016 г. до 66 особей/уч. км.

Участие D. reticulatus в распространении клещевых инфекций непосредственно в го-

родской черте Томска не было исследовано. Цель данного исследования заключалась

в определении уровня инфицированности и генотипировании возбудителей клещевых

инфекций в D. reticulatus, отловленных в городских биотопах г. Томска.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Сбор образцов проводили в весенне-летние периоды 2016-2017 гг. на территории городского

биотопа «Лагерный сад» и примыкающих к историческому центру г. Томска парковых зон (Ро-

маненко и др., 2017). Сбор клещей проводили с растительности методом «на флаг». До начала

исследования клещи хранили при -70 ^оС, индивидуально. Принадлежность исследуемых клещей

к виду D. reticulatus определяли морфологически с последующим подтверждением путем опре-

деления нуклеотидной последовательности фрагмента митохондриального гена, кодирующего

цитохромоксидазу субъединицу I (COX1).

Гомогенизацию полученных образцов осуществляли с использованием лабораторного гомо-

генизатора TissueLyserLT (Qiagen, Германия) в 300 мкл стерильного физраствора. Выделение

нуклеиновых кислот проводили из 100 мкл гомогената с использованием коммерческого набора

«АмплиПрайм РИБО-преп» («НексБио», Россия) согласно инструкции производителя. Получе-

ние кДНК осуществляли с помощью набора реагентов «РЕВЕРТА-L 100» («ИнтерЛабСервис»,

Россия).

Скрининг полученных образцов на наличие генетических маркеров изучаемых патогенов и

выделение фрагментов для секвенирования проводили с помощью ПЦР. В табл. 1 представлен

набор использованных праймеров, в том числе описанных ранее (Sumner et al., 1997; Liz et al.,

2000; Fournier, Raoult 2003; Tkachev et al., 2017; Rar et al., 2017). Генотипирование изолятов выяв-

ленных патогенов осуществляли путем определения соответствующих нуклеотидных последо-

вательностей и их дальнейшего анализа. Cеквенирование продуктов амплификации проводили

модифицированным методом Сэнгера на основе капиллярного электрофореза с помощью авто-

матического секвенатора 3130×l GeneticAnalyzer (AppliedBiosystems, США). Анализ получен-

ных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программного продукта

UniproUGENE v. 1.32 (Okonechnikov et al., 2012). Полученные нуклеотидные последовательно-

сти сравнивали с ранее опубликованными при помощи поискового приложения BLAST.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью алгоритма

MUSCLE в программе MEGA7 (Kumar et al., 2016). Филогенетический анализ нуклеотидных по-

следовательностей исследуемых фрагментов генома проводили методом максимального правдо-

подобия с использованием модели эволюции Tamura-Nei. Показатели статистической надежно-

сти узлов филогенетического дерева рассчитаны с помощью бутстреп-анализа с использованием

1000 случайных реплик. В базу данных GenBank депонированы определенные нуклеотидные

последовательности: гена 16S рРНК (MK304546), gltA (MK304547), ompA (MK304548), ompB

(MK304549), geneD (MK304550) - для R. raoultii, фрагмент гена Е изолятов ВКЭ (MK419944-

MK419947), фрагмент groESL-оперона A. phagocytophilum (KY379956).

356

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для выявления генетического

материала клещевых патогенов и генотипирования вида клещей

Вид / Ген

Название

Структура праймера (5ˊ→3ˊ)

D. reticulatus / cox1

DH_f

TCGAWTAGAAYTAAGACAACCTGG

DH_r

GGTGRCCAAAAAATCAAAATARATG

TBEV / E-NS1 genes

GGCATAGAAAGGCTGACAGTG

E10

GATACCTCTCTCCACACAACCAG

ACAGTGATAGGAGAACACGCCTGGG

CAGCCAGGAGGAAGCTCATGGAC

KEMV / segment 1

Kem1s_1

TCCGCCACCCTGGAATGAGAC

Kem1s_2

TCAGGATCGGTCAAGGCCATTC

Borrelia spp. / 5S-23S rRNA

NC1

CCTGTTATCATTCCGAACACAG

NC2

TACTCCATTCGGTAATCTTGGG

Coxiella burnetii / htpAB

IS111F1

TACTGGGTGTTGATATTGC

IS111R1

CCGTTTCATCCGCGGTG

Rickettsia spp. / 16S rRNA

r_F88

TAACTATACCTACCCAAAGCGA

r_R797

CTTCCAACTTACTAAACCGCCT

r_F599

AAAGCCTGATCCAGCAATACC

r_R1293

GGACTTAACCCAACATCACGA

r_F1167

AAACCTTACCAACCCTTGAC

R_r1702

GCTACCTTGTTACGACTTCAC

Rickettsia spp. / sca4(geneD)

