Журнал аналитической химии, 2019, T. 74, № 1, стр. 67-80

ЦЕЛЕВОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ РАСТЕНИЙ

Развитие современной медицинской науки неразрывно связано с созданием новых лекарственных средств. Одним из путей создания новых эффективных препаратов является тщательное исследование химического состава лекарственных растений, находящих широкое применение в лечебной практике. Так, например, в состав Rhodiola rosea входят такие физиологически активные вещества, как салидрозид, розавин и розарин [1]. Первоначально качество препаратов с экстрактами из Rhodiola rosea определяли по количеству содержащегося в них салидрозида. Однако позже выяснили, что салидрозид является общим соединением для целого семейства растений [2], поэтому стали определять качество данных препаратов по концентрации в них розавина и розарина, близких по свойствам салидрозиду. Салидрозид, розавин и розарин – природные анксиолитики (антидепрессанты), их суммарное содержание в корневище родиолы розовой может достигать нескольких процентов. Структурные формулы салидрозида, розавина и розарина представлены на схеме 1 .

Схема 1 . Структурные формулы салидрозида (1), розавина (2) и розарина (3) [3].

С использованием метода жидкостной хромато-масс-спектрометрии нами разработан способ одновременного определение салидрозида, розавина и розарина в экстрактах из корневища Rhodiola rosea [3]. Пределы обнаружения (нг/мл) составили 2 для салидрозида, 4 для розавина и 6 для розарина. Предложенный подход апробировали при анализе экстрактов из корневища Rhodiola rosea. Для анализа растительных экстрактов использовали обращенно-фазовый вариант хроматографии на сорбенте с привитыми группами SB-С18. Детектирование осуществляли методом тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением в режиме мониторинга выбранных реакций для отрицательных ионов. Для определения использовали следующие выбранные реакции: m/z 427 → m/z 293 (определение), m/z 427 → m/z 249 (качественное подтверждение) для розарина; m/z 427 → m/z 294 (определение), m/z 427 → m/z 149 (качественное подтверждение) для розавина; m/z 299 → m/z 119 (определение), m/z 299 → m/z 89 (качественное подтверждение) для салидрозида. Преимуществами разработанного способа анализа являются его высокие достоверность и правильность, что позволяет использовать его в качестве референтного.

Женьшеневые сапонины (гинсенозиды) являются основными действующими веществами растений рода Panax. Эти растения активно используют в производстве средств ТМ в Китае, Корее, Японии, США и на Дальнем Востоке. В настоящее время женьшень применяют как биологически активную добавку, общеукрепляющее средство, повышающее сопротивляемость организма к физическому, химическому и биологическому стрессу [4, 5]. Кроме того, показано, что препараты, содержащие женьшень, эффективны в качестве лекарственных средств, в частности, они обладают противораковой активностью [6, 7]. На данный момент более 620 гинсенозидов выделено из растения рода Panax [8]. Молекула любого гинсенозида состоит из основания (сапогенина) и углеводных боковых цепей, которые в свою очередь также могут иметь заместители более простой структуры. Наиболее распространены гинсенозиды с протопанаксатриольными (ППТ), протопанаксадиольными (ППД), окотиллольными (ОТ) и олеаноловым кислотным (ОАК) сапогенинами. На протяжении последних 50 лет многие исследователи разрабатывали методы идентификации и определения гинсенозидов в растительных материалах, экстрактах и коммерческих продуктах. Гинсенозиды разделяли с помощью газовой хроматографии, тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Для ВЭЖХ-определения гинсенозидов применяли спектрофотометрическое и флуоресцентное детектирование, а позднее детектирование по светорассеянию и масс-спектрометрию. Наиболее поздние варианты экстрагирования и способы определения гинсенозидов рассмотрены нами в обзоре [9] c критической оценкой результатов.

Нами разработан способ одновременного определения гинсенозидов в экстрактах из растительного сырья и продуктах на их основе [10]. Применимость данного способа подтверждена при определении четырех основных гинсенозидов Rg1, Rb1, Rf и Re (схема 2 ) в образцах корней азиатского женьшеня (Panax ginseng), фитопродукте и чае на его основе.

Схема 2 . Структурные формулы гинсенозидов Rb1, Rg1, Rf и Re [10].

