Почвоведение, 2023, № 5, стр. 603-612

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность изучения актиномицетных сообществ в почвах различных биоклиматических зон и географических областей обусловлена в первую очередь широкомасштабным биотехнологическим использованием актиномицетов. С тех пор как З. Ваксман выделил из почвы штамм Streptomyces griseus (продуцента первого противотуберкулезного антибиотика стрептомицина), именно почвенные представители филума Actinomycetota стали предметом пристального внимания исследователей. Несмотря на то, что к настоящему времени выделено и описано около трех тысяч биологически активных молекул, продуцируемых стрептомицетами [25], потребность в обнаружении новых или уточнении природы открытых противомикробных соединений остается актуальной.

Наряду с исключительным среди других прокариот потенциалом антибиотического действия, актиномицеты играют важную роль в биогеохимическом круговороте, в процессах формирования и развития почв. Известно, что абсолютное и относительное обилие актиномицетов увеличиваются при переходе от почв холодного гумидного климата к почвам более южных и засушливых областей [2]. В современной литературе представлена информация об актиномицетных комплексах почв отдельных регионов с различным сочетанием факторов почвообразования, однако сведений об актинобиоте и ее антибиотическом потенциале в почвах, сформированных в условиях средиземноморской влажностной пульсации, недостаточно.

Оз. Кинерет находится на северо-востоке Израиля, в Иорданской рифтовой долине – одном из самых низких на Земле участков суши. Побережье озера расположено ниже уровня моря на 209–215 м [3]. Несмотря на сравнительно высокую минерализацию (содержание хлоридов около 300 мг/л), воды озера пригодны для питья, а само озеро служит крупнейшим резервуаром пресной воды в регионе [4].

Климат побережья оз. Кинерет ‒ субтропический средиземноморский, с продолжительным жарким засушливым летом и прохладной дождливой зимой. Территория относится к средиземноморской флористической области. Естественная растительность состоит из однолетних и многолетних трав (Oryzopsis sp., Avena sterilis, Hordeum bulbosum) и одиноко стоящих деревьев (Prunus amygdalus, Pistacia atlantica). Расширение сельскохозяйственных угодий и систем орошения вокруг озера привело к почти полному исчезновению естественной растительности [18, 28].

Почвенный покров побережья представлен широким спектром почв, сменяющих друг друга на очень малых расстояниях – в пределах нескольких метров. Почвообразующими породами служат рыхлые коры выветривания базальтов и базальтовых туфов с большим количеством тяжелого по гранулометрическому составу мелкозема [6]. Наиболее характерными для данной территории являются рендзины (Rendzinas), протогрумусоли (Cambisols, Lithosols) и грумусоли (Vertisols) [34]. Последние относятся к наиболее распространенным в этой сложной почвенной мозаике [28].

В настоящей работе представлены результаты исследования состава и антибиотического потенциала актиномицетного комплекса грумусоли и характеристика выделенного из этой почвы нового продуцента ценного антибиотика – боррелидина.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Отбор образцов и выделение актиномицетов. Образцы для исследования отбирали из верхнего слоя (0–10 см) темной cлитой трещиноватой глинистой почвы, соответствующей описанию грумусолей [6], согласно мировой коррелятивной базе почвенных ресурсов WRB, Vertisols.

Отбор проводили в феврале 2018 г. под злаковым разнотравьем на окраине г. Тверия, расположенного на западном берегу оз. Кинерет (32°46′43″ N, 35°31′36″ Е) (рис. S1 ). Анализировали три смешанных образца, каждый из которых составляли объединением пяти индивидуальных проб, отобранных на площади 100 м². Актинобактерии выделяли при поверхностном посеве из разведений почвенных суспензий на казеин-глицериновый агар и среду с пропионатом натрия [9]. В качестве селективного приема почву перед посевом прогревали при 100°С в течение 1 ч. После инкубации (28°С, 21 сут) отбирали выросшие колонии мицелиальных прокариот, объединяя их в отдельные морфотипы, согласно общности культуральных и морфологических признаков. Чистоту выделенных культур определяли общепринятыми методами: микроскопически и высевом на агаризованную минеральную среду Гаузе 1 [1]. Отобранные штаммы поддерживали на скошенном овсяном агаре при +4°С, а при длительном хранении ‒ в виде споровых суспензий в 20% глицероле при ‒80°С.

