РАСТЕНИЕВОДСТВО И СЕЛЕКЦИЯ

УДК 579.64:57.084.1

DOI: 10.31857/2500-2082/2023/5/64-67, EDN: XFQRTS

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ШТАММА BACILLUS ATROPHAEUS ВКПМ В-11474,

ПЕРСПЕКТИВНОГО ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МИКРОБНОГО БИОПРЕПАРАТА

КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ*

Ольга Борисовна Сопрунова¹, доктор биологических наук, профессор

Вера Евгеньевна Сопрунова¹, старший преподаватель

Анна Викторовна Луценко^{1, 2}, кандидат биологических наук, доцент

Нармина Муталлимага-кызы Габитова², ассистент

¹ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет», г. Астрахань, Россия

²ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России, г. Астрахань, Россия

E-mail: soprunova@mail.ru

Аннотация. Исследована безопасность для здоровья человека и животных основного компонента (штамм Bаcillus atrophaeus

В-11474) микробного биопрепарата комплексного действия для повышения урожайности и защиты сельскохозяйственных

растений от болезней по показателям вирулентности, острой токсичности, токсигенности и способности к диссеминации.

Представители рода Bacillus известны как продуценты широкого спектра соединений-антагонистов различной струк-

туры (бактериоцины, антимикробные пептиды и липопептиды, поликетиды и сидерофоры), обладающих ростостимули-

рующими и защитными свойствами. Тестированием на белых мышах линии Balb/c установлена непатогенность штамма

Bаcillus atrophaeus В-11474. Исследуемый штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов

(ВКПМ). Работу с животными проводили с соблюдением всех требований и этических норм, соответствующих правилам

GLP. Результаты изучения суспензии живой культуры Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 не выявили негативного влияния

на подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии вирулентности, острой токсичности, токсигенности

и диссеминации. Мыши активно потребляли корм и воду, были подвижны, с адекватной реакцией на экспериментаторов

и физические факторы, летального исхода не наблюдали. При вскрытии животных видимых изменений во внутренних орга-

нах не было - легкие, сердце, почки, селезенка, печень нормальной структуры и окраски. В мазках-отпечатках внутренних

органов тестируемая культура не обнаружена. Штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 - перспективный компонент

биопрепарата, безопасный для применения в сельском хозяйстве и может быть использован в дальнейших исследованиях.

Ключевые слова: штамм Bаcillus atrophaeus В-11474, безопасность, бактерии, живая культура, патогенность, токсич-

ность, токсигенность

SAFETY ASSESSMENT OF BACILLUS ATROPHAEUS STRAIN VKPM V-11474,

WHICH IS PROMISING FOR THE DEVELOPMENT

OF A MICROBIAL BIOLOGICAL PRODUCT WITH COMPLEX ACTION

O.B.Soprunova¹, Grand PhD in Biological Sciences, Professor

V.E. Soprunova¹, Senior Lecturer

A.V.Lutsenko^{1, 2}, PhD in Biological Sciences, Associate Professor

N.M.Gabitova², Assistant

¹Astrakhan State Technical University, Astrakhan, Russia

²Astrakhan State Medical University of the Ministry of Health of the Russian, Astrakhan, Russia

E-mail: soprunova@mail.ru

Abstract. Representatives of the genus Bacillus are known as producers of a wide range of antagonist compounds of different structures

(bacteriocins, antimicrobial peptides and lipopeptides, polyketides and siderophores) with growth-stimulating and protective properties.