Для оценки содержания в смеси или образце гинсенозидов с ППТ-сапогенинoм, например Rg1, Rf и Re, использовали ионы с m/z 459.4, 441.4, 423.4 и 405.5, а для гинсенозидов с ППД-сапогенинoм, например Rb1, использовали ионы с m/z 443.4, 425.4 и 407.5. Эти наборы ионов, паттерны фрагментации, являются не только характеристичными для наиболее распространенных [8] указанных гинсенозидов, но и самыми интенсивными (рис. 1).

Интенсивности выбранных ионов близки, и все они соответствуют сапогенину с потерей некоторого числа молекул воды, поэтому суммирование интенсивностей данных сигналов гарантирует получение лучших пределов обнаружения, независимо от изменений условий выполнения анализа. Количественный анализ проводили в двух режимах. Для Rb1, Rg1, Rf и Re в режиме сканирования по сумме интенсивностей выбранных сигналов достигнуты пределы обнаружения 10, 6, 3 и 9 нг/мл, в режиме мониторинга выбранных ионов – 6, 6, 1 и 3 нг/мл соответственно. Сравнивать чувствительность определения данных соединений по сумме интенсивностей выбранных сигналов в водных растворах в упомянутом выше режиме сканирования и в режиме мониторинга тех же выбранных сигналов по значению коэффициента чувствительности некорректно из-за разных условий получения аналитического сигнала в данных режимах, однако из полученных пределов обнаружения можно заключить, что разница между этими способами определения незначительна, а использование режима сканирования, при котором третий квадруполь работает в качестве линейной ионной ловушки (ЛИЛ), позволяет не только определять гинсенозиды с достаточной чувствительностью, но и одновременно идентифицировать их. Попытки повысить чувствительность определения данных веществ, используя режим мониторинга выбранных реакций, не привели к успеху, так как не удалось получить достаточно интенсивные сигналы, соответствующие протонированным или депротонированным молекулам гинсенозидов, из-за легкости протекания их фрагментации в источнике ионов масс-спектрометра. Для апробации разработанного способа определения гинсенозидов проанализировали образцы экстрактов из свежего и высушенного корней растения Panax ginseng, корейского чая на основе женьшеня и очищенного фитопродукта неизвестного состава, в которых успешно обнаружили и определили гинсенозиды Rb1, Rg1, Rf и Re.

Связь положительного влияния на организм человека и животных некоторых продуктов растительного происхождения напрямую связана с содержанием в них индивидуальных физиологически активных компонентов. Положительное влияние может оказывать как группа соединений, так и отдельные вещества. Задача идентификации отдельных компонентов растительной продукции является очень важной и актуальной, так как в дальнейшем могут быть созданы препараты и лекарства на основе только действующих компонентов растительной продукции.

Нами разработан способ быстрой идентификации гинсенозидов, содержащихся в корейском женьшеневом чае методом ВЭЖХ–МС с использованием ЛИЛ [11]. Гинсенозиды экстрагировали из корейского женьшеневого чая в ультразвуковой ванне 40%-ным (по объему) раствором этанола в воде в течение 30 мин. Разделение смеси стандартов гинсенозидов и экстракта проходит за 30 мин на обращенно-фазовой колонке в режиме градиентного элюирования. В качестве подвижной фазы использовали 0.1%-ную муравьиную кислоту в воде и ацетонитрил. При анализе 8 стандартных растворов гинсенозидов (Rb1, Re, Rg1, Rf, Rd, Rb2, Rb3 и Rc) обнаружено, что в условиях электрораспылительной ионизации гинсенозиды образуют катионированные молекулы [M + Na]⁺ в режиме регистрации положительно заряженных ионов и депротонированные молекулы [M–H]^– в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. Фрагментация данных ионов происходит только с разрывом гликозидных связей, что позволило провести их однозначную идентификацию. Все фрагментные ионы выбранных гинсенозидов интерпретированы и охарактеризованы. Показано, что масс-спектры фрагментных ионов в режиме регистрации положительных ионов дают больше информации о структуре сапогенина и боковых сахаридных последовательностей по сравнению с аналогичными спектрами для депротонированных молекул гинсенозидов [M–H]^–. Достоинством разработанного способа идентификации гинсенозидов с использованием ЛИЛ, во-первых, является уникальная возможность одновременного получения информации о структуре каждого найденного гинсенозида и детектирования катионированных молекул [M + Na]⁺ и тем самым выделения группы изомерных гинсенозидов. Во-вторых, появляется возможность сравнения путей фрагментации изомерных и изобарных соединений в одинаковых условиях, что позволяет их различать. В экстракте из корейского женьшеневого чая идентифицировано более 22 гинсенозидов, масс-спектры которых полностью интерпретированы и охарактеризованы. Разработанный способ позволяет быстро идентифицировать неизомерные сапонины, изомерные сапонины с различными сапогенинами и изомерные сапонины со значительными различиями в структуре даже без использования стандартных образцов.