Скрининг антибиотической активности. Скрининг выделенных штаммов на антибиотическую активность проводили с использованием репортерной флуоресцентной системы на основе штамма Escherichia coli JW5503 ΔtolC с внедренной плазмидой pDualrep2, которая позволяет одновременно с классическим тестом на эффективность ингибирования роста определять механизм действия антибиотика [23]. Выделенные из посева актиномицеты выращивали в течение 10 сут на овсяном агаре, затем из агара с культурами вырезали блоки диаметром 5 мм и помещали их на плотную среду Luria Bennet, предварительно засеянную репортерным штаммом. В присутствии ингибиторов синтеза белка или молекул, нарушающих репликацию ДНК, репортерный штамм после инкубации (37°С, 18 ч) способен вырабатывать флуоресцентные белки RFP и Katushka2S, которые визуализируются в сканере ChemiDoc (Bio-Rad) в каналах Су-3 и Су-5 соответственно.

Установление химической природы активного вещества. Экстракция и очистка активного вещества. Штамм 3IZ-6, отобранный при первичном антибиотическом скрининге, выращивали в погруженной культуре (30°С, 10 сут) на шейкере (2000 об./мин) в среде состава (г/л): мальтоза – 10, пептон – 10, гидролизат казеина – 2, дрожжевой экстракт – 2, NaCl – 6. Освобожденную от клеток культуральную жидкость (КЖ) наносили на хроматографическую колонку Poly-Prep Columns (Bio-Rad) с сорбентом LPS-500H (Техносорбент) и затем элюировали в градиенте вода-ацетонитрил (v/v). С помощью скрининга на репортерной системе выявляли активную фракцию. Разделение, очистку и идентификацию целевого вещества осуществляли методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии как описано ранее [30].

Изучение механизма действия активного вещества. Активную фракцию, полученную методом твердофазной экстракции КЖ штамма 3IZ-6, концентрировали на вакуумном испарителе (SpeedVac®) и использовали для определения минимальной ингибирующей концентрации в отношении репортерного штамма E. coli JW5503 ΔtolC pDualrep2 [26].

Эту фракцию использовали в toe-print анализе [22] и для изучения трансляции in vitro [7] с помощью готового набора E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega) согласно инструкции производителя. Трансляцию проводили в течение 30 мин при 37°С, кинетику реакции детектировали на приборе Victor X5 2030 (Perkin Elmer): каждую точку измеряли 30 раз, интервал между раундами измерения составлял 30 с.

Полифазная идентификация штамма-продуцента. Описание культуральных и морфологических признаков. Культуральные признаки штамма 3IZ-6 учитывали после 21-дневной инкубации при 28°C на мальтозо-дрожжевом (ISP 2), овсяном (ISP 3), крахмало-нитратном (ISP 4), глицерол-аспарагиновом (ISP 5), пептонно-дрожжевом агаре с железом (ISP 6) и тирозиновом агаре (ISP 7) [27]. Окраску воздушного и субстратного мицелия оценивали по шкале RAL CLASSIC® и сопоставляли с аналогичными данными, приведенными для близких штаммов в базе BacDive (https://bacdive. dsmz.de/).

Форму цепочек и орнаментации поверхности спор изучали с помощью светового (Fisherbrand AX-502, Thermo Fisher Scientific) и сканирующего электронного микроскопа (Camscan-S2).

Определение физиологических особенностей. Рост штамма 3IZ-6 при различных температурах (от 4 до 50°C), в диапазоне рН (от 4 до 11 ед.) и при различных концентрациях NaCl (1, 2.5, 5, 6 и 7.5%) оценивали на среде Гаузе 1 после инкубации в течение 8 сут.

Утилизацию природных полимеров, а также способность образовывать кислоту при росте на среде с различными источниками углерода (рис. S2 ) оценивали как описано ранее [32, 33].

Для оценки чувствительности штамма 3IZ-6 к различным антибиотикам использовали диски индикаторные ДИ-ПЛС-50-01 по ТУ 9398-001-39484474-2000 (НИЦФ, Россия).

Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК штамма 3IZ-6 проводили с использованием универсальных бактериальных праймеров 16SF75 (5'-AGTGGCGGACGGGTGAGTAA-3') и 16SR1100 (5'-TTACTAGCGATTCCGACTTCA-3'). Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) выполняли при следующих условиях: начальная денатурация при 95°С в течение 4 мин, далее 32 цикла (94°С в течение 20 с, 58°С в течение 30 с и 72°С в течение 45 с), после чего окончательное удлинение при 68°С в течение 5 мин. Продукты ПЦР секвенировали на анализаторе ДНК ABI3130xl (Thermo Fisher Scientific, USA) в НПК “Синтол” (Россия).

Прямые и обратные прочтения целевого фрагмента редактировали и собирали с помощью программы GeneStudio software Version 2.2.0.0. Итоговую последовательность 16S рРНК депонировали в GenBаnk (OK412986) (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/) и использовали для сравнительного филогенетического анализа с родственными типовыми штаммами стрептомицетов в программе MEGA software Version X (https://www.megasoftware.net). Для построения филограмм применяли методы присоединения соседей (Neighbor Joining, NJ) и максимального правдоподобия (Maximum Likelyhood, ML) для 1000 альтернативных деревьев. Эволюционные дистанции между последовательностями рассчитывали с помощью модели Тамуры-Ней (Tamura-Nei’s model).

Анализ ингибиторной активности штамма-продуцента против возбудителей болезней растений. Для оценки способности штамма 3IZ-6 угнетать развитие фитопатогенных микроорганизмов использовали штаммы из Всероссийской коллекции микроорганизмов (Пущино) и рабочей коллекции лаборатории биотехнологии растений и микроорганизмов ФАНЦ Северо-Востока (Киров) (табл. 1). Для роста тест-культур бактерий и оценки методом агаровых блоков антибактериальной активности штамма использовали среду RHM [10]. Культивирование фитопатогенных грибов и оценку их способности расти в присутствии штамма 3IZ-6 проводили на картофельно-декстрозном агаре [8] при 25°С в течение 10–12 сут.

Оценка фитотоксичности штамма 3IZ-6. Для оценки возможной фитотоксичности и выделения активного вещества штамм 3IZ-6 культивировали как описано выше. Семена пшеницы (Tritiсum aestivum L.) замачивали в нативной и разбавленной водой КЖ стрептомицета (1 : 10) на 20 ч и проращивали в рулонной водно-бумажной культуре (20°С, 5 сут), при фотопериоде 16 ч и освещенности 7 кЛк. В контроле семена замачивали в воде. В каждом варианте опыта закладывали в рулоны по 100 семян. Учитывали всхожесть, линейные размеры и воздушно-сухую биомассу проростков. Статистическую обработку данных выполняли стандартными методами с использованием пакета Microsoft Excel 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общая численность актиномицетов в образцах исследуемой почвы составила 10⁵–10⁶ колониеобразующих единиц/г, вне зависимости от используемой среды. Актиномицетный комплекс грумусолей включал представителей родов Streptomyces и олигоспоровые формы, которые разграничивали на основе характерных морфологических признаков: образование нефрагментирующегося мицелия, наличие спор на воздушном и/или субстратном мицелии, величина и количество спор в цепочках [12].

По частоте встречаемости (84%) и долевому участию (94.6%) в комплексе мицелиальных прокариот доминировали представители рода Streptomyces, что согласуется со многими литературными данными [2]. Олигоспоровые формы актиномицетов встречались с гораздо меньшей частотой (33%). Особенностью стрептомицетного комплекса грумусолей явилось доминирование видов, образующих различные пигменты (представителей секций и серий) [1]: Cinereus Violaceus (40%), Helvolo-Flavus Helvolus (20%) и небольшая доля неокрашенных видов: серии Cinereus Achromogenes (11.7%), что очевидно связано с необходимостью защиты клеток стрептомицетов от интенсивной инсоляции.

Для антибиотического скрининга отобрали 26 фенотипически различных стрептомицетов, которые наращивали в погруженных культурах и затем тестировали с помощью двойной репортерной системы. Изолят 3IZ-6 не только ингибировал рост штамма E. coli ΔtolC JW5503, трансформированного плазмидой pDualrep2, но и инициировал образование им флуоресцентного белка, что свидетельствует о наличии в КЖ штамма 3IZ-6 ингибиторов синтеза белка (рис. S3 ). Поэтому дальнейшая работа была сфокусирована на изучении данного изолята и синтезируемого им метаболита.

