Агрохимия, 2021, № 2, стр. 55-64

ВВЕДЕНИЕ

В начальный период выращивания теплолюбивых культур (огурца, томата и др.) часто происходят резкие перепады дневных и ночных температур, а также кратковременные ночные заморозки, которые повреждают растения, замедляют их рост и развитие, приводят к снижению продуктивности. Одним из приемов снижения повреждающего действия абиотических стресс-факторов, в т.ч. низких температур, на растения является использование синтетических регуляторов роста, обладающих антистрессовой активностью [1–4].

Регулятор роста 24-эпибрассинолид (24-ЭБЛ) является синтетическим аналогом природного фитогормона брассиностероида и в ходе онтогенеза растений проявляет не только высокую регуляторную активность в отношении многих физиологических процессов (деления клеток, прорастания семян, ризогенеза, фотосинтеза, синтеза белков и нуклеиновых кислот и др.), но также повышает устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды [4–9]. 24-ЭБЛ регулирует внутриклеточные физиологические процессы во взаимодействии с эндогенными фитогормонами [10], поддерживает баланс между активными формами кислорода (АФК) и антиоксидантами [11] и индуцирует системную устойчивость растительного организма [8].

Томат – одна из основных сельскохозяйственных культур, которая по объему товарного производства и площади выращивания занимает 10-e место в мире [12]. В литературе имеются сведения о полифункциональном действии 24-ЭБЛ на томаты. Показано, что при применении 24-ЭБЛ повышались энергия прорастания и всхожесть семян [2, 13], биометрические показатели растений в фазе массового плодоношения [14], размер и масса плодов [2], урожайность [15–17], устойчивость растений к серой гнили [6], тяжелым металлам (Ni) [18], засухе [19]. Работы, в которых изучали реакцию растений томата на 24-ЭБЛ при действии низких положительных температур (НПТ), единичны. Например, опрыскивание 50-суточных растений томата раствором 24-ЭБЛ в последействии охлаждения способствовало усилению функционирования антиоксидантной системы и повышению содержания пролина в листьях [20]. Холодовое повреждение тканей плодов томата было менее выражено при предобработке их 24-ЭБЛ [21]. Вместе с тем при оценке эффективности действия 24-ЭБЛ на растения некоторые авторы отмечали неодинаковую реакцию разных сортов, особенно на фоне неблагоприятных факторов среды, что могло быть связано с различным гормональным статусом, антиоксидантной активностью тканей и др. [4, 16, 17, 20]. Например, сортовая специфичность действия 24-ЭБЛ выявлена при определении активностей антиоксидантных ферментов у пшеницы на фоне солевого стресса [22] и у томата при действии НПТ [20]. У проростков озимой пшеницы эндогенный уровень 24-ЭБЛ зависел от степени морозостойкости сорта [23]. Предпосевная обработка семян пшеницы 24-ЭБЛ способствовала повышению в условиях засухи интенсивности фотосинтеза в растениях засухоустойчивого сорта Саратовская 29 и не влияла на этот показатель у неустойчивого сорта Энита [24].

Цель работы – изучение физиолого-биохимических реакций 2-х сортов томата, различающихся по скороспелости, на применение 24-ЭБЛ на фоне действия НПТ. В задачи исследования входила оценка влияния экзогенного 24-ЭБЛ на сорта томатов по следующим показателям: всхожесть семян, морфометрические параметры осевых органов, содержание в листьях фотосинтетических пигментов, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантная активность (АОА) экстрактов листьев.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были семена и молодые растения томата Solanum lycopersicum Mill. сортов Яхонт и Кулон селекции Воронежской овощной опытной станции. Растения обоих сортов имеют компактный детерминантный тип куста, но различаются по скороспелости: сорт Яхонт – среднеранний, тогда как сорт Кулон – скороспелый [25].