A necessary condition for the use of microbial objects in biotechnological processes is safety for human and animal health. The safety of

Bacillus atrophaeus B-11474 strain, which is the basis of a microbial biopreparation of complex action to increase the yield and protect

agricultural plants from diseases according to the indicators of virulence, acute toxicity, toxigenicity and ability to dissemination was

studied. The non-pathogenicity of Bacillus atrophaeus strain B-11474 was established by testing on white Balb/c mice. The studied

strain was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM). The experiment was performed in compliance

with all established regulatory requirements for work with laboratory animals according to GLP rules and ethical ethical standards for

handling animals. The results of investigation of Bacillus atrophaeus VKPM B-11474 live culture suspension revealed no adverse effect

on the experimental animals, indicating the absence of virulence, acute toxicity, toxigenicity and dissemination. Mice actively consumed

food and water, were motile, with adequate response to experimenters and physical factors, no lethal outcome was observed. The autopsy

has shown that the surface of the internal organs was smooth, without visible pathology, with normal color and of dense structure. The test

culture was not found in smears-imprints of internal organs. It was shown that Bacillus atrophaeus strain VKPM B-11474 is promising

for obtaining a biopreparation safe for use in agriculture and can be used for further research.

Keywords: safety, bacteria, live culture, pathogenicity, toxicity, toxigenicity

* Исследования проведены за счет средств на выполнение государственного задания в рамках НИОКР «Аборигенные ми-

кроорганизмы - основа новых эко- и агробиотехнологий Прикаспийского региона» (№ 123031400044-2) / The research was

carried out at the expense of funds for the implementation of the state task within the framework of R&D “Indigenous microorganisms -

the basis of new eco- and agrobiotechnologies of the Caspian region” (No. 123031400044-2).

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 5-2023

РАСТЕНИЕВОДСТВО И СЕЛЕКЦИЯ

Основные средства защиты растений - хими-

Безопасность Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474

ческие пестициды, но их могут полностью или

определяли по показателям: вирулентность, острая

частично заменить биологические препараты, для

токсичность, токсигенность и способность к диссе-

разработки которых используют различные плес-

минации. Исследуемое вещество вводили паренте-

невые грибы и бактерии, в том числе рода Bacil-

рально (внутрибрюшинно).

lus. [5, 7, 9, 11] Они известны как продуценты

Вирулентность устанавливали после вве-

широкого спектра соединений-антагонистов раз-

дения мышам 1 мл суточной живой культуры

личной структуры (бактериоцины, антимикробные

Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 концентрацией

пептиды и липопептиды, поликетиды и сидерофо-

1,0×10⁷КОЕ/мышь. В эксперименте использовали

ры), обладающих ростостимулирующими и защит-

20 мышей, по 10 особей в каждой группе. Наблю-

ными свойствами. [15] Bacillus atrophaeus - пер-

дали за животными в течение 30 сут. Для изучения

спективный вид бактерий для получения биопрепа-

способности к диссеминации проводили их забой

ратов, повышающих урожайность и защищающих

и вскрытие (через каждые семь суток) с соблюде-

растения от болезней. [2, 6] Но их применение

нием установленных требований для паталогоана-

может сопровождаться загрязнением окружаю-

томического исследования на основании макро-

щей среды и оказывать неблагоприятное влияние

скопического (визуальная оценка легких, сердца,

на здоровье людей. В соответствии с ФЗ РФ № 492

почек, селезенки, печени) и микроскопического

«О биологической безопасности в Российской Фе-

(внутренние органы высевали методом отпечатков

дерации», биологическая безопасность - состояние

на мясопептонный агар, полученные колонии окра-

защищенности населения и окружающей среды от

шивали по Граму и микроскопировали) анализов.

воздействия опасных биологических факторов, при

Острую токсичность определяли после одно-

котором обеспечивается допустимый уровень био-

кратного введения бактериальной суспензии тер-

логического риска. Все микроорганизмы, исполь-

моинактивированной культуры Bacillus atrophaeus

зуемые в различных сферах, в том числе сельском

ВКПМ В-11474 (концентрация 1,0×10¹⁰ КОЕ/мышь)

хозяйстве, должны быть оценены по уровню пато-

внутрибрюшинно мышам опытной группы. Всего

генности и отвечать установленным требованиям

было две группы животных, по 10 особей в каждой.

безопасности. [10, 13].