D_1F

TGTAACAACATCGGCTTGAC

D_R2

GGTTTGCATTTACTTGTTGCGA

D_2F

AAATGATGCAGGTGATGAACTC

D_3R

TCCGCATTGCTTAATTCAGAG

D_F3

GAACAACCGCTAATAACTCCA

R_4R

AACAGCGTTAATTACTTCCCGA

D_F5

GGTATTTATGAAGGCAAAGGAGG

D_R5

ATCTTGATCAGCGTTGTGGAG

Rickettsia spp. / gltA

CS1d

ATGACTAATGGCAATAATAA

CS535r

GAATATTTATAAGACATTGC

CS409d

CCTATGGCTATTATGCTTGC

RP1258n

ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA

RgA-f

CAATCCGCTCTTACAAATAGCA

RgA-r

GTCAATAAACTTCTCACGATGG

Rickettsia spp. / ompA

rA-F2624

GTGCTAATGAAGGTGATGTAGTC

rA-R3292

CTAAGAAACCGCCAATATTACC

rA-F3001

GCGAATATAGACCCTGATAATGAC

rA-R3771

GGCTAAAGTAACCGCACCTG

357

Вид / Ген

Название

Структура праймера (5ˊ→3ˊ)

rA-F3733

GCCGATACATTCACTAATACAGG

rA-4599

CTTAGCATCCATATCTTCATCACC

Rickettsia spp. / ompB

RrB_1f

GCAGAATAGAACAACAAACGG

RrB_1r

CTACGCTAACAACAAATCCTG

RrB_2f

GCAGGATTTGTTGTTAGCGT

RrB_2r

ACTACCGTCTAAGGTAATAGCAC

RrB_3f

ATCGGAGTTGTCCAATTATCAG

RrB_3r

ACCGCTTACTATATTTGTTCCACC

RrB_4f

ACAGTTCAGTACAATTCGCTC

RrB_4r

GGAGTATTAGGAACACCACCA

RrB_5f

GGTGGAACAAATATAGTAAGCGG

RrB_5r

CCAATACCTGTGCCTAAGCC

RrB_6f

AACGCAACAATTAATGACGG

RrB_6r

CGGTTACAGCAAAGTTAGGA

RrB_7f

TAGGTCTTGGAAGCGATAACGG

RrB_7r

CAGCCATTTCAGCAGTTTCAG

RrB_8f

GCTCAACTTGGTAACAGATTAGG

RrB_8r

CGTAACCGATTCCGTACTCC

Anaplasma spp. / groESL-оперон

HS1-f

CGYCAGTGGGCTGGTAATGAA

HS6-r

CCWCCWGGTACWACACCTTC

HS3-f

ATAGTYATGAAGGAGAGTGAT

HSVR

TCAACAGCAGCTCTAGTWG

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование вошла выборка из 315 клещей вида D. reticulatus (187 самок и 128

самцов), собранных с растительности на территории городских биотопов в сентябре

2016 г., и 135 клещей (83 самки и 52 самца), собранных аналогичным образом в 2017 г.

Тестирование наличия генетических маркеров ВКЭ, вируса Кемерово, Borrelia spp.,

Rickettsia spp., Coxiella burnetii, Anaplasma spp. в собранных клещах D. reticulatus было

проведено методоми ПЦР для каждой особи клеща индвидуально.

ДНК Rickettsia spp. была выявлена в 139 клещах, отловленных в 2016 г.; таким об-

разом уровень инфицированности составил 44.1±2.7 %. В 2017 г. уровень инфициро-

ванности составил 48.1±4.3 % (инфицированными оказались 65 из 135 исследуемых

клещей). Достоверных различий в уровне инфицированности риккетсиями у самцов и

самок клещей D. reticulates не было установлено (в 2016 г. уровень инфицированности

самок и самцов соответственно составил 45.4±3.6 % и 42.2±4.2 %; в 2017 г. - у самок

составил 49.4±5.4 %, у самцов - 46.1±6.8 %). Все выявленные изоляты риккетсий при

предварительном генотипировании по нуклеотидной последовательности фрагмента

гена цитратсинтазы gltA (767 п.н.) были отнесены к R. raoultii. При сравнении нуклео-

тидных последовательностей данного локуса все изоляты оказались полностью иден-

тичными друг другу.

358

Генетический материал ВКЭ был обнаружен в четырех образцах клещей, уровень

инфицированности составил 0.9±0.5 % в 2016 г. и 0.7±0.5 % в 2017 г. ВКЭ был обна-

ружен как у самок (3 особи), так и у самцов (1 особь). На рис. 1 представлены фило-

генетические взаимоотношения различных штаммов ВКЭ и основных генотипов дан-

ного вида вируса. Три изолята были отнесены к сибирскому субтипу ВКЭ, показав

уровень гомологии на 99.8 % между собой и 98.5-99.0 % с изолятами Lesopark 11 и

Kemerovo-134-08, циркулирующими в Новосибирской и Кемеровкой областях. Один

изолят был отнесен к дальневосточному субтипу ВКЭ, т. к. показал наибольшую го-

мологию на уровне 98.6 % с изолятами Tomsk-PT12, Tomsk-PT14 и Tomsk-M83, ранее

обнаруженными в Томской области (Ternovoi et al., 2019).

Рис. 1. Филогенетическое дерево для последовательностей ВКЭ.

