Агрохимия, 2019, № 8, стр. 52-59

ВВЕДЕНИЕ

Глобальное потепление и опустынивание приводит к увеличению засоления пахотных земель. На сегодняшний день по всему миру насчитывается ≈7% засоленных почв. Стрессовые факторы среды, включая засоление, существенно тормозят рост растений, а также снижают продуктивность и качество сельскохозяйственной продукции. На сегодняшний день актуальны исследования защитных стратегий таких важных для продовольственной безопасности растений, как пшеница, рис, ячмень. В регуляции стресс-устойчивости растений на молекулярном уровне участвуют геном, транскриптом, протеом и метаболом [1]. Многие растительные белки, в том числе рецепторы фитогормонов, нуждаются в гликозилировании для правильного процесса сворачивания полипептидной цепи в определенную пространственную структуру (фолдинга) и их эффективного функционирования [2]. В то же время в растениях присутствуют лектины – белки, способные специфично, нековалентно и обратимо взаимодействовать с углеводами [3]. Лектины выполняют широкий спектр разнообразных функций в растениях, в том числе вовлекаются в регуляцию стресс-устойчивости [4–10].

Известно, что лектины злаков характеризуются гомологией до 90%. Агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) – белковый димер с молекулярной массой 36 000 Да, состоящий из 2-х идентичных нековалентно связанных субъединиц с молекулярной массой 18 000 Да. Интересно, что АЗП, а также лектины ячменя и овса обладают специфичностью к N-ацетил-D-глюкозамину, имеют одинаковую субъединичную структуру и молекулярную массу и иммунологически неотличимы от АЗП, что и позволяет рассматривать АЗП в качестве типичного представителя лектинов злаков [3, 4, 11]. В то же время лектин риса, сходный по молекулярной массе и аминокислотному составу с другими лектинами семейства злаковых, отличается от них субъединичной структурой [3]. Лектин риса, 90% субъединиц которого проявляются в виде двух полипептидов – 8000 и 10 000 Да, имеет сходство с АЗП по углеводсвязывающей специфичности, при этом степень иммунологического сродства у лектина риса меньше, чем такового у лектина ячменя [3, 11].

Биотические и абиотические стрессовые факторы вызывают в вегетирующих растениях пшеницы обратимое накопление АЗП, которому предшествует увеличение содержания АБК [12, 13]. АЗП не только является активным участником АБК-контролируемых реакций растений пшеницы в ответ на стрессовые воздействия, но и экскретируется в область апикальной меристемы корней [12, 14]. Выделившийся наружу АЗП может способствовать сохранению митотического потенциала корневых клеток при стрессе и возобновлению интенсивного деления клеток апикальной меристемы корней в пост-стрессовый период. Действительно, полученные данные свидетельствуют об эффективности обработки АЗП в снижении уровня повреждающего действия на митотическую активность апикальной меристемы корней в условиях засоления, гипотермии, присутствия ацетата кадмия [4, 13–15]. Обнаружено, что стресс-индуцированное увеличение содержания АЗП и экскреция данного лектина из корней в наружную среду может предохранять ризосферу растений пшеницы, ослабленных вследствие воздействий стрессовых факторов, от возможной почвенной инфекции, а также привлекать к корневой системе полезные бактерии, продуцирующие ростстимулирующие гормоны или индуцирующие их накопление в растениях [16, 17]. Известно, что АЗП относится к характерным белкам пшеницы в ходе всего онтогенеза, в связи с чем, неудивительно, что в различных тканях как семян, так и интактных растений, обнаруживается пул запасных лектиновых мРНК и предшественников АЗП [18]. Другие фитолектины, в частности, конканавалин А и фитогемагглютинин, выделенные из растений Canavalia ensiformis (L.) DC. и Phaseolus vulgaris L. соответственно, также характеризуются митогенной активностью [19, 20].

Высокая гомология лектинов у эволюционно близких пшенице видов злаков, таких как ячмень и рис [3], позволила предположить, что АЗП способен проявлять защитный эффект на деление клеток корней не только пшеницы [13], но и близких ей видов злаков, а именно, риса и ячменя, лектины которых, как выше было упомянуто, характеризуются гомологией с АЗП.

Цель работы – исследование влияния экзогенной обработки АЗП на гормональный статус и деление клеток апикальной меристемы корней проростков риса и ячменя, подвергнутых натрий-хлоридному засолению.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта использовали проростки ячменя Hordeum vulgare L. сорта Первенец и риса Oryza sativa L. сорта Новатор. Для этого семена ячменя после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали 3-е сут в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21–23°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 270 мкМ/(м² с) ФАР. Семена риса предварительно 2 ч выдерживали в горячей воде при 55°С, после чего проращивали их в течение 4-х сут, полностью затопив семена водой.