В работе использовали препарат эпин-Экстра (ННПП НЭСТ М, Россия), содержащий в качестве действующего вещества синтетический брассиностероид 24-ЭБЛ в концентрации 25 мг/л. Известно, что предпосевная обработка семян и опрыскивание вегетирующих растений раствором 24-ЭБЛ являются более эффективными способами, по сравнению с его внесением в почву [11]. В наших опытах 1 г семян томатов замачивали в водном растворе препарата эпин-Экстра в концентрации 0.5 мл/л (концентрация 24-ЭБЛ – 12.5 мкг/л) в течение 2-х ч. Контролем служила обработка семян дистиллированной водой. Семена проращивали в чашках Петри при 22 ± 0.5°С в темноте. Каждый вариант включал 4 повторности, по 100 семян в каждой. На 5-е сут оценивали энергию прорастания семян, на 10-е сут – их всхожесть, и измеряли длину осевых органов (корня и побега). Оценку биометрических показателей в каждом варианте проводили на 35–40 проростках.

Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофилл a (Хл a), хлорофилл б (Хл б) и каротиноиды (кар)) в листьях томатов определяли спектрофотометрическим методом, при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения Хл а, Хл б и кар в 80%-ном растворе ацетона – 663, 646 и 470 нм соответственно. Концентрации пигментов рассчитывали по следующим формулам:

где С_a, С_б, С_кар – концентрации Хл а, Хл б и каротиноидов, мг/мл [26]. Содержание пигментов выражали в мг/г сухой массы листьев. Долю хлорофиллов в светособирающем комплексе (ССК) рассчитывали по формуле: ССК (%) = (Хл б + 1.2 × × Хл б)/(Хл а + Хл б) × 100, учитывая, что весь Хл б находится в ССК, а соотношение Хл а/Хл b в нем равно 1.2 [27].

Содержание сухого вещества в листьях определяли после их высушивания в термостате при температуре 100–105°С до постоянной массы и выражали в % исходной сырой массы навески.

Оценку холодоустойчивости сортов томата проводили двумя способами: по прорастанию семян при НПТ и по интенсивности свободнорадикальных процессов в листьях растений. По первому способу контрольные и обработанные 24-ЭБЛ семена помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную дистиллированной водой, и проращивали при 10 ± 0.5°С в темноте в течение 25 сут. Каждый вариант включал 4 повторности, по 100 семян в каждой. Долю проросших при НПТ семян определяли каждые 5 сут.

По второму способу контрольные и обработанные 24-ЭБЛ семена высаживали в вазоны с субстратом на основе верхового торфа Агробалт-С (Росторфинвест, Россия) и проращивали в течение 3-х нед при 22 ± 0.5°С и 16-часовом фотопериоде с интенсивностью освещения 100 мкмоль квантов/(м² с), лампы OSRAM L 80W/640 (ОСРАМ, Смоленск, Россия). Растения охлаждали в климатической камере MIR-153 (Sanyo, Япония), в темноте. Использовали краткосрочное (15 мин) охлаждение при 4 ± 0.5°С и длительное (24 ч) при 2 ± 0.5°С, при этом за 1 сут до охлаждения половину вазонов с растениями каждого варианта опрыскивали водным раствором препарата эпин-Экстра в концентрации 0.5 мл/л (концентрация 24-ЭБЛ – 12.5 мкг/л).

Холодоустойчивость растений оценивали по накоплению в листьях малонового диальдегида (МДА) – индикатора интенсивности процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ). МДА в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой образует стойкий окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Неспецифическую адсорбцию определяли при длине волны 600 нм. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Genesys 10 UV (Termo Electron Corporation, США) с последующим пересчетом в концентрацию по величине молярной экстинкции (ε = 1.56 × 10⁵ см^–1 моль^–1). Количество МДА рассчитывали в мкмоль/г сырой массы листьев [28]. Опыты проводили трижды в 3-х аналитических повторностях, каждая из которых включала навеску листьев, взятых из среднего яруса 3–4-х растений.

Антиоксидантную активность (АОА) экстрактов листьев томата анализировали по оптической плотности в реакции со стабильным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ) по методу [29]. Навеску листьев массой 1 г гомогенизировали в 10 мл 96%-ного этилового спирта и центрифугировали при 1500g в течение 15 мин. К 2 мл экстракта добавляли 1 мл 200 мкМ ДФПГ в 50%-ном этаноле, инкубировали в течение 30 мин при 21–23°С, после чего измеряли оптическую плотность на спектрофотометре в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм, при длине волны 517 нм против 50%-ного этанола. Радикал ДФПГ, взаимодействуя с молекулой антиоксиданта, переходит в нерадикальную форму, что сопровождается исчезновением максимума поглощения при 517 нм и изменением оптической плотности раствора [30]. Степень ингибирования ДФПГ (в %) рассчитывали по формуле:

степень ингибирования ДФПГ (%) = [(А_о – (А – – А_b)/А_о) × 100], где А – оптическая плотность экстракта с ДФПГ, А_о – оптическая плотность ДФПГ без экстракта, А_b – оптическая плотность экстракта без ДФПГ [31].