Дендрограмма, построенна на основе нуклеотидных последовательностей ВКЭ для фрагменов гена,

кодирующего структурный белок Е и относящихся к трем основным генотипам ВКЭ. Анализ проведен

методом максимального правдоподобия с использованием модели Tamura - Nei. Указаны индексы

статистической поддержки узлов (>70 %), вирус Лангат использован в качестве внешней группы

сравнения, бутстреп-тест рассчитан для 1000 реплик. В скобках указаны номера доступа в GenBank.

В ходе исследования в двух образцах D. reticulatus была выявлена ДНК

A. phagocytophilum. Уровень инфицированности в 2016 г. составил 0.6±0.4 %. Ну-

клеотидные последовательности groESL-оперона двух изолятов оказались полностью

идентичными друг другу. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей

groESL-оперона выявленных изолятов составил более 99 % по сравнению с изолятами

A. phagocytophilum, выделенными из клещей рода Ixodes на близлежащих территориях.

Генетический материал вируса Кемерово, Borrelia spp., включая B. miyamotoi и

Coxiella burnetii, в собранных образцах клещей методом ПЦР не был выявлен. Веро-

ятно, его отсуствие связано с отсутствием или низкой концентрацией этих патогенов

в собранных клещах D. reticulatus.

359

Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК изучаемых изолятов на 100 %

идентична последовательности штамма Marne R. raoultii (DQ365809), имеет одну

нуклеотидную замену по сравнению с последовательностью гена 16S рРНК штамма

Elanda-23/95 (EU036982) и 3 нуклеотидные замены по сравнению с последовательно-

стями штаммов Khabarovsk (CP010969) и IM16 R. raoultii (KY474575). Анализ нукле-

отидной последовательности гена 16S рРНК изучаемых изолятов показал наибольшую

гомологию (99.9 %) со штаммом Marne (DQ365797), уровень гомологии со штаммами

Khabarovsk (CP010969) и IM16 (CP019435) составил около 99.7 %.

Нуклеотидная последовательность гена gltA R. raoultii имеет одну нуклеотидную за-

мену по сравнению с прототипным штаммом Khabarovsk (CP010969), выделенным из

клеща D. silvarum в Хабаровском крае в 2005 г., и штаммом IM16 (CP019435). При

проведении филогенетического анализа томские изоляты кластеризуются вместе

с этими штаммами на филогенетическим дереве (рис. 2B). По сравнению со штаммом

Elanda-23/95 (EU036985), выделенным из клеща D. nuttalli на Алтае в 1995 г., в ну-

клеотидной последовательности гена gltA обнаружены три замены. Уровень гомологии

соответствующих аминокислотных последовательностей идентичен на 100 % у выяв-

ленных нами изолятов риккетсий и прототипных штаммов Khabarovsk и IM16 R. raoultii.

В аминокислотной последовательности цитратсинтазы штамма Elanda-23/95 выявле-

ны два аминокислотных замещения по сравнению с вышеперечисленными штаммами

(E₉₃→K; E₂₈₁→K).

Филогенетическое дерево, представленное на рис. 2С, также показывает кластериза-

цию томских изолятов по гену ompB с описанными выше изолятами риккетсий. Уро-

вень гомологии нуклеотидной последовательности гена ompB томских изолятов при

сравнении со штаммами Marne (AH015609) и Crimea-1 R. raoultii (KU961541) соста-

вил 99.9 %; со штаммами Khabarovsk (CP010969) и IM16 (CP019435) - 99.7 %; а для

штамма Elanda-23/95 (EU036984) составил 99.5 %.

Уровень гомологии нуклеотидной последовательности гена geneD томских изоля-

тов по сравнению с другими географическими вариантами R. raoultii составлял от

99.2 % до 99.9 %. Анализ филогенетических взаимоотношений подтвердил данные

полученные при анализе генов 16S рРНК, gltA, ompA, ompB (рис. 2D).

В табл. 2 представлены данные по выявленным несинонимичным заменам в гене

ompB изолята Tomsk (MK304549) по сравнению с другими изолятами риккетсий. Наи-

меньшее количество замен было обнаружено у штамма Marne по сравнению с том-

скими изолятами R. raoultii. В гене ompB было обнаружено всего 3 несинонимичные

замены, что показывает фактическую идентичность гена ompB для различных геогра-

фических изолятов риккетсий. Штаммы Khabarovsk и Elandra-23/95 имеют 9 и 13 не-

синонимичных замен, соответственно. Причем оба штамма имеют делецию триплета

в гене ompB, что приводит к утрате аминокислотного остатка позиции 529.

362

Таблица 2. Несинонимичные замены в гене ompB изолята Tomsk R. raoultii (MK304549)

по сравнению с прототипными штаммами.

