Агрохимия, 2021, № 5, стр. 52-61

ВВЕДЕНИЕ

К вредоносному заболеванию злаковых трав относится снежная плесень, возбудителями которой являются грибы из разных таксономических групп, но наиболее часто выявляют представителей рода Microdochium Syd. & P. Syd. Недавние исследования показали, что в РФ на злаковых растениях встречаются несколько видов грибов этого рода, среди которых доминируют M. nivale (Fr.) Samuels & I.C. Hallett и M. majus (Wollenw.) Glynn & S.G. Edwards [1].

Грибы рода Microdochium относятся к эндофитным организмам, часто существующим бессимптомно в тканях растений и не наносящим им вреда. Присутствие этих грибов в семени не приводит к ухудшению прорастания, развития растений и не влияет на качество урожая. Однако такое “безболезненное” для растения сосуществование происходит только при благоприятных условиях окружающей среды. При ослаблении хозяина грибы Microdochium вызывают снежную плесень, ожог листьев, паршу колосьев [2]. Анализ патогенности штаммов разных видов Microdochium на отрезках листьев зерновых культур показал их способность вызывать некрозы растительной ткани, величина которых зависела от штамма [3–5].

Кроме того, в комплексе возбудителей, вызывающих снежную плесень, гниль проростков, пятнистости листьев злаковых культур, а также инфицированность семян встречаются грибы рода Fusarium Link, из которых F. culmorum (Wm.G. Sm.) Sacc. является одним из наиболее агрессивных патогенов [6].

Снежная плесень на зерновых культурах, газонах городских парков и скверов, полей спортивных сооружений проявляется в весенний период. Зараженные растения отстают в росте, гибнут их надземная и подземная части, и в результате на растительном покрове появляются плеши различной величины и конфигурации. Основными путями оздоровления являются технологические приемы – выравнивание поверхности, посев качественных семян устойчивых видов и сортов трав, своевременное использование комплекса минеральных удобрений. На полях сельхозугодий опрыскивания растений фунгицидами применяют как профилактические (осенью) и лечебные (весной) меры для борьбы с заболеваниями [7, 8]. В отличие от посевов зерновых на газонных травах снежная плесень может быть активна и вызывать повреждения круглый год. Для создания ровного плотного покрова траву часто стригут, ограничивают азотные удобрения и полив, что создает благоприятные условия для развития снежной плесени [9]. Например, частое проявление снежной плесени газонных трав и необходимость борьбы с заболеванием объясняют массовое использование фунгицидов в Канаде [10].

Ассортимент разрешенных к применению на территории РФ коммерческих фунгицидов, направленных на борьбу со снежной плесенью в течении вегетации, ограничен. В 2020 г. на зерновых культурах для опрыскивания в период вегетации разрешены 5 препаратов на основе беномила и 3 препарата на основе карбендазима и его комбинации с флутриафолом [11]. Для защиты газонов от болезней разрешены 2 фунгицида: двухкомпонентный препарат на основе карбоксина и тирама и препарат на основе азоксистробина.

Ассортимент протравителей для обработки зерновых культур против снежной плесени значительно шире и включает 79 препаратов на основе 18 действующих веществ (д.в.) из разных классов и их комбинаций, а также 2 биопрепарата на основе Pseudomonas aureofaciens BS 1393.

Цель работы – оценка чувствительности к фунгицидам широко распространенных грибов M. nivale и M. majus, а также F. culmorum, вызывающих вредоносные заболевания злаковых культур.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования были выбраны 8 штаммов M. majus, 11 штаммов M. nivale и 3 штамма F. culmorum. Все анализированные штаммы выделены из зерновых культур и злаковых трав различного географического происхождения (19 штаммов из РФ – Белгородская, Брянская, Воронежская, Калининградская, Ленинградская, Пензенская обл., Краснодарский край, Ставропольский край, Республика Татарстан; 3 штамма из Финляндии) в период с 2012 по 2019 г. Из образцов зерна пшеницы и ячменя были выделены 12 штаммов, остальные 10 были изолированы из листьев растений пшеницы, ржи, тимофеевки луговой и газонных трав, имевших симптомы снежной плесени или пятнистости.

