Агрохимия, 2019, № 1, стр. 66-70

ВВЕДЕНИЕ

Движение устьиц – один из важных механизмов, от которого зависит приспособление растений к изменению условий окружающей среды и их выживание. Поверхность листа покрыта кутикулой, которая отличается низкой проницаемостью для диффузии веществ, поэтому газообмен между листом и окружающей средой происходит в основном через открытые устьица. Через них в лист поступает необходимый для фотосинтеза углекислый газ и происходит испарение воды, которая поступает из корней вместе с растворенными в ней элементами минерального питания растений.

В условиях дефицита воды закрытие устьиц ограничивает транспирационные потери и способствует поддержанию оводненности тканей растений. Движение устьиц происходит благодаря изменению тургора замыкающих клеток устьиц. Поддерживается тургор клеток за счет накопления в них осмотически активных веществ (ионов, сахаров и органических кислот). Основное внимание исследователей было направлено на процесс активного поглощения и выброса осмотиков из клетки как механизму регуляции движения устьиц. Однако недавние исследования показали, что закрытие устьиц может происходить в результате активного снижения притока воды в листья за счет уменьшения способности тканей листа проводить воду [1]. Проведение воды тканями растений зависит от присутствия и активности в мембранах клеток водных каналов – аквапоринов [2].

Цель работы – выявление участия аквапоринов в закрытии устьиц растений ячменя при засолении. В лаборатории физиологии растений Уфимского института биологии РАН совместно с Wieland Fricke (университет в Дублине) было показано быстрое закрытие устьиц при добавлении в питательных раствор хлорида натрия до конечной концентрации 100 мМ [3, 4]. Также были выявлены особенности скорости закрытия устьиц растений 2‑х контрастных по солеустойчивости сортов ячменя – Прерия и Михайловский [5]. В лаборатории имеются специфические антитела против аквапоринов клеточных мембран растений ячменя, полученные от проф. Sakakibara из университета Окаямы (Япония). Разработан метод иммуногистохимической локализации аквапоринов [6]. Этот подход был использован в данной работе.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Выращивание растений и оценка показателей водного обмена. Семена ячменя (Hordeum vulgare L., сорта Михайловский и Прерия) проращивали на водопроводной воде в темноте при комнатной температуре. Через 1 сут половину проклюнувшихся проростков перенесли на 10%-ный раствор Хогланда–Арнона и выращивали при температуре 27 ± 3°С и 16-часовой продолжительности светового дня. На 7-е сут от момента посева семян у проростков удаляли зерновку и помещали растения на 50%-ный раствор полной питательной смеси Хогланда–Арнона (контроль). В этот питательный раствор половины растений добавляли хлорид натрия до концентрации 100 мМ.

Транспирацию оценивали гравиметрически – по потере веса стаканчиком с 50 мл питательного раствора и 10-ю проростками. Стаканчик закрывали алюминиевой фольгой с отверстием для проростков для предотвращения испарения воды с поверхности питательного раствора. Вес стаканчиков определяли каждые 15 мин и по разнице в весе судили об интенсивности транспирации.