№ аминокислотной позиции

Прототипный штамм → изучаемый изолят

Штамм Marne (DQ365797)

976

P (CCT) → T (ACT)

1262

K (AAA) → Q (CAA)

1490

R (AGA) → S (AGC)

Штамм Khabarovsk (CP010969)

S (TCC) → A (GCC)

478

F (TTT) → L (CTT)

487

G (GGT) → S (AGT)

529

S (TCG) → делеция триплета

560

T (ACT) → A (GCT)

731

L (TTG) → F (TTT)

824

V (GTT) → G (GGT)

1460

K (AAG) → N (AAT)

1529

A (GCC) → V (GTC)

Штамм Elanda-23/95 (EU036984)

P (CCA) → T (ACA)

S (TCC) → A (GCC)

229

T (ACT) → A (GCT)

478

F (TTT) → L (CTT)

487

G (GGT) → S (AGT)

529

S (TCG) → делеция триплета

560

T (ACT) → A (GCT)

731

L (TTG) → F (TTT)

824

V (GTT) → G (CGT)

1391

N (AAT) → K (AAA)

1392

S (TCT) → T (ACT)

1409

D (GAT) → G (GGT)

1460

K (AAG) → N (AAT)

1529

A (GCC) → V (GTC)

Нуклеотидная

последовательность

groESL-оперона

томских

изолятов

A. phagocytophilum отличается всего двумя нуклеотидными заменами от последова-

тельности изолята Tomsk-Ipr1 A. phagocytophilum (KF701460), выделенного нами ра-

нее на территории Томской области из клеща I. persulcatus. Одна из нуклеотидных

замен является несинонимичной и приводит к аминокислотному замещению T₁₉₂→M.

Сравнение с другими изолятами Nov-Ip456 (HM366570, клещ I. persulcatus) и Omsk-

vole 79 A. phagocytophilum (KF745744, красная полевка) позволяют выявить в ну-

363

клеотидной последовательности groESL-оперона томского изолята 3 нуклеотидные

замены, одна из которых является несинонимичной (T₁₉₂→M); по сравнению с Tuva-

Ip2947 A. phagocytophilum (KC753764) (I. Persulcatus, Республика Тыва); 4 замены,

одна из которых является несинонимичной (T₁₉₂→M); сравнение с изолятом Kh-Ip144

(HM366577) (I. persulcatus, Красноярский край) позволяет выявить 66 нуклеотидных

замен, две из которых приводят к аминокислотным замещениям (T₁₉₂→M; S₂₄₂→A).

Таким образом, изолят A. phagocytophilum, выделенный из клеща D. reticulatus,

характеризуется уникальной заменой ACG(T₁₉₂)→ATG(M). Эта замена нехарактерна

для других изолятов, ранее выделенных из клещей I. persulcatus в Сибири.

ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день отмечается тенденция к формированию стойких очагов кле-

щевых инфекций на городских и пригородных территориях. Клещи, заселяющие го-

родские парки и скверы, представляют особую опасность, так как городские жители

воспринимают городскую среду как свободную от клещей. Ранее в парках г. Томска

обнаруживались клещи, относящиеся к семейству Ixodidae: Ixodes persulcatus, Ixo-

des pavlovskyi, Dermacentor reticulatus., Haemaphysalis concinna при доминировании

клещей I. pavlovskyi (Романенко, 2009). При этом их численность была многократно

ниже, чем в пригородных биотопах. Неожиданно, осенью 2015 г. было обнаружено бо-

лее чем 200-кратное увеличение численности клещей D. reticulatus в городском парке

в центре города (Романенко и др., 2017). Вероятно, высокую численность популяции

этого вида обеспечил ряд условий. После разрушительного оползня в 1975 г., снесшего

весь растительный покров, были предприняты рекультивационные работы, в итоге ко-

торых сформировался террасированный склон, поросший травами и низким кустарни-

ком. С учетом хорошей инсоляции создались благоприятные условия для расширения

ареала D. reticulatus, исходно предпочитающего лесостепные ландшафты. Конкрет-

ные погодные условия описываемого периода, когда температура сентября колебалась

в пределах 6-23 ^оC, способствовали массовому метаморфозу нимф, что, вероятно, при-

вело к взрывному росту численности имаго.

Высокая концентрация клещей позволила впервые собрать

450 особей вида

D. reticulatus в черте г. Томска в течение 2016-2017 гг. Это дало возможность провести

методом ПЦР анализ индивидуальных клещей на наличие генетических маркеров воз-

будителей шести клещевых инфекций вирусной и бактериальной природы, а также

выполнить таксономическую идентификацию выявленных возбудителей клещевых

инфекций на основе анализа их геномных последовательностей.

Наиболе часто выявлялась ДНК Rickettsia spp., при этом уровень инфицированно-

сти индивидуальных клещей колебался от 44.1±2.7 до 48.1±4.3 %. Предварительное

генотипирование по нуклеотидной последовательности фрагмента гена цитратсинта-

зы gltA (767 п.н.) позволило отнести томские изоляты к R. raoultii. Для более точной

генетической характеризации были определены полноразмерные нуклеотидные по-

следовательности 5 маркерных генов: 16S рРНК, gltA, ompA, ompB, geneD. Проведен-

ный анализ по этим генам показал, что изучаемые изоляты R. raoultii наиболее близки

к штамму Marne, выделенному на востоке Франции из клеща D. reticulates. Изоляты,

циркулирующие на близлежащих территориях (R. raoultii штамм Elanda-23/95 - Ал-

тай; штамм Khabarovsk - Хабаровский край), но выделенные от клещей других видов

364

(D. nuttalli и D. silvarum, соответственно), также кластеризуются вместе с томскими