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием программы Т-test (ISI, США). Значимость различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента для независимых выборок. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические величины и их стандартные ошибки, достоверные при 95%-ном уровне значимости. Различия средних между вариантами и сортами отмечены разными надстрочными латинскими буквами. В статье обсуждают только величины, достоверные при P ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты влияния предпосевной обработки семян томата 24-ЭБЛ на энергию прорастания и их всхожесть, а также рост осевых органов (корень, побег) представлены в табл. 1. Из представленных данных видно, что всхожесть семян сорта Кулон в контрольном варианте была выше на 29%, чем сорта Яхонт. В варианте с предпосевной обработкой семян 24-ЭБЛ у сорта Яхонт энергия прорастания была на 15% больше, чем в контроле. Однако высокие (98–99%) показатели энергии прорастания и всхожести семян сорта Кулон не позволили оценить действие 24-ЭБЛ на их посевные качества.

Сорта томата различались по биометрическим показателям (рост осевых органов) проростков: у сорта Кулон в контрольном варианте длина побега была больше на 35%, а корня меньше на 20%, чем у сорта Яхонт. Важно отметить отсутствие влияния 24-ЭБЛ на рост осевых органов проростков у обоих сортов томата. В литературе имеются сведения о том, что брассиностероиды, оказывая стимулирующее действие на прорастание семян, слабо влияют на линейный рост органов растений [32, 33].

В литературе 24-ЭБЛ характеризуется как регулятор роста, снижающий негативное действие низкотемпературного стресс-фактора у различных видов растений [2–4, 6, 8–10]. Установлено, что стресс-защитный эффект 24-ЭБЛ обусловлен адаптивными изменениями количественного состава и баланса фитогормонов, а также повышенным уровнем экспрессии генов стрессового ответа, кодирующих белки холодового шока [32, 34]. Например, обработанные 24-ЭБЛ растения перца при действии НПТ имели стабильные фотосинтетические показатели, более высокие активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы, каталазы и аскорбат-пероксидазы), накапливали больше пролина, растворимых сахаров, белка, а их ткани содержали меньше МДА – маркера окислительного стресса [35].

Принимая во внимание тот факт, что томат относится к теплолюбивым растениям, диапазон оптимальных температур для которых составляет 22 ± 7°С (при температуре <15°С растения не цветут, а при температуре <8°С прекращают рост) [12], для опытов по изучению стресс-протекторного действия 24-ЭБЛ на прорастание семян использовали температуру 10 ± 0.5°С. Согласно полученным данным (рис. 1), при НПТ семена томата прорастали медленнее, чем при 22 ± 0.5°С (табл. 1). Если у сорта Яхонт в контроле первые проросшие семена появились на 10-е сут, а в варианте с обработкой 24-ЭБЛ – на 5-е сут, то у сорта Кулон прорастание семян началось на 10-е сут, независимо от варианта (рис. 1). Следовательно, применение 24-ЭБЛ оказало более выраженное антистрессовое действие на прорастание семян томата сорта Яхонт, что проявилось в их быстром и дружном прорастании, в отличие от сорта Кулон. Предположили, что сорт Яхонт проявил себя как более устойчивый к НПТ, тогда как сорт Кулон – как менее холодоустойчивый.

Известно, что у теплолюбивых растений при действии НПТ процесс фотосинтеза подавляется в первую очередь, при этом одним из параметров, используемых в качестве индикатора фотосинтетической активности, является количественный состав пигментов [36]. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях является очень чувствительным показателем к действию НПТ. Результаты влияния предпосевной обработки семян 24-ЭБЛ на пигментный состав листьев растений томата при оптимальных температурных условиях и после 24 ч экспозиции при 2 ± 0.5°С в темноте представлены в табл. 2. Согласно полученным данным, до охлаждения контрольные растения обоих сортов не различались по содержанию пигментов, однако в варианте с применением 24-ЭБЛ у сорта Яхонт содержание Хл a и Хл б было больше на 23 и 29% соответственно по сравнению с сортом Кулон. Показатель Хл (a + б) и суммарное содержание пигментов у сорта Яхонт также были больше на 24% по сравнению с сортом Кулон.