Наша работа [12] посвящена разработке удобного, быстрого и неразрушающего метода извлечения гинсенозидов из объектов со сложной матрицей, совместимого с чувствительным ВЭЖХ–МС-детектированием этих соединений. Для извлечения гинсенозидов использовали ультразвуковую экстракцию при 30°С. В качестве экстрагента применяли смеси воды с метанолом либо этанолом. Изучали влияние состава экстрагирующей смеси, объема смеси и числа последовательных актов экстрагирования на эффективность экстрагирования. Для масс-спектрометрического детектирования использовали третий квадруполь, работающий в режиме ЛИЛ. Способом введено–найдено подтвердили применимость разработанного способа экстрагирования гинсенозидов Rb1, Rg1 и Rc из корня женьшеня; степени извлечения выбранных гинсенозидов составляли от 80 до 110%. При ультразвуковом экстрагировании в выбранных условиях не происходит превращения Rb1 и Rc в гинсенозиды Rg3 и Rh2 соответственно. Показано, что применение смесей вода–метанол и вода–этанол с концентрацией органического растворителя 40–80% в качестве экстрагента обеспечивает наилучшие значения степеней извлечения широкого круга гинсенозидов. Также показано, что для экспрессного анализа коммерческих продуктов достаточно одного акта экстрагирования 10 мл смеси, так как потери аналитов не превышают 10–15% в сравнении с многократным экстрагированием той же смесью.

Для определения псевдогинсенозидов F11 и RT5 – биомаркеров американского женьшеня (P. quinquefolius) – применяли метод ВЭЖХ–МС/МС [13]. Обнаружено, что, в отличие от гинсенозидов, псевдогинсенозиды могут образовывать протонированные молекулы за счет протонирования атома кислорода, входящего в состав пятичленного цикла (рис. 2), который разомкнут в молекулах гинсенозидов (схема 2 ). Таким образом, псевдогинсенозиды могут быть обнаружены и определены с высокой чувствительностью в режиме мониторинга выбранных реакций в присутствии изомерных и близких по свойствам гинсенозидов. Для масс-спектрометрического детектирования выбрали следующие реакции: m/z 801 → → m/z 143 (определение), m/z 801 → 439 m/z (качественное подтверждение) для F11; m/z 655 → m/z 143 (определение), m/z 655 → m/z 439 (качественное подтверждение) для RT5. Для близких по свойствам псевдогинсенозидов F11 и RT5, в отличие от предыдущей работы [10], в режиме изократического элюирования удалось добиться приемлемого хроматографического разделения. Для F11 и RT5 достигнуты пределы обнаружения 10 и 20 нг/мл соответственно.

Разработанный способ апробировали при анализе высушенных корневищ P. ginseng, выращенных в Брянской области и Сибири, а также сушеных долек корня P. quinquefolius. Псевдогинсенозид F11 обнаружен и определен в образцах азиатского женьшеня, выращенных в Сибири, и в образцах сушеных долек корня P. quinquefolius. Псевдогинсенозид RT5 обнаружен только в образцах сибирских высушенных корневищ P. ginseng. Присутствие псевдогинсенозидов в образцах сибирских высушенных корневищ P. Ginseng свидетельствует о присутствии в данном образце примесей американского женьшеня.