изолятами. R. raoultii как новый вид была описана в 2008 г., когда был изучен прото-

типный штамм Khabarovsk, выделенный в 2005 г. из клеща D. silvarum в Хабаровском

крае (Mediannikov et al., 2008). Позднее, R. raoultii была обнаружена у клещей рода

Dermacentor (D. reticulatus, D. marginatus и D. nuttalli), отловленных в ряде регионов

азиатской части России (Омская и Новосибирская области, Республика Бурятия) и Ка-

захстане (Rydkina et al., 1999; Shpynov et al., 2006). Также имеются сообщения о ши-

роком распространении R. raoultii на территории Китая (Song et al., 2018; Liu et al.,

2016; Jia et al., 2014) и Монголии (Boldbaatar et al., 2017). Помимо хорошо известной

циркуляции R. raoultii в Европе (Parola et al., 2013), данный вид риккетсий выделен из

клещей рода Dermacentor в Японии и Таиланде (Nooroong et al., 2018), а также найден

в клещах D. marginatus в Грузии и Турции (Jiang ey al., 2012; Gargili et al., 2012).

В настоящее время серологическими методами и выявлением ДНК возбудителя

в крови больных подтверждена роль R. raoultii в качестве этиологического агента син-

дрома TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy), который характеризуется первичным

аффектом, окруженным эритемой и развивающимся в месте присасывания клеща,

а также болезненностью ближайших лимфоузлов (Świtaj et al., 2012; Silva-Pinto et al.,

2014). У больных развивается астенический синдром, в четверти случаев наблюдается

лихорадка (>38^оC). У большинства пациентов эритема сохраняется до 1-2 месяцев. Не-

давно генетический материал R. raoultii был выделен в клиническом материале от трех

пациентов на территории Новосибирской области (Igolkina et al., 2018). Встречаются

заболевания с атипичной клинической картиной, причем очень часто существующие

тест-системы не выявляют риккетсиозы, вызываемые R. raoultii. Это позволяет пред-

положить, что синдром TIBOLA может стать новым инфекционным заболеванием для

городских биотопов Томска с высоким уровнем встречаемости клещей D. reticulates.

Генетический материал ВКЭ был обнаружен в 0.7-0.9 % исследованных клещей. Его

генотипирование показало, что ВКЭ представлен дальневосточным и сибирским ге-

нотипами этого вируса. Циркуляция этих двух генотипов характерна для юга Западной

Сибири и Томского региона (Mikryukova et al., 2014; Ternovoi et al., 2019). Ранее за-

нос этого возбудителя в городские биотопы предположительно связывался с клещами

I.persulcatus и I. pavlovskyi и различными видами птиц. Характерной особенностью

этих генотипов ВКЭ является способность сибирского генотипа вызывать хрониче-

ские формы клещевого энцефалита, а дальневосточный генотип ассоциируется с тяже-

лыми формами клещевого энцефалита с высоким уровнем смертности.

Генетический материал A. phagocytophilum был выявлен в двух клещах, что суще-

ственно ниже, чем ранее было описано для клещей D. reticulatus, собранных в евро-

пейских природных биотопах (Ben, Lozynskyi, 2019). Генотипирование по groESL-

оперону показало идентичность генетического материала с ранее выделенными вари-

антами этого возбудителя в Томском регионе. Гранулоцитарный анаплазмоз человека,

как и синдром TIBOLA, является возможным новым инфекционным заболеванием для

Томска. Полученные данные подтверждают необходимость мониторинга циркуляции

R. raoultii и A. phagocytophilum в природных очагах клещевых инфекций г. Томска и

Томской области, дальнейшего совершенствования методов диагностики и профилак-

тики этой инфекции, включая выявление возможных случаев заболевания человека

в этом регионе.

365

Нам не удалось обнаружить генетический материал вируса Кемерово, Borrelia spp.

и Coxiella burnetii в собранных клещах D. reticulates в городских биотопах сибирско-

го мегаполиса. Тем не менее, имеются сообщения об обнаружении генетического ма-

териала этих возбудителей в природных биотопах ряда регионов и стран. Так, ДНК

Borrelia spp. была обнаружена в клещах D. reticulatus в странах Восточной Европы

(Mierzejewska et al., 2015; Zajac et al., 2017). В России вирус Кемерово был обнаружен

в клещах D. reticulatus в Курганской области (Dedkov et al., 2014). ДНК Coxiella burnetii

была ранее обнаружена в клещах D. reticulatus на территории Великобритании, Герма-

нии и Нидерландов, Белоруссии (Tijsse-Klasen et al., 2013; Sprong et al., 2019; Reye et

al., 2013). Представляется, что занос этих инфекционных агентов на городскую терри-

торию также вполне вероятен.