НПТ способствовала некоторому снижению содержания хлорофиллов в листьях контрольных растений томата сорта Кулон, тогда как у сорта Яхонт, их содержание наоборот, возросло почти на треть. При применении 24-ЭБЛ и в последействии охлаждения у сорта Кулон наблюдали достоверное увеличение содержания Хл a и Хл б, на 40 и 20% соответственно. У обоих сортов после охлаждения в вариантах с 24-ЭБЛ, а также у контрольных растений сорта Яхонт содержание Хл a оставалось на высоком уровне. Отсутствие снижения содержания хлорофиллов у растений томата сорта Яхонт свидетельствовало о пониженной чувствительности их фотосинтетического аппарата к холоду. Данный факт мог свидетельствовать о возможной сбалансированной работе фотосинтетического аппарата (в частности, фотосистемы II) в последействии охлаждения, учитывая, что именно Хл a является преобразователем солнечной энергии, тогда как другие пигменты осуществляют ее поглощение и миграцию. Подобные изменения, связанные с увеличением содержания хлорофиллов и фотосинтетической активности листьев на фоне НПТ наблюдали у растений перца, предобработанных раствором 24-ЭБЛ [37].

При оптимальной температуре выращивания сорта томатов не различались по содержанию каротиноидов в листьях. После охлаждения в варианте с предобработкой семян 24-ЭБЛ содержание каротиноидов у сорта Кулон возросло на 50%, тогда как у сорта Яхонт оставалось на уровне неохлажденного варианта. Следует отметить, что в этих условиях содержание каротиноидов в листьях контрольных растений томата сорта Яхонт возросло на 26% по сравнению с неохлажденным вариантом. У обоих сортов предобработка семян 24-ЭБЛ на фоне НПТ способствовала увеличению в листьях суммарного содержания пигментов более чем на 40% (рис. 2). В этих условиях сорт Яхонт показал меньшую отзывчивость на применение 24-ЭБЛ: содержание пигментов в листьях оставалось на уровне контрольного варианта.

При оптимальных температурных условиях сорта не различались по такому показателю, как доля Хл б в ССК, тогда как в вариантах с применением 24-ЭБЛ он был больше – на 8% у сорта Кулон и на 13% у сорта Яхонт. После охлаждения доля Хл б в ССК снижалась у обоих сортов, а в вариантах с применением 24-ЭБЛ оставалась на уровне неохлажденного контроля. Следовательно, предобработка семян томата 24-ЭБЛ оказала существенное влияние на содержание фотосинтетических пигментов в листьях растений, при этом реакция сортов была неодинаковой. При оптимальных температурных условиях в варианте с 24-ЭБЛ более выраженные изменения в пигментном составе, связанные с увеличением содержания хлорофиллов, наблюдали у сорта Яхонт. При действии НПТ установлен стресс-защитный эффект 24-ЭБЛ на растения томата, направленный на адаптационные структурные изменения фотосинтетического аппарата, проявившиеся у сорта Кулон в виде увеличения содержания фотосинтетических пигментов, тогда как у сорта Яхонт – в сохранении их исходно высокого содержания на уровне неохлажденных растений.

