Приборы и техника эксперимента, 2023, № 3, стр. 108-115

ВВЕДЕНИЕ

Хемилюминесценция (Хл) – процесс излучения квантов света в видимом диапазоне при протекании химической реакции. В основе этого явления лежит образование продукта химического взаимодействия, один из электронов которого находится на более высоком энергетическом уровне и стремится вернуться на основной энергетический уровень, реализуя избыточную энергию в виде светового излучения. Процесс Хл имеет важное прикладное значение и используется для наблюдения за сложными химическими и биологическими процессами путем регистрации излучаемого света.

В 40-х годах ХХ столетия немецкие ученые В. Лангенбек и У. Руге впервые использовали процесс Хл для определения содержания пероксида водорода (H₂O₂) в водных растворах [1]. Метод основан на реакции взаимодействия люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) и H₂O₂ в присутствии катализатора. Авторы наблюдали свечение, которое оценивали визуально в темной комнате. В настоящее время регистрацию Хл проводят с помощью специальных приборов – люминометров. Данное оборудование применяется достаточно широко и характеризуется высокой чувствительностью и исключительной специфичностью [2–5].

На рынке представлен широкий ассортимент люминометров как узкоспециализированных: 3М Clean-Trace NG (3M PELTOR, Великобритания), EnSURE™ Touch (HYGIENA, Великобритания), Lumat LB 9508 (“Berthold technologies”, Германия), так и более универсальных, например Lum-100 (МГУ, Россия), AutoLumatPlus LB 953 (“Berthold Technologies”, Германия). Следует отметить, что данное оборудование относится к дорогостоящим. Например, цена люминометра Lumat LB 9508 находится в диапазоне от 0.5 до 1.3 млн рублей. Зачастую приобретение прибора из каталога является затруднительным, в результате исследователь лишается возможности получения оригинальных данных и вынужден применять менее селективные методы. Выходом из сложившейся ситуации является самостоятельное изготовление люминометра. Однако, кроме привлечения квалифицированных специалистов, необходима подробная информация об устройстве и изготовлении люминометра. К сожалению, в настоящее время в свободном доступе данная литература отсутствует.

В настоящей работе представлены рекомендации по изготовлению люминометра, описаны его конструкция и результаты лабораторных испытаний.

КОНСТРУКЦИЯ ПРИБОРА И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО СБОРКЕ

Предлагаемая нами конструкция люминометра реализована в виде единого модуля (рис. 1), работа которого обеспечивается следующими функционально объединенными блоками.

Рис. 1.

Блок-схема и внутреннее расположение блоков люминометра (вид сверху). 1 – источник питания основных компонентов схемы; 2 – источник питания термостата; 3 – высоковольтный источник питания ФЭУ; 4 – ФЭУ; 5 – термостат; 6 – кюветодержатель; 7.1 – ведущий микроконтроллер (master); 7.2 – ведомый микроконтроллер (slave); 8 – блок реле; 9 – блок усилителя сигнала с ФЭУ; 10 – информационное табло (LCD-дисплей 1602).

Детектор малых световых потоков. Ключевым элементом люминометра является детектор светового излучения – фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), реализованный на основе ФЭУ-39А (Россия) и резисторного делителя (рис. 2). Выбор данной модели ФЭУ связан с оптимальным сочетанием габаритных размеров, стабильности работы, высокой световой анодной чувствительности (S_a = 1000 А/лм) и низкого соотношения шум/сигнал.

Рис. 2.

Принципиальная схема подключения резисторного делителя к ФЭУ-39А. ФК – фотокатод, Д – динод, А − анод.

Высоковольтный источник питания ФЭУ. Для обеспечения работы ФЭУ нами выбран источник постоянного высокого напряжения, состоящий из источника высокого переменного напряжения, выпрямителя и удвоителя напряжения. Источник высокого переменного напряжения собран по схеме обратноходового импульсного источника питания с обратной связью на микросхеме TL494 (рис. 3). Высокочастотный трансформатор изготовлен на основе ферритового сердечника (XEPEX E 140166 xPB-5 class 130 (b)). Для повышения стабильности напряжения питания ФЭУ в высоковольтном блоке питания реализована обратная связь посредством контроля высокого напряжения на выходе высоковольтного выпрямителя (рис. 4). Настройка обратной связи осуществляется подстроечными резисторами (R_P2 на рис. 3 и R_P1, на рис. 4). Для снижения нагрузки на высокочастотный трансформатор и повышения надежности работы импульсного блока в схеме использован удвоитель напряжения, обеспечивающий питание ФЭУ (рис. 5). Данная конструкция высоковольтного источника питания позволяет поддерживать напряжение питания ФЭУ в заданных пределах 950 ± 10 В.

Рис. 3.

Принципиальная схема высоковольтного источника питания.

Рис. 4.

Принципиальная схема высоковольтного выпрямителя.

Рис. 5.

Принципиальная схема высоковольтного удвоителя напряжения.