Иммуногистохимическая локализация аквапоринов и АБК. Через 30 или 60 мин после воздействия высечки листьев ячменя (0.3–0.5 мм) фиксировали в 4%-ном растворе карбодиимида (Sigma, Япония). Дегидратацию образцов проводили в серии разведений этанола (30, 50, 70, 80, 96%). Затем их заключали в гидрофильную метакрилатную смолу JB-4 (Electron Microscopy Sciences, США). Гистологические срезы толщиной 1.5 мкм готовили с помощью ротационного микротома (HM 325, “MICROM Laborgerate”, Германия). Иммунолокализацию осуществляли, как описано ранее [7]. Срезы обрабатывали в течение 30 мин в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.3), содержавшим 0.2% желатина и 0.05% Твина-20 (ФЖТ). Далее на срезы наносили по 20 мкл сыворотки кролика, содержавшей антитела против аквапоринов или АБК, разведенной в ФЖТ в соотношении 1 : 50. Срезы прикрывали полосками парафильма и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации срезы промывали трижды по 10 мин 0.1 М фосфатным буфером, содержавшим Твин-20 в конечной концентрации 0.05% (ФТ). Затем на каждый срез помещали 20 мкл меченных коллоидным золотом иммуноглобулинов козы против антител кролика (“Aurion”, Голландия), разведенных в ФЖТ в соотношении 1 : 30. Срезы покрывали кусочками парафильма и инкубировали в течение 1 ч во влажной камере при комнатной температуре. Затем их промывали 3 раза по 10 мин в ФТ и ополаскивали дистиллированной водой. После высушивания срезы в течение 20 мин обрабатывали препаратом серебра для усиления окрашивания в соответствии с рекомендацией производителя (“Aurion”, Голландия). В качестве контроля специфичности окрашивания служили образцы тканей, обработанные неиммунной сывороткой кролика (не содержавшей антител к цитокининам). Препараты анализировали с помощью светового микроскопа Axio Imager.A1 (“CarlZeiss Jena”, Германия), оборудованного цифровой камерой AxioCam MRc5 (“CarlZeiss Jena”). Сыворотки, содержащие антитела к аквапоринам семейства HvPIP2, были любезно предоставлены Maki Katsuhara (Group of Molecular and Functional Plant Biology, Institute of Plant Science and Resources, Okayama University, 20-1, Chuo-2-chome, Kurashiki, Okayama, 710-0046 Japan).

Было проведено 3 независимых эксперимента по 3–4 биологических повторностей в каждом. На диаграммах представлены средние величины со стандартными ошибками (SE). Для расчетов использовали стандартные пакеты программы Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ результатов оценки влияния засоления на уровень транспирации показал, что уже через 30 мин происходило снижение скорости потери воды листьями на 10 и 20% по сравнению с контролем у растений сортов Прерия и Михайловский соответственно (рис. 1). Через 1 ч уменьшение транспирации было более заметным: она снизилась у растений сортов Прерия и Михайловский на 50 и 20% по сравнению с контролем соответственно. Через 1 ч после начала действия засоления снижение транспирации было более значительным у растений сорта Прерия, что соответствовало ранее полученным данным о более выраженной транспирационной реакциии растений этого сорта на дефицит воды, вызванный засолением [5]. Эта реакция была связана с более сильным снижением способности устьиц проводить пары воды, что говорит о большей степени их закрытия. Появление ионов хлорида натрия в питательном растворе уменьшало доступность воды для растений. При этом снижение устьичной проводимости было адаптивной реакцией, которая снижала транспирационные потери и защищала растения от обезвоживания.

Рис. 1.

Влияние засоления на транспирацию растений ячменя: 1 – сорт Прерия (контроль), 2 – сорт Прерия (опыт), 3 – сорт Михайловский (контроль), 4 – сорт Михайловский (опыт).

Представляло интерес выяснить, связано ли снижение транспирации с уменьшением способности аквапоринов проводить воду. Для того чтобы ответить на этот вопрос, была проведена иммуногистохимическая детекция локализации аквапоринов в листьях растений ячменя с помощью специфических антител к аквапоринам.

Показано, что окрашивание на HvPIP2;2-аквапорины проявлялось в основном по периферии клеток, что соответствовало известной локализации PIP2-аквапоринов в клеточных мембранах. Яркое окрашивание было заметно в области клеток обкладки сосудов (рис. 2а). Эти результаты соответствовали сведениям о повышенном уровне аквапоринов там, где происходит наиболее интенсивный поток воды через клеточную мембрану. Поскольку по сосудам в лист поступает вода из корней, присутствие аквапоринов в мембранах клеток обкладки сосудистых пучков не должно вызывать удивление. Также было заметно повышенное содержание аквапоринов в мембранах плазмолеммы ряда клеток колленхимы, которые тянутся от сосудистых пучков к поверхности листа. Очевидно, по этим клеткам идет поток воды, которая испаряется листьями.

Рис. 2.

Иммуногистохимическая локализация HvPIP2;2-аквапоринов в листьях растений ячменя сорта Прерия в контроле (а) и на фоне засоления (б): 1 – эпидермис, 2 – устьица, 3 – мезофилл, 4 – ксилема, 5 – флоэма, 6 – клетки обкладки сосудистого пучка, 7 – колленхима. Линейка – 100 мкм.