Наблюдали за мышами в течение 14 дн. (клинический

Цель работы - исследовать безопасность штам-

осмотр, взвешивание, регистрация потребления пищи

ма Bаcillus atrophaeus В-11474, как основного компо-

и воды).

нента микробного биопрепарата, предназначенного

Токсигенность проверяли после внутрибрю-

для повышения урожайности и защиты сельскохо-

шинного введения мышам фильтрата исследуемой

зяйственных растений от болезней, по показателям

культуры микроорганизмов в разных дозировках

вирулентности, острой токсичности, токсигенности

(по 1,0 и 1,7 мл трехсуточной и 0,8, и 1,5 мл семи-

и способности к диссеминации.

суточной). В эксперименте использовали 80 особей,

по 10 мышей в группе. Наблюдали за животными

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

30 сут., в течение которых проводили клинический

осмотр, взвешивание, регистрировали потребление

Объект исследований - штамм Bаcillus atrophaeus,

пищи и воды.

изолированный из природной среды в научно-ис-

Результаты экспериментов обрабатывали стати-

следовательской лаборатории микробиологическо-

стически, используя пакет программ «BioStat-2009»

го мониторинга кафедры «Прикладная биология

(Analist Soft Ins., США) и Microsoft Exel.

и микробиология» ФГБОУ ВО «Астраханский го-

сударственный технический университет» по стан-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

дартным методикам, депонирован во Всероссий-

ской Коллекции Промышленных Микроорганизмов

При определении вирулентности и диссемина-

(ВКПМ) под номером В-11474. [8]

ции за весь срок наблюдения у мышей отсутствова-

Безопасность живой культуры Bacillus atrophaeus

ли признаки интоксикации, групповая масса тела

ВКПМ В-11474 оценивали на базе вивария ФГБУ

увеличилась и все животные остались живы, что

«Научно-исследовательский институт по изучению

свидетельствует о том, что минимальная смертель-

лепры», входящего в состав ФГБОУ ВО Астрахан-

ная доза не установлена и превышает 1,0×10⁷КОЕ/

ский ГМУ Минздрава России (на основании При-

мышь. Штамм микроорганизмов в данной концен-

каза Министерства здравоохранения Российской

трации не обладает вирулентностью. У вскрытых

Федерации от 01.11.2021 № 1029 с 01.04.2022 года).

мышей патологоанатомических изменений не об-

В работе использовали 120 белых мышей одно-

наружено, структура внутренних органов гладкая,

го рода и происхождения (линия Balb/c) массой

плотная, нормальной окраски. В мазках-отпечатках

18…22 г, которых в период адаптации и на про-

тестируемая культура не выявлена. При визуаль-

тяжении всего эксперимента содержали с соблю-

ной оценке внутренних органов лабораторных жи-

дением всех установленных нормативных требо-

вотных опытной и контрольной групп различий не

ваний и этических норм обращения с животными

обнаружено. Полученные данные свидетельствуют

(карантин, санитарный контроль, режим питания,

об отсутствии способности штамма к диссемина-

освещения и другое), соответствующих правилам

ции во внутренние органы и их бактериальному

GLP. [1, 3, 4]

поражению.

Мышам контрольной группы вводили физиоло-

При определении острой токсичности у мышей

гический раствор в объеме, аналогичном дозе при-

не было признаков нарушения здоровья и потери

меняемых суспензий для опытных животных.

массы тела (табл. 1), летального исхода не наблю-

РАСТЕНИЕВОДСТВО И СЕЛЕКЦИЯ

Таблица 1.

Динамика массы тела лабораторных мышей при изучении острой токсичности

Период

Масса мышей (г) при введении дозы (1мл) исследуемого вещества концентрацией 1,0х10¹⁰ КОЕ/мышь

До введения исследуемого вещества

19,3±0,3

14 дней после введения

20,4 ±0,3

Таблица 2.