Источник питания основных компонентов схемы предназначен для обеспечения работы блока микроконтроллеров, блока усилителя сигнала, блока реле, LCD-дисплея и высоковольтного источника питания ФЭУ. Реализован данный источник питания на основе блока питания персонального компьютера (ПК) мощностью 300 Вт. Применение блока питания от ПК наиболее рационально, поскольку это решение удовлетворяет таким требованиям, как компактность, мощность, наличие шин питания 5 и 12 В.

Источник питания термостата. В качестве источника питания термостата использован импульсный блок NES-50-5 (“Mean well”, Тайвань).

Кюветодержатель выполнен из медных пластин, к которым жестко прикреплены элемент Пельтье и керамический резистор.

Блок микроконтроллеров состоит из двух плат “Arduino nano” (Китай) (рис. 6). Плата ведущего микроконтроллера (master) оцифровывает и передает поступивший сигнал в ПК по USB-интерфейсу. Кроме оцифровки и передачи сигнала, в задачи ведущего микроконтроллера входит прием от ПК и передача на ведомый микроконтроллер (slave) значений температуры термостата. Плата ведомого микроконтроллера отвечает за контроль параметров прибора и его аварийное отключение.

Рис. 6.

Принципиальная схема блока микроконтроллеров, блока реле и термостата.

Блок усилителя сигнала. В качестве усилителя использован инструментальный усилитель INA 333 (“Texas Instruments”, США, рис. 7).

Рис. 7.

Принципиальная схема усилителя сигнала ФЭУ на базе INA 333.

Блок реле состоит из трех нормально замкнутых 1-канальных модулей реле “Arduino” (U8, U9, U10 на рис. 6) и необходим как коммуникационное устройство для управления нагрузкой (блок питания термостата, термостат, высоковольтный источник питания).

Информационное табло. Использован LCD-дисплей (модель 1602, Китай), основная функция которого − информирование оператора о параметрах работы прибора.

Термостат используется для поддержания заданного температурного режима в кювете. Он содержит следующие компоненты: кюветодержатель, охладитель – элемент Пельтье (U4 на рис. 6), нагреватель – керамический резистор (R₉ на рис. 6).

В процессе разработки конструкции и принятия решения о расположении блоков следует, в первую очередь, отталкиваться от расположения центральной части прибора: термостата, кюветодержателя, детектора. В нашем случае данные компоненты расположены горизонтально в одну линию. Такое расположение блоков позволяет улучшить эргономику прибора (отсутствие выступающих частей), торцевое расположение ФЭУ по отношению к позиции кюветы в кюветодержателе нивелирует риск попадания рабочих растворов на высоковольтную часть детектора.

Близкое расположение блоков неминуемо повышает их взаимовлияние, в связи с этим важно обеспечить защиту от помех. Реализация помехозащищенности заключается в экранировке проводников цифровых и аналоговых сигналов, а также в светозащите детектора. Дополнительно для защиты ФЭУ в приборе необходимо применять механическую “шторку”, с помощью которой оператор закрывает торцевую фотоприемную часть ФЭУ перед открытием дверцы. Шторка является важным элементом схемы прибора, благодаря которому обеспечивается непрерывность работы ФЭУ.

Для снижения влияния скачков напряжения на работу ФЭУ питание детектора осуществляется от отдельного источника. При сопряжении низковольтных и высоковольтных блоков для исключения высоковольтного пробоя следует использовать высокоомные сопротивления (R₁ на рис. 6 и R₁, R₂ на рис. 7).

Применение в приборе двух микроконтроллеров, работающих в режиме master-slaver, позволяет разгрузить ведущий микроконтроллер и увеличить скорость передачи информации в ПК.

Для повышения стабильности работы необходимо обеспечить выравнивание потенциалов между блоками прибора посредством использования для питания общего отрицательного контакта, что уже реализовано в источнике питания основных компонентов схемы. Выравнивание потенциалов между высоковольтными и низковольтными блоками осуществляется посредством высоковольтного конденсатора C₅ (см. рис. 3).

В конструкции прибора предусмотрена возможность внесения жидких сред в кювету в процессе измерения (рис. 8, отверстие для внесения растворов). Канал для внесения растворов выполнен из пластикового капилляра, изогнутого в форме колена. Коленчатая форма канала предотвращает засветку ФЭУ в момент внесения раствора в кювету.

Рис. 8.

Внешний вид люминометра (вид сверху). 1 – кнопка включения прибора, 2 – кнопка перезагрузки микроконтроллеров, 3 – переключатель включения ФЭУ, 4 – информационное табло (LCD-дисплей), 5 – крышка блока кюветодержателя и термостата, 6 – отверстие для внесения растворов, 7 – рукоятка управления шторкой.