Таким образом, проведено исследование возможной роли D. reticulatus в распростра-

нении клещевых инфекций непосредственно в городской черте г. Томска. Выполнено

тестирование наличия генетических маркеров ВКЭ, вируса Кемерово, Borrelia spp.,

Rickettsia spp., Coxiella burnetii, Anaplasma spp. в клещах D. reticulatus, отловленных

в черте г. Томска методом ПЦР. Обнаружены генетические маркеры ВКЭ, Rickettsia spp.,

Anaplasma spp. Инфицированность клещей достигала 0.6 %, для Anaplasma spp., со-

ставила 0.7-0.9 % для ВКЭ и 44-48 % для Rickettsia spp. На основе секвенирования вы-

деленных фрагментов генов этих возбудителей проведено генотипирование возбудите-

лей клещевых инфекций. Выявлен генетический материал характерный для сибирского

и дальневосточного генотипа ВКЭ, R. raoultii, A. phagocytophilum в клещах D. reticula-

tus. Определены полные последовательности пяти генов (gltA, 16S рРНК, ompA, ompB,

geneD) томских изолятов Rickettsia raoultii и groESL-оперона A. phagocytophilum. По-

следовательности депонированы в GenBank.

Высказано предположение, что данные возбудители клещевых вирусных и бактери-

альных инфекций принимают участие в формировании городских очагов клещевых

инфекций, в том числе и новых инфекций, в парковой зоне г. Томска.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследования поддержаны Российской федеральной службой по надзору в сфере за-

щиты прав потребителей и благополучия человека и при поддержке Программы повы-

шения конкурентоспособности ТГУ.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Малькова М.Г., Якименко В.В., Танцев А.К. 2012. Изменение границ ареалов пастбищных иксодовых клещей

рода Ixodes latr., 1795 (Parasitiformes, Ixodidae) на территории Западной Сибири. Паразитология 46 (5):

369-383.

Романенко В.Н. 2009. Мониторинг видового состава и численности иксодовых клещей (Parasitiformes,

Ixodidae) в антропургических биотопах. Вестник Томского государственного университета 324: 376-

379.

Романенко В.Н., Кондратьева Л.М. 2011. Зараженность иксодовых клещей, снятых с людей, вирусом

клещевого энцефалита на территории города Томска и его окрестностей // Паразитология

45 (1):

3-10.

366

Романенко В.Н., Соколенко В.В., Максимова Ю.В. 2017. Локальное формирование высокой численности

клещей Dermacentor reticulatus (Parasitiformes, Ixodidae) в Томске. Паразитология 51 (4): 345-353.

Ястребов В.К., Рудаков Н.В., Шпынов С.Н. 2012. Трансмиссивные клещевые природно-очаговые инфекции

в Российской Федерации: тенденции эпидемического процесса, актуальные вопросы профилактики.

Сибирский медицинский журнал 111 (4): 91-93.

Ben I., Lozynskyi I. 2019. Prevalence of Anaplasma phagocytophilum in Ixodes ricinus and Dermacentor reticulatus

and coinfection with Borrelia burgdorferi and tick-borne encephalitis virus in western Ukraine. Vector-Borne

Zoonotic Diseases 2019 June 18. doi: 10.1089/vbz.2019.2450

Boldbaatar B., Jiang R.-R., von Fricken M.E., Lkhagvatseren S., Nymadawa P., Baigalmaa B., Wang,Y.-W.,

Anderson B. D., Jiang J.-F., Gray G.C. 2017. Distribution and molecular characteristics of rickettsiae found

in ticks across Central Mongolia. Parasites and Vectors 10 (1): 61. https://doi.org/10.1186/s13071-017-1981-3

Dedkov V.G., Markelov M.L., Gridneva K.A., Bekova M.V., Gmyl A.P., Kozlovskaya L.I., Karganova G.G.,

Romanova L.I., Pogodina V.V., Yakimenko V.V., Shipullin G.A. 2014. Prevalence of Kemerovo virus

in ixodid ticks from the Russian Federation. Ticks and Tick-Borne Diseases 5 (6): 651-655. https://doi.

org/10.1016/j.ttbdis.2014.04.017

Fournier P.E., Raoult D. 2003. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. Journal

of Clinical Microbiology 41(11):5094-5098. doi: 10.1128/JCM.41.11.5094-5098.2003

Gargili A., Palomar A. M., Midilli K., Portillo A., Kar S., Oteo J.A. 2012. Rickettsia species in ticks removed

from humans in Istanbul, Turkey. Vector-Borne Zoonotic Diseases 12 (11): 938-941. https://doi.org/10.1089/

vbz.2012.0996

Igolkina Y., Krasnova E., Rar V., Savelieva M., Epikhina T., Tikunov A., Khokhlova N., Provorova V., Tikunova N.

2018. Detection of causative agents of tick-borne rickettsioses in western Siberia, Russia: Identification of

Rickettsia raoultii and Rickettsia sibirica DNA in clinical samples. Clinical Microbiology Infection 24 (2):

199. e9-199.e12. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2017.06.003.

Jia N., Zheng Y.-C., Ma L., Huo Q.-B., Ni X.-B., Jiang B.-G., Chu Y.-L., Jiang R.-R., Jiang J.-F., Cao W.-C. 2014.