Динамика выживаемости лабораторных мышей при изучении острой токсичности

Группа

Концентрация вводимого вещества, 1мл (КОЕ/мышь)

Выживаемость, %

Опытная

100

1,0х10¹⁰

Контрольная

100

дали (табл. 2). Отмечали их адекватную реакцию

6. Коряжкина М.Ф. Bacillus atrophaeus SKD-1 как пер-

на манипуляции экспериментаторов, не визуали-

спективный штамм для разработки биопрепарата //

зировали изменений состояния шерсти, кожных

Юг России: экология, развитие. 2010. Т. 5. № 4. С. 80-

покровов и слизистых. Полученные данные сви-

82. DOI: 10.18470/1992-1098-2010-4-80-82.

детельствуют о том, что тестируемая культура в ис-

7. Павлюшин В.А., Новикова И.И., Бойкова И.В. Ми-

следуемой концентрации (1,0×10¹⁰ КОЕ/мышь) не

кробиологическая защита растений в технологиях

оказывает неблагоприятного воздействия на белых

фитосанитарной оптимизации агроэкосистем: теория

мышей и, следовательно, не обладает острой ток-

и практика (обзор) // Сельскохозяйственная био-

сичностью.

логия. 2020. Т. 55. № 3. С. 421-438. DOI: 10.15389/

При определении токсигенности в течение

agrobiology.2020.3.421rus

30 сут. после введения фильтратов бактериальной

8. Патент РФ на изобретение № 2655848. 29.05.2018 Бюл.

культуры проводили клинический осмотр экспе-

№ 16. МПК A01N 63/02, A01P 21/00. Сопрунова О.Б.,

риментальных животных, взвешивание, регистри-

Баубекова Д.Г., Байрамбеков Ш.Б. и др. Средство для

ровали потребления пищи и воды. Установлено

повышения урожайности и защиты растений семей-

отсутствие влияния всех примененных дозировок

ства пасленовых от фитопатогенных грибов. EDN:

на массу тела животных. Реакции на манипуляции

YXVAAT. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=37372136

экспериментаторов и на физические (освещение,

9. Петровский А.С., Каракотов С.Д. Микробиологиче-

шум и другое) раздражители оставались адекватны-

ские препараты в растениеводстве. Альтернатива или

ми, что свидетельствует о том, что культура не ток-

партнерство? // Защита и карантин растений. 2017. № 2.

сигенная для теплокровных животных.

С. 14-18. https://www.elibrary.ru/item.asp?id=28360468

Таким образом, Bacillus atrophaeus ВКПМ

10. Римарева Л.В., Серба Е.М., Оверченко М.Б. и др. На-

В-11474 не обладает патогенными свойствами

учно-экспериментальное обоснование безопасности

(острая токсичность, токсигенность, способность

биотехнологической продукции для пищевой про-

к вирулентности и диссеминации) в исследованных

мышленности // Вестник российской сельскохозяй-

концентрациях и может быть использован в даль-

ственной науки. 2019. № 1. С. 40-43. DOI: 10.30850/

нейших разработках по получению биопрепарата

vrsn/2019/1/40-43

для применения в сельском хозяйстве.

11. Сидорова Т.М., Асатурова А.М., Хомяк А.И. Биологи-

чески активные метаболиты Bacillus subtilis и их роль в

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

контроле фитопатогенных микроорганизмов // Сель-

1. Асташкин Е.И., Ачкасов Е.Е., Афонин Е.Е. и др. Ру-

скохозяйственная биология. 2018. Т. 53. № 1. С. 29-37.

ководство по лабораторным животным и альтернатив-

DOI: 10.15389/agrobiology.2018.1.29rus.

ным моделям в биомедицинских исследованиях. М.:

12. Чеботарь В.К., Петров В.Б., Шапошников А.И., Крав-

Профиль-2С, 2010. 358 с. ISBN 978-5-903950-10-2.