Представляет интерес то, что добавление хлорида натрия в питательный раствор снижало интенсивность окрашивания клеток на срезах листьев, что указывало на уменьшение содержания HvPIP2;2-аквапоринов под влиянием засоления (рис. 2б). Этот эффект более ярко проявлялся у растений сорта Прерия, и по этой причине на рисунке приведены результаты иммуногистохимической локализации аквапоринов именно этого сорта. На рис. 3 показаны усредненные результаты количественной оценки интенсивности окрашивания на аквапорины в области сосудов с помощью программы ImageJ. Видно, что в норме (в отсутствие засоления) интенсивность окрашивания срезов листьев в области сосудов на аквапорины была больше у растений сорта Прерия, что соответствовало исходно более высокому уровню транспирации у растений этого сорта (рис. 1).

Рис. 3.

Интенсивность окрашивания на HvPIP2;2-аквапорины сосудистых пучков листьев растений ячменя сортов Прерия и Михайловский: 1 – контроль, 2 – через 30 мин после добавления хлорида натрия в питательную среду. Условные единицы: за 100% принято максимальное окрашивание, 0 – минимальное.

Добавление хлорида натрия почти в 3 раза снижало уровень окрашивания на аквапорины у растений сорта Прерия и только в 1.5 раза – у растений сорта Михайловский. Степень снижения содержания аквапоринов также соответствовала степени уменьшения транспирации у растений этих сортов (более заметное снижение транспирации – у сорта Прерия).

Было высказано предположение [1], что снижение гидравлической проводимости на пути воды от сосудов через мезофилл листа может способствовать закрытию устьиц. В данных опытах не был изучен вклад аквапоринов в изменение гидравлической и устьичной проводимости. Полученные авторами результаты свидетельствовали о том, что снижение содержания аквапоринов в ответ на засоление действительно происходит и может способствовать закрытию устьиц.

Представляло интерес оценить изменение содержания гормона абсцизовой кислоты (АБК) в клетках листьев при засолении. Более яркий эффект был выявлен у растений сорта Прерия (как и в случае иммуногистохимического окрашивания на аквапорины) (рис. 4). По этой причине на рис. 4 показаны результаты иммуногистохимической локализации аквапоринов именно этого сорта. Видно увеличение интенсивности окрашивания на АБК периферии клеток мезофилла под влиянием засоления, что соответствует полученным ранее данным [8]. Важно, что в области сосудов увеличение содержания АБК было менее заметным, чем в области клеток мезофилла. Известно, что источником АБК в листьях растений может быть повышение интенсивности их синтеза в корнях или самих листьях. Более заметное увеличение окрашивания клеток мезофилла по сравнению с клетками сосудов указывало на то, что при данной постановке опыта накопление АБК при засолении, скорее всего, было связано с синтезом этого гормона в самих листьях. Известно, что стимулом для синтеза АБК является снижение оводненности клеток [9]. Снижение содержания аквапоринов, выявленное авторами при воздействии засоления, должно было привести к снижению притока воды к клеткам листа, что могло индуцировать синтез АБК в клетках мезофилла.

Рис. 4.

Иммуногистохимическая локализация абсцизовой кислоты (АБК) в листьях растений ячменя сорта Прерия в контроле (а) и на фоне засоления (б): 1 – эпидермис, 2 – устьица, 3 – мезофилл, 4 – сосудистый пучок. Линейка – 100 мкм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эффект снижения транспирации на фоне добавления хлорида натрия в питательный раствор был сильнее выражен в растениях ячменя сорта Прерия по сравнению с сортом Михайловский. Иммунное окрашивание на аквапорины Hv PIP2;2 выявило снижение их содержания под влиянием засоления, более заметное у растений сорта Прерия, что соответствовало более выраженной устьичной реакции растений этого сорта. Результаты иммуногистохимической локализации показали увеличение содержания АБК в листьях под влиянием засоления, что могло быть связано с уменьшением притока воды из-за снижения в этих условиях экспрессии аквапоринов.

Работа выполнена на оборудовании ЦКП “Агидель”.