Лимонник китайский (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill) – вид цветковых растений рода Лимонник (Schisandra) семейства Лимонниковые (Schisandraceae). В состав семян S. chinensis входит большое число активных компонентов – лигнанов, являющихся компонентами современных лекарственных средств и пищевых добавок [14]. Препараты на основе S. chinensis применяют в ТМ в качестве антиспазматического тоника для легких и почек [15], они также способствуют выработке жидкости в организме, тонизируют почки и вызывают седативный эффект [14]. Кроме того, на протяжении нескольких сотен лет препараты на основе этого растения используют для лечения бессонницы [16]. Основными биоактивными компонентами S. chinensis являются схизандрол А и схизандрол В (схема 3 ), наряду с схизандринами А, В, С, содержащимися примерно на том же уровне концентраций в спиртовых экстрактах [17].

Схема 3 . Структурные формулы схизандролов А и В [18].

Нами разработан способ совместного определения схизандролов А и В в экстрактах из семян Schisandra chinensis методом ВЭЖХ–МС/МС [18]. Для выбора наиболее подходящего способа экстрагирования схизандролов А и В сравнили экстрагирование водно-ацетонитрильной вытяжкой в ультразвуковой ванне при 30°C и водной вытяжкой с кипячением. Установлено, что при приготовлении водной вытяжки определяемые соединения извлекаются в 9 раз хуже по сравнению с экстрагированием водно-ацетонитрильной смесью. Масс-спектрометрическое детектирование проводили в режиме мониторинга выбранных реакций, так как в масс-спектре определяемых соединений наблюдались интенсивные сигналы, соответствующие протонированным молекулам схизандролов А и В (m/z 433 для схизандрола А и m/z 417 для схизандрола В), а также их характерным фрагментным ионам, образующимся в ячейке соударений (m/z 415 и 384 для схизандрола А, m/z 399 и 368 для схизандрола В). Хроматографическое разделение экстрактов осуществляли в режиме градиентного элюирования. Для схизандролов А и В достигнуты пределы обнаружения 8 и 4 нг/мл соответственно.

Основным компонентом корня солодки является глицирризин (глицирризиновая кислота; 20β-карбокси-11-оксо-30-норолеан-12-ен-3β-ил-2-О-β-D-глюкопирануронозил-α-D-глюкопиранозидуроновая кислота). Глицирризин обладает противовоспалительным, противовирусным, антиаллергенным эффектом, а также проявляет хемопрофилактическую активность против рака и СПИДа [19–21]. Наряду с глицирризином, более 400 других тритерпеновых сапонинов и флавоноидов, отвечающих за терапевтический эффект, обнаружено в G. glabra и родственных видах [22]. Так, помимо глицирризина в корнях солодки находится большое число других важных сапонинов близкой структуры, например ликорица-сапонин G2; в состав растения входят также их сапогенины (агликоны) – глицирретовая кислота, глабролид и др. [22]. Таким образом, для оценки состава препарата или исходного растительного материала необходимо идентифицировать пики сапонинов на хроматограмме, а затем рассчитать содержания хотя бы основных компонентов, стандартные образцы которых доступны. Поскольку глицирризин содержится в корнях солодки в значительно бóльших количествах по сравнению с другими сапонинами, нами предложен способ его ВЭЖХ–МС/МС-определения в растительных материалах [23]. Разделение проводили в обращенно-фазовом режиме на колонке С18 с применением градиентного элюирования. В качестве подвижной фазы использовали 0.1%-ную муравьиную кислоту (подвижная фаза А) и ацетонитрил (подвижная фаза Б). Количественный анализ проводили в режиме мониторинга выбранных реакций в варианте регистрации отрицательно заряженных ионов. Для определения и качественного подтверждения использовали переходы m/z 821 → m/z 471 и m/z 821 → m/z 193 соответственно. Предел обнаружения глицирризина составил 2 нг/мл, градуировочный график линеен в диапазоне от 6 до 1000 нг/мл. Глицирризин извлекали из образцов корня солодки и женьшеневого улуна в ультразвуковой ванне смесью изопропанола с водой (7 : 3, по объему). Экстракты фильтровали и разбавляли в 10 и 100 раз подвижной фазой А. Из чайных гранул женьшеня и корня солодки извлекалось около 80 и 90% глицирризина соответственно.