Поскольку по морфологическим признакам видовую идентификацию грибов рода Microdochium проводить затруднительно, то предварительно принадлежность анализированных штаммов к видам M. majus и M. nivale была определена с помощью ПЦР с видоспецифичными праймерами [12–14].

Анализировали сравнительную эффективность подавления роста грибов 7-ми коммерческих фунгицидов, 4 из которых были однокомпонентными, 3 – двухкомпонентными и 1 – трехкомпонентным (табл. 1). В состав анализированных препаратов входили 14 д.в., среди которых по механизму действия можно выделить ингибиторы синтеза стеролов (SBI, тебуконазол, пропиконазол), ингибиторы митохондриального дыхания (QoI, азоксистробин, пираклостробин, трифлоксистробин), ингибиторы сукцинатдегидрогеназы (SDHI, боскалид, флуопирам), ингибиторы трансдукции осмотического сигнала (флудиоксонил), ингибиторы синтеза аминокислот и белков (АР, ципродинил) и мультисайтовые д.в. (хлороталонил). Исследованные препараты разрешены и используются в странах Европейского Союза для борьбы со снежной плесенью, на территории РФ зарегистрирован и разрешен к применению только один препарат – Signum (Сигнум). В эксперимент также был включен аналитический стандарт тебуконазол (CAS number 107534-96-3, Merck).

Препараты разводили в стерильной воде таким образом, чтобы получить концентрацию рабочего раствора для обработки 1 га (300 л воды), содержащего максимальную дозу д.в., рекомендованную для использования в странах ЕС. Тебуконазол применяли в дозе, рекомендованной для препарата Фоликур (1.0 л/га). В дальнейшем полученные рабочие растворы последовательно десятикратно разводили стерильной водой и вносили в картофельно-декстрозный агар 50% (KДA, Merck), остуженный до температуры 50°С. Конечные концентрации препарата в среде составили 1, 0.1, 0.01 и 0.001% исходного рабочего раствора. Максимальная концентрация д.в. была подобрана в предварительном тестировании по определению диапазона чувствительности выборки штаммов. После тщательного перемешивания смеси разливали по 20 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм.

Культуры грибов 2-х видов Microdochium и F. culmorum выращивали на КДА в темноте при 24°С в течение 5-ти сут. Из выросших колоний стерильным микробиологическим сверлом вырезали диски диаметром 5 мм, которые затем мицелием вниз помещали на КДА в центр каждой пластиковой чашки Петри. Через 5 сут инкубации (24°С, темнота) определяли диаметр колонии гриба как среднее из двух перпендикулярных измерений. Из полученной величины вычитали величину инокуляционного диска 5 мм. Диаметр колонии штаммов на КДА без фунгицида использовали в качестве контроля. Ингибирующее действие фунгицида на радиальный рост гриба определяли как отношение разницы диаметра колонии в контроле и в варианте к диаметру колонии в контроле, выраженное в %. Штаммы, чувствительность которых к фунгициду оказалась более чем в 2 раза меньше, чем средняя для вида, характеризовали как резистентные к данному фунгициду.

Эксперимент выполняли минимум двукратно. Для статистической обработки и визуализации полученных данных использовали программы Microsoft Excel 2010, Minitab 17 и STATISTICA 10.0. При попарных сопоставлениях использовали тест Тьюки, достоверность различий принимали при p < 0.05. Концентрации фунгицидов, приводящих к 50%-ному подавлению роста грибов – EC₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация, half maximal effective concentration), рассчитывали с помощью программного обеспечения Quest Graph™ LD50 Calculator (https://www.aatbio.com/tools/ld50-calculator/).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На 5-е сут культивирования на КДА в контрольных вариантах диаметр колоний штаммов M. majus варьировал от 38 до 60 мм и в среднем составил 50 ± 5 мм, тогда как диаметр колоний штаммов M. nivale оказался в диапазоне 50–71 мм и в среднем был достоверно больше – 60 ± 4 мм. Штаммы F. culmorum характеризовались наиболее интенсивным ростом – средний диаметр их колоний составлял 75 мм, без различий между штаммами.