С целью исследования защитного эффекта АЗП на растения ячменя и риса, подвергнутых засолению, использовали две постановки опытов: 1–3-суточные проростки ячменя или 2–4-суточные проростки риса, изолированные от эндосперма, перекладывали корнями на раствор 2%-ной сахарозы в присутствии или отсутствие 28 нМ АЗП на 24 ч, после чего растения переносили на 7 ч на смесь 2%-ной сахарозы и 2%-ного NaCl, затем после отмывки от соли 4–5-суточные проростки ячменя и риса переносили на раствор 2%-ной сахарозы еще на 24 ч; 2–4-суточные проростки ячменя и 5-суточные проростки риса перекладывали корнями на смесь 2%-ного NaCl и 2%-ной сахарозы на 7 ч, после отмывки корней от соли проростки на 24 ч перекладывали на раствор, содержащий 28 нМ АЗП, приготовленный на 2%-ной сахарозе, после чего 5-суточные проростки ячменя и 6-суточные проростки риса перекладывали на раствор 2%-ной сахарозы еще на 24 ч.

Для подсчета митотического индекса (МИ) апикальную часть корней проростков вместе с корневым чехликом фиксировали в смеси уксусной кислоты с этанолом (в соотношении объем : объем = 1 : 3) в течение 1.5 ч. После фиксации растительный материал отмывали водопроводной водой и обрабатывали в течение 1 ч смесью 5%-ной пектиназы (EC 3.2.1.15) (ICN, USA) и 5%-ной целлюлазы (EC 3.2.1.4) (ICN, USA) при 37°С. Каждый вариант 3–5 независимых опытов содержал не менее 40 проростков. Давленые препараты окрашивали ацетокармином, приготовленном на 45%-ной уксусной кислоте. Используя микроскоп AxioImager M1 (“Carl Zeiss”, Германия), оснащенный объективом N-Achroplan 63×/0.85 M27, подсчитывали МИ клеток апикальной корневой меристемы как сумму клеток апикальной корневой меристемы в стадии профазы, метафазы, анафазы и телофазы, выраженную в доле (%) от общего числа подсчитанных клеток [14], анализируя по 5000 клеток в каждом варианте. Документацию изображения осуществляли с использованием микроскопической цветной камеры AxioCam HSс и программного обеспечения Axio Vision 4.7 для управления камерой и микроскопом (“Carl Zeiss”).

Концентрацию свободных форм ИУК, АБК и цитокининов определяли методом иммуноанализа. Для этого навеску, состоящую из 10–15 проростков, растирали в жидком азоте и экстрагировали фитогормоны 80%-ным этанолом 16 ч при 4°С. После центрифугирования в течение 10 мин при 18 000 g супернатант упаривали в токе воздуха до водного остатка, в аликвоте которого определяли суммарное содержание иммунореактивных к анти-зеатинрибозидной сыворотке форм цитокининов. Из оставшегося водного остатка экстрагировали серным эфиром индолилуксусную и абсцизовую кислоты, метилировали их диазометаном и после упаривания сухой остаток растворяли в 80%-ном этаноле, в аликвоте которого определяли количество ИУК и АБК. Последовательность ступеней иммуноанализа фитогормонов описана ранее [21].

Результаты обрабатывали статистически, используя стандартное отклонение и t-тест. Разницу считали достоверной при P ≤ 0.05. На рисунках представлены средние арифметические 3–4-х независимых опытов, каждый из которых проведен в 2–3-х биологических повторностях, и стандартные ошибки средних величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами было выявлено, что обработка 28 нМ АЗП в течение 1 сут вызывает транзиторное накопление АБК, ИУК и цитокининов и активацию деления клеток апикальной меристемы корней риса и ячменя [22]. В настоящей работе провели анализ влияния защитного эффекта экзогенного АЗП на гормональный статус и рост клеток корней риса и ячменя делением в условиях засоления (рис. 1). Показано, что воздействие 2%-ным NaCl в течение 7 ч вызвало торможение ростовых процессов в большей степени у риса в сравнении с ячменем. Например, МИ в корнях растений риса при действии хлорида натрия снизился на 30, ячменя – на 10%, что вполне закономерно, поскольку ячмень более устойчив к засолению, чем рис [23]. В то же время предобработка АЗП проростков риса и ячменя предотвратила повреждающее действие засоления на деление клеток апикальной меристемы корней. МИ клеток корней этих растений в условиях стресса оставался на уровне контроля, а в проростках ячменя 1 сут спустя после удаления соли из среды даже несколько превышал его (рис. 1б). Таким образом, предобработка АЗП проростков исследованных культур оказывала защитный эффект на митотическую активность клеток апикальной меристемы корней в условиях засоления, сопоставимый с таковым для растений пшеницы [13], что в свою очередь позволило предполагать наличие не только у АЗП, но и лектинов ячменя и риса свойств регуляторов роста.