При помощи твердофазной экстракции КЖ штамма 3IZ-6 разделили на отдельные ацетонитриловые фракции. Наибольшей антибиотической активностью в отношении репортерной системы E. coli dtolC JW5503 pDualrep2 обладала фракция, полученная экстракцией 50%-ным раствором ацетонитрила в воде. Постановка реакции синтеза белка в бесклеточной системе показала, что выделенный образец подавляет синтез белка при содержании ниже минимальной ингибирующей концентрации (рис. S4 ), что позволяет рассматривать аппарат синтеза белка как его основную мишень. Разведения 1 : 10 и 1 : 100 активной фракции штамма 3IZ-6 полностью подавляют in vitro трансляцию, как и положительный контроль – 50 мкг/мл эритромицина.

Поскольку метаболит, образуемый штаммом 3IZ-6, оказал однозначное влияние на процесс биосинтеза белка, его было решено протестировать с помощью toe-print анализа для выявления стадии трансляции, на которую он воздействует (рис. S5 ). Остановка рибосомы произошла на треониновом кодоне в А-сайте рибосомы. Такую активность может демонстрировать известный ингибитор треонил-тРНК-синтетазы – боррелидин [19]. Присутствие боррелидина в образце 3IZ-6 подтверждено при помощи масс-спектрометрии (рис. 1).

Рис. 1.

Структура молекулы боррелидина (C₂₈H₄₃NO₆, молекулярная масса 489.6 г/моль) и спектр MS2.

Боррелидин – уникальный по структуре 18-членный нитрилсодержащий поликетидный макролактон с антибактериальной [11], антимикотической [15], антималярийной [24] и противовирусной активностью [20]. Боррелидин может воздействовать на раковые клетки, благодаря способности подавлять ангиогенез [21], индуцировать апоптоз и ингибировать треонил-тРНК-синтетазу [16]. Несмотря на широкий потенциал клинического действия, боррелидин пока не нашел широкого применения в медицинской практике из-за цитотоксичности в отношении здоровых клеток.

Для установления таксономического положения штамма 3IZ-6 использовали полифазный таксономический подход, включающий анализ комплекса как генетических, так и фенотипических признаков. Сравнение нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК штамма 3IZ-6 с последовательностями типовых представителей видов рода Streptomyces из базы данных GenBank выявило, что ближайшими видами со 100% сходством являются S. rochei DSM 40231^T и S. mutabilis DSM 40169^T. На филогенетическом древе они образуют вместе с 3IZ-6 отдельную кладу с высоким уровнем бутстрап-поддержки (рис. 2). По морфологическим и физиолого-биохимическим признакам эти виды очень близки, поэтому для их разграничения необходим полногеномный анализ. По культуральным признакам (цвету и текстуре воздушного мицелия на ISP-средах) штамм 3IZ-6 ближе к типовому S. rochei DSM 40231^T (табл. 2, рис. 3). Среди представителей вида S. rochei продуценты боррелидина обнаруживались неоднократно [11, 29, 31], есть данные о получении ацетилборрелидина В из культуры S. mutabilis [17]. Способность к синтезу данного антибиотика не ограничена строго определенным таксоном. Среди продуцентов боррелидина встречаются представители родов Streptomyces и Nocardiopsis, изолированные из различных местообитаний, включая эконишы с повышенной соленостью: океанические осадки, морские моллюски, мангровые отложения, засоленные почвы [10, 11, 18, 20, 23]. Предполагаем, что выделенный из грумисолей побережья оз. Кинерет продуцент боррелидина 3IZ-6 принадлежит к виду S. rochei.

Рис. 2.

Филогенетическое положение штамма 3IZ-6 и наиболее близких ему генетически типовых штаммов стрептомицетов, на основании NJ-анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК (в скобках указаны номера доступа последовательностей в GenBank). Указаны значения бутстрэп-анализа выше 60%. Масштаб соответствует одной замене на каждые 100 нуклеотидов. Знаком (*) отмечены ветви, также полученные с помощью ML-метода. Штамм Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 выбран как референсный организм, не принадлежащий к роду Streptomyces. Штаммы, у которых показана способность продуцировать боррелидин, отмечены В.