Влияние препаратов на рост грибов. Влияние препаратов на рост большинства штаммов грибов при наименьшей анализированной концентрации в питательной среде проявлялось как в ингибировании, так и стимуляции роста штаммов грибов в сравнении с контролем (рис. 1).

Рис. 1.

Подавление фунгицидами радиального роста грибов при культивировании на КДА, содержащем препараты в различных концентрациях. Величины, обозначенные одной буквой, не имеют достоверных различий (p < 0.05) при определенной концентрации фунгицида.

Обнаружено стимулирующее действие минимальной 0.001%-ной концентрации препарата Banner Maxx, содержащего пропиконазол, на рост 11 штаммов Microdochium (50% всех анализированных штаммов), размеры их колоний оказались в среднем на 17% больше, чем в контроле (р = 0.0002). Также было выявлено достоверное стимулирующее действие минимальной концентрации рабочего раствора препаратов Exteris Stressgard, Instrata, Switch 62.5 WG и Signum на штаммы M. nivale. Добавление в среду препаратов Heritage и Medallion TL, Switch 62.5 WG и тебуконазола в минимальной концентрации оказывало стимулирующее действие на единичные штаммы M. majus, которое проявлялось в увеличении диаметра колоний на 8–19%. Не выявлено стимулирующее действие ни для одного из анализированных препаратов на рост штаммов F. culmorum, включенных в исследование.

Концентрации фунгицидов EC₅₀, приводящих к 50%-ному подавлению радиального роста анализированных видов грибов, приведены в табл. 2. В нашем исследовании установлено, что наибольшее ингибирующее действие на рост штаммов M. majus оказывали 3 препарата, содержащие флудиоксонил: их EC₅₀ составили 0.005–0.010% концентрации рабочего раствора или 14–63 мкг д.в./л. В то же время остальные фунгициды менее эффективно подавляли рост штаммов этого вида (EC₅₀ варьировали в диапазоне 0.063–0.565%).

Чувствительность штаммов M. nivale к препаратам, включенным в исследование, оказалась наиболее высокой в сравнении с M. majus. Максимальный ингибирующий эффект (средняя величина EC₅₀ 0.001% или 10 мкг/л) на рост штаммов M. nivale оказывали препарат, содержащий азокситробин (диапазон EC₅₀ 0.001–0.258% концентрации рабочего раствора или 6.6–2140 мкг д.в./л), а также комбинированный препарат, включающий трифлоксистробин в сочетании с флуопирамом (EC₅₀ 0.0001–0.029%, 0.4–121 мкг трифлоксистробина/л). Другие фунгициды были менее эффективны – их EC₅₀ варьировали от 0.002 до 0.426% для отдельных штаммов M. nivale и в среднем составляли 0.005–0.113%.

Все штаммы F. culmorum оказались высокочувствительными к содержащим пропиконазол и флудиоксонил препаратам, величина EC₅₀ которых варьировала от 0.002 до 0.009%. Сходное, но менее эффективное действие продемонстрировали тебуконазол и стробилурин-содержащие препараты – диапазон величин EC₅₀ составил 0.038–0.103%. Из всех анализированных фунгицидов наименее эффективно ограничивал рост штаммов F. culmorum монопрепарат на основе азоксистробина (EC₅₀ варьировала в диапазоне 0.341–1.407%).

Ранее показано, что флудиоксонил по сравнению со смесью битертанол + фуберидазол более эффективно подавлял рост грибов (анализировали содержание грибной ДНК в зерне), относящихся к роду Microdochium, чем F. culmorum [15]. Позже эти авторы провели эксперименты in vitro и установили, что соотношение средних величин EC₅₀ флудиоксонила для видов M. majus / M. nivale составляло 0.71, что свидетельствовало о меньшей чувствительности штаммов M. nivale в сравнении с M. majus к этому д.в. [16]. Высокая эффективность флудиоксонила против грибов Microdochium, выделенных из газонных трав и зерновых культур, была подтверждена норвежскими и литовскими учеными [17, 18]. Кроме этого, двухгодичные полевые испытания подтвердили положительное влияние обработки семян флудиоксонилом на их всхожесть и позволили значительно уменьшить потери урожая от болезней при использовании изначально сильно инфицированных грибами семян [19].