Рис. 1.

Эффект предобработки АЗП на МИ проростков риса (а) и ячменя (б) при 7-часовом засолении и через 1 сут после воздействия 2%-ным NaCl. Представлены средние и их стандартные отклонения. Достоверно различающиеся между собой величины каждого показателя (при Р ≤ 0.05) обозначены разными буквами. То же на рис. 3.

Ключевая роль в регуляции формирования защитных реакций растений при засолении отводится гормональной системе [24]. В основе защитного действия предобработки АЗП на рост клеток корней пшеницы при стрессе и в пост-стрессовый период также лежит его способность активно влиять на состояние гормональной системы растений [22, 25]. Вероятно, это происходит вследствие способности лектинов взаимодействовать с фитогормонами [26] и изменять их концентрацию и/или активность. Анализ содержания в одних и те же растениях ИУК, цитокининов и АБК позволил получить комплексную картину изменений в состоянии гормональной системы проростков ячменя и риса.

В предобработанных АЗП проростках пшеницы содержание АБК транзиторно увеличивалось [25]. Поскольку АБК участвует в регуляции стрессовых программ, можно было предполагать, что предобработанные АЗП растения становятся пред-адаптированными к последующему воздействию стресса. Действительно, АЗП-предобработанные растения характеризовались большей устойчивостью к повреждающему действию стрессора на митотический индекс корней проростков в сравнении с растениями, необработанными лектином (рис. 1).

Засоление приводило к транзиторному увеличению в корнях проростков риса и ячменя содержания АБК с максимумом через 2–3 ч (рис. 2а, г) и уменьшению содержания ИУК (рис. 2б, д), обладающей, как известно, ярко выраженным ростстимулирующим свойством, что в конечном счете привело к торможению деления клеток апикальной меристемы корней (рис. 1). Вместе с тем корни предобработанных АЗП проростков ячменя и риса при воздействии 2%-ного хлорида натрия в целом характеризовались поддержанием концентрации ИУК на уровне, близком контрольным вариантам.

Рис. 2.

Влияние предобработки АЗП на динамику содержания АБК (а, г), ИУК (б, д) и цитокининов (в, е) в корнях 5‑суточных проростков риса (а, б, в) и 4-суточных проростков ячменя (г, д, е) в ходе воздействия 2%-ным NaCl. Представлены средние и их стандартные отклонения, звездочкой отмечены отличия от контроля, достоверные при P ≤ 0.05. То же на рис. 4.

Иммуноанализ выявил снижение содержания цитокининов в корнях растений риса (рис. 2в), подвергнутых воздействию засоления. Подобную реакцию наблюдали ранее у растений пшеницы [13]. В то же время в корнях проростков ячменя, напротив, отмечено постепенное накопление цитокининов в ответ на засоление (рис. 2е), что, по-видимому, связано с реализацией механизма солеустойчивости ячменя. Важно отметить способность предобработки АЗП оказывать на проростки исследованных злаковых культур предадаптирующий эффект к последующему воздействию стресса, о чем свидетельствовали полученные сведения об увеличении содержания цитокининов в корнях растений как риса, так и ячменя, подвергнутых засолению (рис. 2в, е).

Известно, что цитокинины увеличивают стрессоустойчивость растений, важный вклад в реализацию защитного действия цитокининов вносит их способность индуцировать экспрессию генов ряда стрессовых белков, задействованных в формировании защитных реакций растений к стрессовым факторам среды разной природы [27, 28]. Кроме повышения содержания гормонов-активаторов роста ИУК и цитокининов, особенно в случае слабо чувствительного к NaCl ячменя, предобработанные АЗП и подвергнутые кратковременному засолению проростки характеризовались заметно меньшим уровнем стресс-индуцированного накопления АБК (рис. 2а, г).

Отмеченные изменения в состоянии гормональной системы привели к нормализации под влиянием предобработки АЗП показателей роста клеток корней риса и ячменя как во время действия стресса, так и после удаления соли из среды. Интересно отметить, что АЗП оказывал стимулирующее действие на МИ клеток корней ячменя после удаления NaCl (рис. 1б), что, по-видимому, было связано с отмеченными изменениями в гормональном балансе в сторону накопления фитогормонов-активаторов роста.