Рис. 3.

Электронная микрофотография штамма 3IZ-6 на среде ISP 3 на 14 сут инкубации при 28°С.

Ранее отмечено, что боррелидин может быть использован в защите растений для борьбы с Phytophthora sojae – возбудителем фитофтороза и стеблевой гнили сои (Glycine max) [15], а также против грибов Pythium sp. и Phytophthora sp., поражающих ряд важных сельскохозяйственных культур [14]. Результаты настоящих исследований показали способность штамма S. rochei 3IZ-6 подавлять рост почвообитающих фитопатогенных грибов Fusarium solani, F. sambucinum, Botrytis cinerea (рис. S6 ), вызывающих болезни у многих хозяйственно ценных видов растений.

В отношении фитопатогенов Bipolaris sorokinianа, F. proliferatum, F. сulmorum, F. oxysporum, Alternaria alternatа не выявлено угнетающего действия агаровых блоков с культурой S. rochei 3IZ-6, но отмечено умеренное угнетение роста сапротрофного гриба Trichoderma sp. (13 мм). Установлено, что S. rochei 3IZ-6 способен подавлять рост некоторых фитопатогенных бактерий. Наиболее значительным было угнетение роста Curtobacterium flaccumfaciens G29r4 (40 мм). Данный фитопатоген может вызывать бактериальное увядание фасоли (Phaseolus spp.), гороха (Pisum sativum), сои и некоторых других бобовых культур. Рядом международных комиссий по карантину и защите растений возбудитель C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens включен в число карантинных объектов (https://www.eppo.int).

Фитотоксичность боррелидина впервые отмечена у S. scabies, но его угнетающее действие было на порядок ниже, чем такстомина А [13]. Оценка фитотоксического действия S. rochei 3IZ-6 показала, что водорастворимые метаболиты изолята снижают всхожесть обработанных семян пшеницы на 15, длину корней проростков – на 52, высоту побега – на 46, биомассу – на 48% по сравнению с растениями, не подвергнутыми обработке (табл. 3). Поскольку степень фитотоксичности S. rochei 3IZ-6 варьировала в зависимости от условий культивирования и состава питательной среды, теоретически представляется возможным подобрать оптимальные параметры, обеспечивающие желаемую гербицидную активность данной культуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из грумусолей, сформированных в специфических условиях, связанных с закономерным сезонным чередованием продолжительных сухих и коротких влажных периодов, с использованием селективного приема получено 26 изолятов бактерий рода Streptomyces. В результате проведения антибиотического скрининга выделенных культур стрептомицетов выявлен штамм S. rochei 3IZ-6, содержащий, по данным репортерной флуоресцентной системы, ингибитор белкового синтеза, который с помощью постановки реакции in vitro трансляции, toe-print анализа и масс-спектрометрии идентифицирован как боррелидин. Антибиотик боррелидин и его дериваты в настоящее время интенсивно изучаются в связи с разработкой новых противораковых средств. Особый интерес представляет способность боррелидина ингибировать активность фермента треонил-тРНК-синтетазы, принимающего участие в синтезе белка. Исследования почвенного изолята S. rochei 3IZ-6 в качестве нового продуцента боррелидина является приоритетным направлением.

Вместе с тем в чистых культурах S. rochei 3IZ-6 продемонстрировал угнетающее действие в отношении почвообитающих фитопатогенных грибов F. solani, F. sambucinum, B. cinerea и бактерии C. flaccumfaciens, имеющих широких круг растений-хозяев из числа сельскохозяйственных культур. Так, перечисленные возбудители отличаются высокой вредоносностью в отношении зернобобовых, тыквенных, томата, перца и ряда других овощных и полевых культур, возделываемых в разнообразных почвенных условиях.

Наряду с антифитопатогенным действием, в лабораторных условиях установлена выраженная фитотоксичность водорастворимых метаболитов S. rochei 3IZ-6, в связи с чем целесообразно проведение исследований, связанных с разработкой на его основе препарата гербицидного действия. Представленные в работе данные свидетельствуют о перспективности использования выделенного из грумусоли побережья оз. Кинерет изолята в защите растений от фитопатогенов и сорняков.