АЛГОРИТМ РАБОТЫ ПРИБОРА

Рассмотренная конструкция прибора, внешний вид которого представлен на рис. 8, предполагает следующий алгоритм работы. Запуск источника питания основных компонентов обеспечивает включение ведущего и ведомого микроконтроллеров и усилителя сигнала с ФЭУ. На этапе инициализации микроконтроллеров проходит самотестирование прибора, и при обнаружении ошибки микроконтроллер (slave) останавливает запуск прибора и информирует оператора об ошибке на экране LCD-дисплея. В случае положительного результата самотестирования блок микроконтроллеров через блок реле дает разрешение на запуск источника питания термостата и выполнение программы термостатирования, подается питание на ФЭУ, осуществляется передача данных в порт “mini-usb” и на информационное табло. Ведомый микроконтроллер включает реле питания высоковольтного источника, подающего напряжение на ФЭУ. Образуемая на контактах ФЭУ разность потенциалов фиксируется блоком усилителя сигнала с ФЭУ и передается на ведущий микроконтроллер, который в свою очередь оцифровывает сигнал и отправляет его в порт USB ПК. Выходной сигнал ФЭУ является конечной величиной измерения потока фотонов и выражается в вольтах. Для визуализации и фиксации поступающих данных от прибора, а также для установки температуры термостата и временного периода приема данных используется оригинальное программное обеспечение.

На рис. 9 представлен типичный вид изменения интенсивности сигнала на экране ПК при взаимодействии Н₂О₂ и люминола. Интенсивность сигнала резко возрастает на начальной фазе и, достигнув максимума, медленно снижается. Площадь фигуры, ограниченная функцией, описывающей сигнал, и осью абсцисс, равна сумме дискретных величин сигнала (точки на графике) и пропорциональна концентрации Н₂О₂.

Рис. 9.

Изменение интенсивности сигнала в процессе хемилюминесцентной реакции.

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

Для оценки пределов обнаружения Н₂О₂ была получена градуировочная зависимость площади фигуры под графиком функции сигнала от концентрации Н₂О₂ (рис. 10). Градуировочные концентрации Н₂О₂ (0.12, 0.24, 0.48, 0.97, 1.95 ⋅ 10⁻⁶ М) были выбраны нами по результатам ранее проведенных тестовых измерений. Растворы Н₂О₂ известной концентрации вносили в кварцевую кювету, которую устанавливали в кюветодержатель. Далее в кювету через отверстие для внесения растворов вливали 1 см³ смеси люминола (2.26 ⋅ 10^–4 М) и пероксидазы (1 ⋅ 10^–6 М). Измерения проводили в шестикратной аналитической повторности. Рассчитанные значения площадей усредняли и использовали для построения градуировочной зависимости (см. рис. 10). Методом наименьших квадратов была рассчитана линейная регрессия, описываемая уравнением y = 255.74x − 32.907, коэффициент корреляции регрессионной зависимости составил 0.97. Статистическая значимость уравнения проверена с помощью коэффициента детерминации и критерия Фишера. Установлено, что параметры модели статистически значимы. Полученная оценка уравнения регрессии позволяет использовать его для расчета концентрации Н₂О₂ в водных растворах.

Рис. 10.

Градуировочная зависимость площади фигуры под графиком функции сигнала от концентрации Н₂О₂ (измерения проведены при 20°C).

В качестве модельного объекта для тестирования люминометра использовали этиолированные листья мягкой пшеницы сорта Иргина (Triticum aestivum L.) в процессе деэтиоляции на непрерывном свету. Измерения концентрации Н₂О₂ показали, что четырехчасовое воздействие света интенсивностью 190 мкмоль/(м² · с) на этиолированные листья стимулировало повышение концентрации Н₂О₂ в 1.5 раза − до 15 ⋅ 10^–6 моль/г сухой массы (рис. 11). По мере формирования фотосинтетического аппарата листа на свету содержание Н₂О₂ снижалось, и спустя сутки уровень содержания Н₂О₂ составлял 7 ⋅ 10^–6 моль/г сухой массы. Полученные значения и динамика изменения концентрации Н₂О₂ в процессе деэтиоляции листа пшеницы сопоставимы с имеющимися в литературе данными [6].

Рис. 11.

Изменение содержания пероксида водорода в листьях пшеницы в процессе деэтиоляции (измерения проведены при 20°C).

Проверку на специфичность проводили путем предварительного инкубирования растительного образца с каталазой (“Sigma”, США) – ферментом, разлагающим Н₂О₂ до воды. Последующее введение в кювету раствора люминола не вызвало хемилюминесцентную реакцию.

Таким образом, нами представлена информация о конструкции люминометра, даны рекомендации по самостоятельной сборке прибора и приведены результаты лабораторных испытаний. Установлено, что изготовленный люминометр применим для измерения содержания Н₂О₂ в водных растворах в диапазоне от 0.1 до 2 ⋅ 10⁻⁶ М. Технические характеристики прибора позволяют оценивать содержание Н₂О₂ в растительных образцах, полученные значения сопоставимы с данными, имеющимися в литературе.