Опыты по экзогенной обработке проростков пшеницы 28 нМ АЗП в период после воздействия стресса, которые можно рассматривать как моделирующие действие эндогенного и экскретируемого в наружную среду лектина, показали ускорение репарации митотической активности клеток апикальной меристемы корней пшеницы по сравнению с необработанными [25]. Такая ситуация возможна и для растений риса и ячменя, перенесших стрессовое воздействие. Действительно, обработка подвергнутых кратковременному 7-часовому действию NaCl проростков риса (рис. 3а) и ячменя (рис. 3б) раствором АЗП ускоряла восстановление митотической активности клеток кончиков корней практически в той же мере, что и проростков пшеницы [25]. Следует отметить, что корни риса также оказались более чувствительными к действию соли, чем таковые ячменя: корни ячменя спустя 1 сут после обработки АЗП отличались восстановлением деления клеток апикальной меристемы в условиях засоления, тогда как полного восстановления деления клеток кончиков корней риса не наблюдали.

Рис. 3.

Эффект засоления и последующей 24-часовой обработки АЗП, а также через 1 сут после воздействия лектина на МИ проростков риса (а) и ячменя (б).

Способность предобработки АЗП предотвращать стресс-индуцированное торможение деления клеток корней проростков риса и ячменя, а также восстанавливать его после удаления стрессора из среды свидетельствовало об участии этого лектина в реакциях устойчивости растений. Можно предположить, что лектины риса и ячменя оказывают на “родственные” растительные объекты схожее действие, но это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Поскольку интенсивность ростовых процессов растений находится под контролем фитогормонов, далее исследовали влияние засоления и последующей обработки АЗП на состояние гормональной системы корней проростков риса и ячменя. Следует отметить, что концентрация ростстимулирующих фитогормонов (ИУК и цитокининов) в корнях проростков риса после воздействия 2% NaCl постепенно возвращалась к контрольному уровню, а в корнях ячменя заметно превышала контроль. Обработка растений АЗП в период после действия стресса способствовала дополнительному накоплению ИУК и цитокининов (рис. 4б, в, д, е) в корнях проростков риса и ячменя по сравнению с необработанными АЗП и подвергшимися воздействию засоления проростками. Исследованные ростстимулирующие эндогенные фитогормоны вносили свой вклад в АЗП – опосредованное восстановление митотической активности меристематических клеток корней ячменя и риса после воздействия засоления (рис. 3).

Рис. 4.

Влияние обработки АЗП на динамику содержания АБК (а, г), ИУК (б, д) и цитокининов (в, е) в корнях 5-суточных проростков риса (а, б, в) и 4-суточных проростков ячменя (г, д, е) после воздействия 2%-ным NaCl.

Что касается АБК, то содержание этого фитогормона в корнях ячменя возвращалось к норме в течение 1 ч (рис. 4г), в корнях риса – в течение 2-х ч после окончания воздействия засоления (рис. 4а). В ходе обработки 28 нМ АЗП в пост-стрессовый период количество АБК в корнях проростков риса и ячменя плавно возвращалось к контрольному уровню, по крайней мере в течение 6 ч обработки лектином (рис. 4а, г). Важно отметить, что АБК совместно с другими фитогормонами, включая гормоны-активаторы ростовых процессов, вовлекаются в индуцирование антистрессовых программ растений [24], что в свою очередь позволяет поддерживать рост клеток корней делением на уровне близком к контролю.

Сравнительная оценка защитного действия лектина пшеницы на деление клеток корней проростков ячменя и риса выявила способность АЗП поддерживать количество делящихся меристематических клеток корней до и после воздействия засоления на контрольном или близком к контролю уровне. Такой эффект, вероятно, был обусловлен тем, что ячмень и рис являются эволюционно близкими пшенице видами, а их лектины и АЗП обладают высокой степенью гомологии. Полученные результаты позволили заключить, что некоторое стимулирование деления клеток близкородственных видов растений в стрессовых условиях является характерным свойством для фитолектинов. Обработка корней проростков риса и ячменя АЗП как до воздействия засоления, так и после стресса сопровождалась повышением содержания ИУК и цитокининов в их корнях по сравнению с необработанными этим лектином растениями при засолении.

Таким образом, полученные результаты наряду с ранее опубликованными данными [29–32] подтвердили тесное взаимодействие лектиновой и гормональной систем в регуляции роста растений не только в норме, но и при стрессе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способность агглютинина зародыша пшеницы (АЗП) активно воздействовать на состояние гормональной системы таких злаковых растений как рис и ячмень до воздействия засоления и в пост-стрессовый период вносит важный вклад в реализацию его рострегулирующего и антистрессового действия не только на растения пшеницы, но и другие злаки.