Значительный ингибирующий эффект тебуконазола на зараженность колосьев грибами F. culmorum и F. avenaceum показан ранее, при этом отмечено, что его эффективность в отношении M. nivale была низкой [20]. Наши результаты показали согласованность с ранее опубликованными данными – тебуконазол и пропиконазол эффективнее подавляли рост F. culmorum (диапазон EC₅₀ составил 0.002–0.049% концентрации рабочего раствора, 332–1388 мкг д.в./л), чем M. majus (EC₅₀ – от 0.033 до 1.031%, 2450–15850 мкг д.в./л) и M. nivale (EC₅₀ – от 0.004 до 0.426%, 240–3537 мкг д.в./л). Чешские исследователи также установили, что тебуконазол и метконазол, добавленные в КДА, оказывали меньший ингибирующий эффект на рост 28 штаммов M. nivale, чем прохлораз и эпоксиназол [21].

Результаты полевых экспериментов показали, что применение азоксистробина снижало инфицированность колосьев пшеницы M. nivale, но увеличило их колонизацию грибами Fusarium, которые получали конкурентное преимущество [20, 22].

Согласно результатам норвежских исследователей, однократное использование пропиконазола (или смеси азоксистробин + пропиконазол) в октябре на 80% снижало проявление на полях для гольфа симптомов снежной плесени, вызванных грибами Microdochium, и эффект обычно превышал 90%, если опрыскивание одним из этих фунгицидов сопровождалось хотя бы одним применением флудиоксонила перед появлением снежного покрова [23].

Таким образом, в зависимости от доминирующего вида гриба в составе комплекса патогенов, вызывающих снежную плесень, необходимо использовать препараты, содержащие в своем составе целевое д.в. Согласно нашим результатам, следует применять флудиоксонил против M. majus и F. culmorum, а стробилурины – против M. nivale. Кроме того, системные фунгициды, проникающие в ткани растений, по всей видимости, имеют преимущества, особенно в случае защиты газонных трав, которые подвергаются постоянному скашиванию в течение вегетационного сезона.

Внутривидовое разнообразие грибов по чувствительности к фунгицидам. Различий 3-х штаммов F. culmorum по чувствительности к включенным в исследование фунгицидам не выявлено, что, вероятно, связано с ограниченной выборкой штаммов данного вида. Ранее были отмечены существенные различия чувствительности к тебуконазолу и эпоксиконазолу 107 штаммов F. culmorum, а также обнаружена перекрестная резистентность этих штаммов к обоим триазолам (r = 0.61), которая оставалась стабильной с течением времени [24]. Массовое использование фунгицидов может приводить к появлению резистентных популяций грибов в природе. Комитет по противодействию резистентности к фунгицидам (Fungicide Resistance Action Committee) отнес грибы Microdochium, вызывающие снежную плесень, к патогенам со средним риском развития резистентности к фунгицидам [25].

Из 8-ми анализированных в нашей работе штаммов M. majus 5 штаммов продемонстрировали резистентность к 1–2-м препаратам. Три штамма M. majus MFG 58971, MFG 58975 и MFG 59 102, выделенные из зерна пшеницы в Калининградской обл., Ставропольском и Краснодарском краях соответственно, можно охарактеризовать как резистентные к азоксистробину (EC₅₀ – от 0.915 до 2.022% концентрации рабочей жидкости или от 7.6 до 16.8 мг д.в./л). Штамм M. majus MFG 58 971 также оказался резистентен к тебуконазолу: его чувствительность к этому д.в. оказалась в 2.4 раза меньше, чем в среднем для вида (EC₅₀ – 1.031%, 8.6 мг д.в./л).

Два других штамма M. majus MFG 59 023 и MFG 59 108, выделенных из зерна пшеницы в Ленинградской обл. и Финляндии соответственно, продемонстрировали низкую чувствительность к препарату Signum на основе боскалида и пираклостробина: EC₅₀ для этих штаммов составила 0.951 и 1.165% соответственно, что оказалось в 5.3–6.5 раза больше, чем в среднем для вида.