Human infections with Rickettsia raoultii, China. Emerging Infectious Diseases 20 (5): 866-868. https://doi.

org/10.3201/eid2005.130995

Jiang J., You B.J., Liu E., Apte A., Yarina T.R., Myers T.E., Lee J.S., Francesconi S.C., O’Guinn M.L., Tsertsvadze

N., Vephkhvadze N., Babuadze G., Sidamonidze K., Kokhreidz M., Donduashvili M., Onashvili T., Ismayilov

A., Agayev N., Aliyev M., Muttalibov N., Richards A.L. 2012. Development of three quantitative real-time

PCR assays for the detection of Rickettsia raoultii, Rickettsia slovaca, and Rickettsia aeschlimannii and their

validation with ticks from the country of Georgia and the Republic of Azerbaijan. Ticks and Tick-Borne

Diseases 3 (5-6): 327-331. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2012.10.004

Kumar S., Stecher G., Tamura K. 2016. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger

datasets. Molecular Biology and Evolution 33 (7): 1870-1874. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054

Liu H., Li Q., Zhang X., Li Z., Wang Z., Song M., Wei F., Wang S., Liu Q. 2016. Characterization of rickettsiae

in ticks in northeastern China. Parasite and Vectors 9 (1): 498. https://doi.org/10.1186/s13071-016-1764-2

Liz J.S., Anderes L., Sumner J.W., Massung R.F. 2000. PCR detection of granulocytic ehrlichiae in Ixodes ricinus

ticks and wild small mammals in western Switzerland. Journal of Clinical Microbiology 38: 1002-1007.

Mediannikov O., Matsumoto K., Samoylenko I., Drancourt M., Roux V., Rydkina E., Davoust B., Tarasevich I.,

Brouqui P., Fournier P.-E. 2008. Rickettsia raoultii sp. nov., a spotted fever group rickettsia associated with

Dermacentor ticks in Europe and Russia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology

58 (Pt 7): 1635-1639. https://doi.org/10.1099/ijs.0.64952-0

Mierzejewska E.J., Pawełczyk A., Radkowski M., Welc-Falęciak R., Bajer A. 2015. Pathogens vectored by the tick,

Dermacentor reticulatus, in endemic regions and zones of expansion in Poland. Parasites and Vectors 8 (1):

490. https://doi.org/10.1186/s13071-015-1099-4

Mikryukova T.P., Moskvitina N.S., Kononova Y.V., Korobitsyn I.G., Kartashov M.Y., Tyutenkov O.Y., Protopopova

E.V., Romanenko V.N., Chausov E.V., Gashkov S.I., Konovalova S.N., Moskvitin S.S., Tupota N.L.,

Sementsova A.O., Ternovoi V.A., Loktev V.B. 2014. Surveillance of tick-borne encephalitis virus in wild

birds and ticks in Tomsk city and its suburbs (Western Siberia). Ticks and Tick-Borne Diseases 5 (2):145-

151. doi: 10.1016/j.ttbdis.2013.10.004

Nooroong P., Trinachartvanit W., Baimai V., Ahantarig, A. 2018. Phylogenetic studies of bacteria (Rickettsia,

Coxiella and Anaplasma) in Amblyomma and Dermacentor ticks in Thailand and their co-infection. Ticks

and Tick-Borne Diseases 9 (4): 963-971. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2018.03.027

367

Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., 2012. Unipro UGENE: A Unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics

28 (8): 1166-1167. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091

Parola P., Paddock C.D., Socolovschi C., Labruna M.B., Mediannikov O., Kernif T., Abdad M.Y., Stenos J., Bitam I.,

Fournier P. E., Raoult D. 2013. Update on tick-borne rickettsioses around the world: a geographic approach.

Clinical Microbiology Reviews 26 (4): 657-702. https://doi.org/10.1128/CMR.00032-13

Rar V., Livanova N., Tkachev S., Kaverina G., Tikunov A., Sabitova Y., Igolkina Y., Panov V., Livanov S., Fomenko

N., Babkin I., Tikunova N. 2017. Detection and genetic characterization of a wide range of infectious agents

in Ixodes pavlovskyi ticks in Western Siberia, Russia. Parasites and Vectors 10 (1): 258. doi: 10.1186/

s13071-017-2186-5

Reye A.L., Stegniy V., Mishaeva N.P., Velhin S., Hübschen J.M., Ignatyev G., Muller C.P. 2013. Prevalence of tick-

borne pathogens in Ixodes ricinus and Dermacentor reticulatus ticks from different geographical locations in

Belarus. PLoS ONE 8 (1): e54476. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0054476

Rydkina E., Roux V., Fetisova N., Rudakov N., Gafarova M., Tarasevich I., Raoult D. 1999. New Rickettsiae in

ticks collected in territories of the former Soviet Union. Emerging Infection Diseases 5 (6): 811-814. https://

doi.org/10.3201/eid0506.990612

Ternovoi V.A., Gladysheva A.V., Ponomareva E.P., Mikryukova T.P., Protopopova E.V., Shvalov A.N., Konovalova

S.N., Chausov E.V., Loktev V.B. 2019. Variability 3ˊ untranslated region genome of the tick-borne encephalitis

viruses as possible factor for viral evolution. Virus Genes. 55 (4): 448-457. https://doi.org/10.1007/s11262-