Шлемник байкальский (Scutellariae baicalensis) – одно из наиболее популярных растений ТМ, которое используют при лечении воспалительных процессов, гипертонии, сердечно-сосудистых заболеваний, а также при бактериальных и вирусных инфекциях, благодаря входящим в его состав активным компонентам, таким как байкалин, байкалеин, вогонин и скутелларин. Нами разработан высокочувствительный способ совместного определения байкалина, байкалеина, вогонина и скутелларина в экстрактах из растительных материалов [24]. Хроматографическое разделение проводили на обращенно-фазовой колонке в режиме градиентного элюирования за 20 мин. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0.5%-ной муравьиной кислоты в воде и ацетонитрил. Масс-спектрометрическое детектирование проводили в варианте регистрации отрицательно заряженных ионов в режиме мониторинга выбранных реакций: m/z 283 → m/z 268, m/z 283 → m/z 163 для вогонина (первый переход для определения, второй для качественного подтверждения), m/z 461 → m/z 285, m/z 461 → m/z 175 для скутелларина, m/z 445 → m/z 269, m/z 445 → m/z 175 для байкалина и m/z 269 → m/z 195, m/z 269 → m/z 139 для байкалеина. Достигнутые пределы обнаружения определяемых соединений лежат в диапазоне от 1 до 4 нг/мл. Показана возможность применения разработанного способа в анализе двух коммерчески доступных образцов корня Scutellariae baicalensis.

Данные по пределам обнаружения, а также условиям хромато-масс-спектрометрического определения выбранных физиологически активных компонентов растений представлены в табл. 1.

ГРУППОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ РАСТЕНИЙ

Для того, чтобы охарактеризовать образец препарата ТМ, чаще всего применяют прием получения “отпечатков пальцев”, т.е. устанавливают присутствие, соотношение и состав нескольких характеристичных компонентов – биомаркеров растений. Существующие способы основаны на определении нескольких биомаркеров, стандартные образцы которых чаще всего коммерчески доступны, а условия детектирования индивидуальны (мониторинг выбранных реакций или псевдомолекулярных ионов по точному значению m/z). Для повышения достоверности результатов при таком способе идентификации компонентов в пищевых добавках и лекарственных средствах возможно использование более информативных способов анализа, таких как ВЭЖХ–МС в режиме сканирования, например, с использованием ЛИЛ, и в режиме регистрации диагностических ионов, которые встречаются в масс-спектрах целой группы близких по структуре компонентов того или иного растения. Недостатком первого способа является необходимость трудоемкой ручной обработки данных, поскольку объединение таких масс-спектров в единую базу или библиотеку невозможно из-за индивидуальных особенностей источников ионов разных производителей, их состояния, состава применяемых подвижных фаз и т.д. Кроме того, полное хроматографическое разделение недостижимо даже при анализе экстракта из одного растения, а тем более при анализе экстракта из смешанного препарата, когда происходит наложение масс-спектров компонентов с близкими временами удерживания, что сильно осложняет интерпретацию. Второй способ, хотя и проигрывает в информативности, поскольку все сигналы в масс-спектрах фрагментных ионов не регистрируют, обладает рядом преимуществ. Во-первых, в некоторых случаях, например для группы родственных сапонинов, можно выделить целый набор диагностических ионов из паттерна фрагментации сапогенина [25]. Это позволяет отличить эту группу от других гликозидов даже при совпадении их брутто-формул, что повышает информативность и достоверность такого подхода. Во-вторых, на хроматограммах, полученных по сигналам диагностических ионов, можно выделить все пики исследуемой группы соединений, что также повышает информативность и возможность автоматизации данного подхода.

Для групповой идентификации широкого круга гинсенозидов в растениях рода Panax и продуктах на основе женьшеня мы применили ВЭЖХ–МС с ЛИЛ [25]. Ультразвуковое экстрагирование гинсенозидов из растительных материалов проводили двумя порциями по 10 мл смеси вода–метанол (4 : 1, по объему). Показано, что в выбранных условиях экстрагирования не происходит разрушения определяемых гинсенозидов и степени извлечения высоки (>80%). Хроматографическое разделение проводили в режиме градиентного элюирования, продолжительность анализа составила 45 мин. Для каждого пика гинсенозида на масс-хроматограмме по значению m/z сигнала, соответствующего катионированной молекуле [M + Na]⁺, определен состав его углеводной цепочки, присутствие ацетильных или малоновых заместителей, а также его молекулярная масса. Для определения типа сапогенина получали масс-хроматограммы смеси 17 стандартных образцов коммерчески доступных гинсенозидов и суммировали относительные интенсивности характеристичных ионов, принадлежащих паттернам фрагментации ППТ, ППД и ОТ сапогенинов (m/z 459, 441, 423, 405, 367, 349, 281, 229 для ППТ; 443, 425, 407, 369, 351, 283, 231 для ППД; и 475, 457, 439, 421, 403, 143, 125, 107 для ОТ). Таким образом, получены три характерные переменные и построена тестовая выборка масс-спектров гинсенозидов в трехмерном пространстве (рис. 3). Применение разработанного способа позволило провести групповую идентификацию гинсенозидов в экстрактах из 8 растительных материалов.