ченко Л.В. Биохимические критерии оценки агроно-

2. Баубекова Д.Г., Сопрунова О.Б., Байрамбеков Ш.Б.,

мически значимых свойств бацилл, используемых при

Полякова Е.В. Влияние биологического средства за-

создании микробиологических препаратов // Сель-

щиты растений на микробиоценоз сельскохозяйствен-

скохозяйственная биология. 2011. Т. 46. № 3. С. 119-

ных почв в условиях аридного климата // Юг России:

122. http://www.agrobiology.ru/3-2011chebotar'.html

экология, развитие. 2020. Т. 15. № 2. C. 78-90. DOI:

13. Шеина Н.И. Критерии оценки биобезопасности ми-

10.18470/1992-1098-2020-2-78-90.

кроорганизмов, используемых в биотехнологической

3. Виноградов П.Н., Шевченко С.С., Седов О.Л. и др.

промышленности // Вестник Оренбургского государ-

РД-АПК 3.10.07.02-09. Методические рекомендации

ственного университета. 2012. № 6 (142). С. 165-169.

по содержанию лабораторных животных в вивариях

http://vestnik.osu.ru/doc/1033/article/6478/lang/0

научно-исследовательских институтов и учебных за-

14. Штерншис М.В., Беляев А.А., Цветкова В.П. и др.

ведений. Минсельхоз РФ, М., 2009. 27 с.

Биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus для

4. ГОСТ 33044-2014 Принципы надлежащей лабораторной

управления здоровьем растений. Новосибирск: Из-

практики, с поправкой, М.: Стандартинформ. 2019. 16 с.

дательство Сибирского отделения РАН, 2016. 233 с.

5. Захарова Н.Г., Сираева З.Ю., Демидова И.П., Его-

ISBN 978-5-7692-1496-7. EDN: XBZXBV.

ров С.Ю. Создание биопрепаратов, перспективных для

15. Fira D., Dimkić I., Berić T., Lozo J., Stanković S. Bio-

сельского хозяйства // Ученые записки Казанского госу-

logical control of plant pathogens by Bacillus species //

дарственного университета. 2006. Т. 148. № 2. С. 102-111.

Journal of biotechnology. 2018. Vol. 285. PP. 44-55. DOI:

https://kpfu.ru/portal/docs/F356003983/148_2_est_10.pdf

10.1016/j.jbiotec.2018.07.044.

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 5-2023

РАСТЕНИЕВОДСТВО И СЕЛЕКЦИЯ

REFERENCES

paslenovyh ot fitopatogennyh gribov. EDN: YXVAAT.

Astashkin E.I., Achkasov E.E., Afonin E.E. i dr. Rukovod-

https://www.elibrary.ru/item.asp?id=37372136

stvo po laboratornym zhivotnym i al’ternativnym modely-

9. Petrovskij A.S., Karakotov S.D. Mikrobiologicheskie

am v biomedicinskih issledovaniyah. M.: Profil-2S, 2010.

preparaty v rastenievodstve. Al’ternativa ili partnerstvo? //

358 s. ISBN 978-5-903950-10-2.

Zashchita i karantin rastenij. 2017. № 2. S. 14-18. https://

Baubekova D.G., Soprunova O.B., Bajrambekov Sh.B.,

www.elibrary.ru/item.asp?id=28360468

Polyakova E.V. Vliyanie biologicheskogo sredstva zashch-

10. Rimareva L.V., Serba E.M., Overchenko M.B. i dr. Nauch-

ity rastenij na mikrobiocenoz sel’skohozyajstvennyh pochv

no-eksperimental’noe obosnovanie bezopasnosti biotekh-

v usloviyah aridnogo klimata // Yug Rossii: ekologiya,

nologicheskoj produkcii dlya pishchevoj promyshlennos-

razvitie. 2020. T. 15. № 2. C. 78-90. DOI: 10.18470/1992-

ti // Vestnik rossijskoj sel’skohozyajstvennoj nauki. 2019.

1098-2020-2-78-90.

№ 1. S. 40-43. DOI: 10.30850/vrsn/2019/1/40-43.