Среди 11-ти анализированных штаммов M. nivale 5 штаммов продемонстрировали резистентность к 1–4-м препаратам. Низкая чувствительность к 3-м препаратам, в состав которых входит азоксистробин, трифлоксистробин, пропиконазол, а также к тебуконазолу выявлена у штамма M. nivale MFG 59 028, выделенного из зерна пшеницы в Ленинградской обл. Величина EC₅₀ препарата Banner Maxx, содержащего пропиконазол, и тебуконазола для этого штамма составила 0.037 и 0.426% (3.5 и 5.8 мг д.в./л) соответственно и оказалась в 3.1–3.8 раза больше, чем в среднем для вида M. nivale. Для препаратов Exteris Stressgard и Heritage, содержащих трифлоксистробин и азоксистробин, EC₅₀ в отношении M. nivale MFG 59 028 была равна 0.029 и 0.258% (121 и 2144 мкг QoI д.в./л) соответственно и превышала средний показатель для вида в 26–215 раз.

У 3-х штаммов M. nivale MFG 59 038, MFG 60 223 и MFG 60231, выделенных из листьев злаковых растений в Санкт-Петербурге и Ленинградской обл., была выявлена резистентность хотя бы к одному из препаратов, содержащих пираклостробин (Signum) или трифлоксистробин (Exteris Stressgard): EC₅₀ этих препаратов оказалась равна 0.004–0.935% (17–2712 мкг QoI д.в./л), что превышала средний показатель для вида M. nivale в 3–73 раза.

У штамма M. nivale MFG 59144, выделенного из зерна пшеницы в Краснодарском крае, отмечена низкая чувствительность как к препарату Signum, содержащему пираклостробин, (EC₅₀ 4.527% или 13.1 мг QoI д.в./л), так и к тебуконазолу (EC₅₀ 0.238% или 1.9 мг д.в./л).

Впервые информация о резистентности M. nivale к бензимидазолу была опубликована в 1983 г. [26]. Неоднократно были зарегистрированы лабораторно подтвержденные случаи полевой резистентности M. nivale к ипродиону – другому д.в. из класса имидазолов. Впервые в работе [27] в 1982 г. протестировали чувствительность к ипродиону изолятов, выделенных из травы полей для гольфа, где ипродион внезапно утратил эффективность после 3-х лет его активного использования против снежной плесени. Двадцать один из 24 изолятов F. nivale (в настоящее время M. nivale sensu lato) оказались резистентными и росли на КДА с добавлением ипродиона в концентрации ≥10 мкг/мл. Эти же изоляты были перекрестно-толерантными к винклозолину и процимидону. Позднее резистентные к ипродиону изоляты M. nivale были обнаружены на полях для гольфа в Новой Зеландии – их частота встречаемости составила 19%, и все изоляты, кроме одного, также были устойчивы к бензимидазолу [28]. Установлена связь между многократным ежегодным использованием ипродиона и пропиконазола в разных регионах Канады и выявлением высокой доли изолятов M. nivale (до 12–82 и 24–77% соответственно), которые проявили пониженную чувствительность к этим д.в. и более медленный рост на КДА в экспериментах in vitro [29]. Проведенное исследователями геномное сравнение чувствительных и резистентных к ипродиону изолятов M. nivale выявило ряд новых мутаций в кодирующих последовательностях генов mnos-1 и mnos-4, которые могли быть связаны с резистентностью к этому д.в.

В первом сообщении о резистентности к стробилуринам грибов Microdochium было показано, что половина штаммов M. nivale и особенно M. majus, собранных в полях 2007 г. во Франции, были нечувствительны к QoI фунгициду [30]. Большинство выявленных стробилурин-резистентных изолятов также демонстрировали низкую чувствительность к бензимидазолам, в то время как положительной перекрестной резистентности к флудиоксонилу и ингибиторам биосинтеза стеролов (SBI) не установлено. В другом исследовании ожидаемой перекрестной резистентности штаммов M. nivale к 4-м анализированным фунгицидам из класса DMI не выявлено [21].