019-01672-0

Tijsse-Klasen E., Hansford K. M., Jahfari S., Phipps P., Sprong H., Medlock J. M. 2013.,Spotted fever group

rickettsiae in Dermacentor reticulatus and Haemaphysalis punctata ticks in the UK. Parasites and Vectors 6

(1): 212. https://doi.org/10.1186/1756-3305-6-212

Tkachev S.E., Tikunov A.Y., Babkin I.V., Livanova N.N., Livanov S.G., Panov V.V., Yakimenko V.V., Tantsev A.K.,

Taranenko D.E., Tikunova N.V. 2017. Occurrence and genetic variability of Kemerovo virus in Ixodes ticks

from different regions of Western Siberia, Russia and Kazakhstan. Infection Genetics and Evolution 47:

56-63. doi: 10.1016/j.meegid.2016.11.007

Shpynov S., Fournier P.-E., Rudakov N., Tarasevich I., Raoult D. 2006. Detection of members of the genera

Rickettsia, Aanaplasma, and Ehrlichia in ticks collected in the Asiatic part of Russia. Annals of the New York

Academy of Sciences 1078: 378-383. https://doi.org/10.1196/annals.1374.075

Silva-Pinto A., Santos M. de L., Sarmento A. 2014. Tick-borne lymphadenopathy, an emerging disease. Ticks and

Tick-Borne Diseases 5 (6): 656-659. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2014.04.016

Song, S., Chen, C., Yang, M., Zhao, S., Wang, B., Hornok, S., Makhatov, B., Rizabek, K., Wang, Y. 2018. Diversity

of Rickettsia species in border regions of northwestern China. Parasites and Vectors 11 (1): 634. https://doi.

org/10.1186/s13071-018-3233-6

Sprong H., Fonville M., Docters van Leeuwen A., Devillers E., Ibañez-Justicia A., Stroo A., Hansford K.,

Cull B., Medlock J., Heyman P., Cochez C., Weis L, Silaghi C., Moutailler S. 2019. Detection of pathogens

in Dermacentor reticulatus in northwestern Europe: evaluation of a high-throughput array. Heliyon 5 (2):

e01270. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e01270

Sumner J.W., Nicholson W.L., Massung R.F., 1997. PCR amplification and comparison of nucleotide sequences

from the groESL heatshock operon of Ehrlichia species. Journal of Clinical Microbiology 35: 2087-2092.

Świtaj K., Chmielewski T., Borkowski P., Tylewska-Wierzbanowska S., Olszynska-Krowicka M., 2012. Spotted

fever rickettsiosis caused by Rickettsia raoultii - case report. Przeglad Epidemiologiczny 66 (2): 347-50.

Zajac V., Wojcik-Fatla A., Sawczyn A., Cisak E., Sroka J., Kloc A., Zajac Z., Buczek A., Dutkiewicz J., Bartosik K.

2017. Prevalence of infections and co-infections with 6 pathogens in Dermacentor reticulatus ticks

collected in eastern Poland. Annals of Agricultural Environmental Medicine 24 (1): 26-32. https://doi.

org/10.5604/12321966.1233893

GENOTYPING OF TICK-BORNE INFECTIONS IN DERMACENTOR RETICULATUS

TICKS COLLECTED IN URBAN FOCI OF TOMSK

M. Y. Kartashov, T. P. Mikryukova, E. I. Krivosheina, A. I. Kuznetsov, V. N. Romanenko,

N. S. Moskvitina, V. A. Ternovoi, V. B. Loktev

Keywords: Dermacentor reticulatus, tick-borne infection, Rickettsia raoultii, Anaplasma

phagocytophilum, tick-borne encephalitis virus, urban foci, Tomsk.

368

SUMMARY

In autumn 2015, a more than two hundred fold in the number of Dermacentor reticulatus (Fabric,

1794) ticks were discovered in urban foci of Tomsk. Therefore, it was possible to collect 450 adult

D. reticulatus ticks in urban foci of Tomsk during 2016-2017 and to test genetic markers for six viral

and bacterial tick-borne infections by PCR analysis of individual ticks. Tick-borne infection genetic

markers for Rickettsia spp., tick-borne encephalitis virus (TBEV) and Anaplasma phagocytophilum

were detected in approximately 44-48 %, 0.7-0.9 %, and 0.6 % ticks, respectively. No genetic material

of Kemerovo virus, Borrelia spp. and Coxiella burnetii was revealed.

Rickettsia isolates were genotyped with using of nucleotide sequences for five genes (gltA, 16S

рРНК, ompA, ompB, geneD) and all isolates were classified as Rickettsia raoultii. The analysis of

complete nucleotide sequences these genes demonstrated that Tomsk isolates were genetically close

to R. raoultii isolates from France. The level of identity for nucleotide sequences groESL operon of

A. phagocytophilum constituted about 99 % with isolates earlier identified in the Tomsk region. Analysis

of TBEV sequences has revealed the genetic material of the Siberian and Far Eastern subtypes of TBEV.

Thus, D. reticulatus ticks actively participated in the formation of the urban foci of tick-borne

infections in Tomsk where they participate in the circulation of R. raoultii, A. phagocytophilum,

Siberian and Far Eastern genotypes of TBEV.

369