Vinogradov P.N., Shevchenko S.S., Sedov O.L. i dr. RD-

11. Sidorova T.M., Asaturova A.M., Homyak A.I. Biologich-

APK 3.10.07.02-09. Metodicheskie rekomendacii po

eski aktivnye metabolity Bacillus subtilis i ih rol’ v kontrole

soderzhaniyu laboratornyh zhivotnyh v vivariyah nauch-

fitopatogennyh mikroorganizmov // Sel’skohozyajstven-

no-issledovatel’skih institutov i uchebnyh zavedenij. Min-

naya biologiya. 2018. T. 53. № 1. S. 29-37. DOI: 10.15389/

sel’hoz RF, M. 2009. 27 s.

agrobiology.2018.1.29rus.

GOST 33044-2014 Principy nadlezhashchej laboratornoj

12. Chebotar’ V.K., Petrov V.B., Shaposhnikov A.I.,

praktiki. s popravkoj, M.: Standartinform. 2019. 16 s.

Kravchenko L.V. Biohimicheskie kriterii ocenki agronom-

Zaharova N.G., Siraeva Z.Yu., Demidova I.P., Egorov

icheski znachimyh svojstv bacill, ispol’zuemyh pri sozdanii

S.Yu. Sozdanie biopreparatov, perspektivnyh dlya sel’skogo

mikrobiologicheskih preparatov // Sel’skohozyajstvennaya

hozyajstva // Uchenye zapiski Kazanskogo gosudarstven-

biologiya. 2011. T. 46. № 3. S. 119-122. http://www.agro-

nogo universiteta. 2006. T. 148. № 2. S. 102-111. https://

biology.ru/3-2011chebotar’.html

kpfu.ru/portal/docs/F356003983/148_2_est_10.pdf

13. Sheina N.I. Kriterii ocenki biobezopasnosti mikroorgan-

Koryazhkina M.F. Bacillus atrophaeus SKD-1 kak per-

izmov, ispol’zuemyh v biotekhnologicheskoj promyshlen-

spektivnyj shtamm dlya razrabotki biopreparata // Yug

nosti // Vestnik Orenburgskogo gosudarstvennogo univer-

Rossii: ekologiya, razvitie. 2010. T. 5. № 4. S. 80-82. DOI:

siteta. 2012. № 6 (142). S. 165-169. http://vestnik.osu.ru/

10.18470/1992-1098-2010-4-80-82.

doc/1033/article/6478/lang/0

Pavlyushin V.A., Novikova I.I., Bojkova I.V. Mikrobio-

14. Shternshis M.V., Belyaev A.A., Cvetkova V.P. i dr.ё Bio-

logicheskaya zashchita rastenij v tekhnologiyah fitosani-

preparaty na osnove bakterij roda Bacillus dlya upravleniya

tarnoj optimizacii agroekosistem: teoriya i praktika (ob-

zdorov’em rastenij. Novosibirsk: Izdatel’stvo Sibirskogo

zor) // Sel’skohozyajstvennaya biologiya. 2020. T. 55. № 3.

otdeleniya RAN, 2016. 233 s. ISBN 978-5-7692-1496-7.

S. 421-438. DOI: 10.15389/agrobiology.2020.3.421rus.

EDN: XBZXBV.

Patent RF na izobretenie № 2655848. 29.05.2018 Byul.

15. Fira D., Dimkić I., Berić T., Lozo J., Stanković S. Bio-

№ 16. MPK A01N 63/02, A01P 21/00. Soprunova O.B.,

logical control of plant pathogens by Bacillus species //

Baubekova D.G., Bajrambekov Sh.B. i dr. Sredstvo dlya

Journal of biotechnology. 2018. Vol. 285. PP. 44-55. DOI:

povysheniya urozhajnosti i zashchity rastenij semejstva

10.1016/j.jbiotec.2018.07.044.

Поступила в редакцию 19.05.2023

Принята к публикации 02.06.2023