Для количественной оценки 17 стандартных гинсенозидов использовали наиболее интенсивные фрагментные ионы с m/z 423, 425 и 439, принадлежащие соответственно паттернам фрагментации ППТ, ППД и ОТ сапогенинов. Пределы обнаружения составили от 3 до 10 нг/мл, а градуировочные зависимости линейны в диапазоне от 10 до 5000 нг/мл. Прецизионность и внутрилабораторная прецизионность определения концентрации гинсенозидов (значения s_r) не превышала 2%.

Разработанный способ групповой идентификации расширен и использован для определения сапонинов, содержащихся в разных видах растений, обладающих сладким привкусом и ароматом – женьшене, абрусе и солодке [23]. Корень солодки голой (Glycyrrhiza glabra) семейства бобовые (Fabaceae) используют во всем мире в качестве естественного подсластителя и в некоторых случаях в качестве ароматизатора для приготовления конфет и различных продуктов. Кроме того, порошкообразный корень солодки обычно применяют в качестве лекарственного средства, он входит в состав примерно 60% предписаний и рецептов в ТМ [26]. Экстракт корня солодки обладает противоспазматическими, антидиабетическими, антидепрессивными, гепато-протекторными свойствами, отхаркивающим эффектом и улучшает память [27–30]. Глицирризин, а также абрусозиды из листьев четочника молитвенного (Abrus precatorius L.) [31] отвечают за сладкий вкус и аромат, интенсивность которого в 170 раз выше по сравнению с сахарозой [32].

Для извлечения сапонинов из женьшеневого улуна, корней солодки и листьев четочника молитвенного использовали смесь изопропанол–вода (7 : 3, по объему), экстрагировали в ультразвуковой ванне в течение 40 мин при 25–30°С. Полученные экстракты разбавляли в 10 и 100 раз 0.1%-ной муравьиной кислотой в воде. Хроматографическое разделение экстрактов проводили в режиме градиентного элюирования. В качестве подвижной фазы использовали 0.1%-ную муравьиную кислоту в воде и ацетонитрил. Для сопоставления сапониновых профилей исследуемых экстрактов получали хроматограммы при одновременной регистрации сигналов из паттернов фрагментации нескольких сапогенинов (табл. 2).

Использование длительных программ градиентного элюирования позволяет для идентификации компонентов применять как времена удерживания основных пиков, так и присутствие всех характеристичных сигналов для каждой группы сапонинов. Графической иллюстрацией данного похода являются хроматограммы, построенные по сумме сигналов каждого паттерна фрагментации. Так, продемонстрировано присутствие абрусозидов из листьев A. precatorius, а также компонентов экстракта корня солодки в составе женьшеневого улуна, что обусловливает сладкий привкус этого вида чая. Однако оригинальные гинсенозиды женьшеня в этом продукте не обнаружены, что свидетельствует о его возможной фальсификации. Таким образом, предложенный способ позволяет на основании сопоставления профилей тритерпеновых сапонинов идентифицировать присутствие в составе растительных продуктов и пищевых добавок экстрактов из корней солодки, женьшеня или листьев четочника молитвенного, которые могут отвечать за наличие сладкого вкуса или аромата.