Одной из ранних неспецифических реакций растительной клетки на охлаждение является интенсификация окислительных процессов с участием АФК, накопление которых усиливает процесс ПОЛ мембран. МДА является одним из конечных продуктов ПОЛ и служит индикатором функционального состояния клеточных мембран [28]. Наши исследования показали, что в норме (без охлаждения) сорта томата не различались по содержанию МДА в листьях (рис. 3). Однако в вариантах с применением 24-ЭБЛ у сорта Кулон, в отличие от сорта Яхонт, наблюдали достоверное снижение содержания МДА. Различные режимы охлаждения способствовали накоплению МДА в листьях контрольных растений сорта Кулон, тогда как у сорта Яхонт этот показатель оставался на уровне неохлажденного контрольного варианта. Таким образом, при использовании 24-ЭБЛ (предпосевная обработка семян 24-ЭБЛ или предпосевная обработка семян + опрыскивание растений 24-ЭБЛ за 1 сут до охлаждения) содержание МДА в листьях растений сорта Кулон снижалось, тогда как у сорта Яхонт не изменялось. При НПТ растения томата сорта Кулон показали бóльшую отзывчивость на экзогенное применение 24-ЭБЛ, что выражалось в снижении у них интенсивности процесса ПОЛ. В этих условиях растения томата сорта Яхонт на 24-ЭБЛ реагировали сдержанно, о чем свидетельствовало отсутствие в их листьях достоверных изменений в содержании МДА относительно неохлажденного контроля. Полученные результаты подтверждают обнаруженные ранее (рис. 1) сортовые различия в холодоустойчивости: растения томата сорта Яхонт оказались более устойчивыми к охлаждению, чем растения сорта Кулон. Следовательно, при действии НПТ более высокая отзывчивость томата растений сорта Кулон на применение 24‑ЭБЛ была обусловлена их пониженной холодоустойчивостью, чем сорта Яхонт. Есть основания полагать, что повышенная устойчивость растений томата сорта Яхонт к охлаждению определялась наличием у них более эффективной антиоксидантной системы, чем у растений сорта Кулон. Для проверки данного предположения была проведена оценка АОА экстрактов листьев методом, основанным на взаимодействии стабильного хромоген-радикала ДФПГ с веществами (фенольные соединения, тиолы, аскорбиновая кислота и др.), проявляющих антиоксидантную активность [38]. Согласно методу, чем больше доля ингибирования ДФПГ-радикалов, тем больше АОА растительной ткани. Установлено, что экстракты листьев сортов томата различались по величине АОА, при этом доля ингибирования ДФПГ-радикалов у них была сходна в контроле и в варианте с применением 24-ЭБЛ (рис. 4). У сорта Кулон АОА экстрактов листьев была в 2 раза меньше, чем у сорта Яхонт. Таким образом, оценка АОА экстрактов листьев с помощью стабильного радикала ДФПГ не выявила влияние 24-ЭБЛ на уровень низкомолекулярных антиоксидантов, что указывало на возможное действие этого регулятора роста на ферментативную составляющую антиоксидантной системы. В литературе имеются сведения о том, что у растений томата экзогенный 24-ЭБЛ повышал активность антиоксидантных ферментов, при этом устойчивые к холоду сорта имели более высокие активности, чем неустойчивые [20]. Анализ изменений адаптивного потенциала разных сортов томата при применении препарата эпин-Экстра (0.1%-ный раствор) показал, что основной (более 50%) вклад в результаты опыта вносили особенности генотипов разных сортов [17]. Использованный в исследованиях сорт Яхонт в условиях агроценоза показал меньшую отзывчивость на применение 24-ЭБЛ по сравнению с другими сортами томата [16].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, регулятор роста 24-ЭБЛ оказывал направленное влияние на отдельные этапы онтогенеза растений томата (прорастание семян, молодое растение), видимо, за счет мобилизации их генетических возможностей, что в итоге способствовало повышению их устойчивости к низким положительным температурам (НПТ). Данные по интенсивности окислительных процессов в листьях свидетельствовали о разной реакции сортов томата на 24-ЭБЛ в условиях действия НПТ: растения скороспелого сорта Кулон показали бóльшую отзывчивость, тогда как растения среднераннего сорта Яхонт на применение регулятора роста реагировали сдержанно. Применение 24-ЭБЛ приводило к более выраженным изменениям в пигментном составе у сорта Яхонт в отсутствии стресс-фактора, тогда как у сорта Кулон – при действии НПТ. 24-ЭБЛ не влиял на уровень антиоксидантной активности экстрактов листьев, при этом у сорта Яхонт он был в 2 раза выше, чем у сорта Кулон. Таким образом, одним из факторов, обусловливающих менее выраженную отзывчивость сорта Яхонт на обработку 24-ЭБЛ, являлось наличие у них более эффективной неферментативной антиоксидантной системы, чем у сорта Кулон. Следовательно, степень влияния 24-ЭБЛ на сорта томата была обусловлена уровнем их генетически детерминированной холодоустойчивости, который был выше у сорта Яхонт.