До недавнего времени не было ни одного лабораторно подтвержденного случая резистентности к SBI и SDHI фунгицидам [25]. С использованием ультрафиолетового излучения удалось индуцировать мутации у M. nivale, которые привели к появлению изолятов, устойчивых к SBI д.в., но полученные в лаборатории мутанты имели низкую жизнеспособность в полевых условиях [31].

В наш эксперимент были включены штаммы грибов широкого географического происхождения, чтобы охарактеризовать их индивидуальную чувствительность к фунгицидам. Априори предполагали нормальность распределения этого показателя, и что среди штаммов из контрастных регионов толерантными будут те, которые были выделены из растений, выращенных на полях южного региона европейской части России, где существует высокий фунгицидный прессинг. Однако результаты показали, что среди штаммов Microdochium, проявивших резистентность к препаратам, содержащим в своем составе разные д.в., оказались штаммы из географически отдаленных территорий, и какой-либо связи реакции чувствительности штамма с регионом его происхождения выявить не удалось.

В то же время анализ чувствительности штаммов грибов Microdochium, распределенных на 2 выборки (выделенные из зерна или из листьев с симптомами поражения) показал, что субстратное происхождение штамма достоверно влияло на чувствительность штаммов в случае половины анализированных фунгицидов – тебуконазола (при р = 0.0107), Banner Maxx (при р = 0.0111), Exteris Stressgard (при р = 0.0125) и Heritage (при р = = 0.0215). Штаммы грибов Microdochium, выделенные из зерна, в среднем были менее чувствительны к этим фунгицидам по сравнению со штаммами, выделенными из листьев (рис. 2). Остальные 4 препарата такой существенной разницы не показали.

Рис. 2.

Чувствительность штаммов грибов M. majus и M. nivale, выделенных из зерна и листьев, к анализированным фунгицидам. Столбик и число – среднее для выборки штаммов, интервал – доверительный интервал при р < 0.05.

Комплекс видов грибов, обитающих на злаковых травах, может приводить не только к ухудшению внешнего вида растений, но и к снижению качества получаемого урожая семян.

Знание чувствительности различных видов грибов к тому или иному фунгициду чрезвычайно важно при планировании систем защиты и помогает сформировать принципы стратегии при выборе мер борьбы с возбудителями заболеваний злаковых трав. Результаты нашего исследования позволили установить различное действие 7-ми коммерческих фунгицидов в отношении представителей 3-х видов грибов, широко распространенных представителей микобиоты злаковых трав, а также выявили меж- и внутривидовые различия грибов рода Microdochium и F. culmorum в чувствительности к разным препаратам.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена высокая эффективность подавления роста грибов M. majus и F. culmorum препаратами, содержащими флудиоксонил, в случае M. nivale – препаратами, содержащими стробилурины. Тебуконазол и пропиконазол менее эффективно подавляли рост грибов Microdochium, чем F. culmorum.

2. Штаммы M. majus в среднем были менее чувствительными ко всем анализированным фунгицидам, чем штаммы 2-х других видов грибов. Среди включенных в исследование штаммов M. majus 62.5% продемонстрировали резистентность к 1–2-м препаратам, содержащим QoI д.в. (азоксистробин, пираклостробин). В то же время 45% анализированных штаммов M. nivale проявили резистентность к 1–4-м препаратам, содержащим QoI и SBI д.в.

3. Влияния географического происхождения штаммов на их чувствительность к анализированным фунгицидам не выявлено.

4. Штаммы грибов, имеющие различное субстратное происхождение – листья или зерно, достоверно различались чувствительностью к 4-м фунгицидам. Штаммы, выделенные из зерна, оказались менее чувствительными к тебуконазолу и препаратам, содержащим пропиконазол, азоксистробин, а также к смеси трифлоксистробин + + флуопирам по сравнению со штаммами грибов, выделенных из листьев растений с симптомами ожога или снежной плесени. Эти д.в. входят в состав протравителей, которые давно и активно используют для обработок семян зерновых культур, что могло привести к снижению чувствительности к ним грибов, обитающих на зерне.