Для более достоверной идентификации структуры соединений необходимо дополнительное применение метода ЯМР, который мы использовали в исследовании состава женьшеневого улуна [33]. В метанольном экстракте идентифицирован новый компонент, относящийся к циклоартановому типу сапонинов, а также пять новых соединений. Структуры идентифицировали при помощи одномерного и двумерного ЯМР, масс-спектрометрии высокого разрешения, а также ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием в ЛИЛ. Показано, что эти соединения имеют различные углеводные цепочки, прикрепленные к молекуле абрусогенина. Сравнили сапониновые профили четырех коммерчески доступных образцов женьшеневых улунов и листьев четочника молитвенного. В результате идентифицировали три известных абрусозида и шесть новых ацетиловых и малониловых производных абрусогенина. Оригинальные гинсенозиды в экстракте не обнаружили. Таким образом, можно сделать вывод, что абрусозиды могли быть использованы в качестве заменителей сладковатого вкуса чая.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ СИСТЕМЫ

В последние годы в области анализа и контроля качества средств ТМ широкое применение находит способ количественного анализа многокомпонентной системы (КАМС), который позволяет определять содержания аналитов без применения их стандартных образцов, используя лишь факторы пересчета и устанавливая концентрацию одного референтного компонента в пробе [34]. Это – относительно новый метод количественного анализа, поэтому важно показать и доказать возможность его применения на практике, сравнивая значения концентраций определяемых соединений, полученные разными способами. Наиболее часто для такой оценки применяют относительную ошибку метода (ООМ, %) [35]:

где с₁, с₂ – концентрация компонента, определенная по методу КАМС, и внешнего или внутреннего стандарта соответственно. Приемлемым считается отклонение менее 10%. В методе КАМС референтное соединение выступает в роли внутреннего стандарта, концентрация которого меняется от пробы к пробе и должна быть определена с помощью построения градуировочной зависимости. Существует три способа определения коэффициента пересчета: метод расчета по одной точке, многоточечный метод расчета и расчет фактора пересчета по методу линейной регрессии. Данные методы детально описаны в работе [36], которая посвящена разработанному нами способу определения диосцина, протодиосцина и диосгенина в экстрактах из надземных частей растения T. terrestris (якорцы стелющиеся). Якорцы издревле используют в качестве растительного сырья в ТМ [37]. В якорцах стелющихся найдены стероидные гликозиды (не менее 0.7%), агликоном которых является диосгенин [38]. Для этого растения характерно также присутствие в его составе спиростаноловых и фуростаноловых сапонинов, которыми являются диосцин и протодиосцин. Определяемые соединения извлекали в ультразвуковой ванне смесью метанол–вода (1 : 1, по объему) в течение 15 мин при 25–30°С. Позднее наиболее подходящие условия экстрагирования прототодиосцина и диосцина описаны нами в работе [39]. Разделение проводили на обращенно-фазовой колонке в режиме градиентного элюирования. Для количественного определения диосгенина и его производных, к которым относятся такие основные компоненты, как протодиосцин и диосцин, регистрировали сигналы отдельных ионов, характерные для данной группы компонентов (m/z 415 и 397). Достигнутые методом внешней градуировки пределы обнаружения для диосгенина, диосцина и протодиосцина составили 20, 5 и 10 нг/мл соответственно. Для нахождения содержания выбранных компонентов по методу КАМС в качестве референтного компонента выбрали диосцин. Для вычисления факторов пересчета для протодиосцина и диосгенина использовали площади пиков по сигналам ионов с m/z 415 и 397. Из полученных данных следует, что значения факторов пересчета, вычисленные для разных ионов, отличаются незначительно, однако наименьшая погрешность вычисления концентрации по сравнению с методом внешнего стандарта получена при использовании суммарного сигнала двух ионов и метода расчета фактора по отношению наклонов градуировочных графиков. Характеристики разработанного подхода определения протодиосцина, диосцина и диосгенина оценивали при анализе экстрактов из надземных частей растения T. terrestris. Содержание протодиосцина рассчитывали по методам внешнего стандарта и КАМС, при этом значения ООМ составили менее 10%. Диосгенин в исследованных экстрактах не обнаружен.

Метод КАМС также применен нами для определения гинсенозидов в продуктах на основе женьшеня [40]. Сравнивали способы определения гинсенозидов с ППТ- и ППД-сапогенинами в различных продуктах на основе женьшеня с применением методов ВЭЖХ с УФ- и МС-детектированием, а также метода КАМС. Шестнадцать гинсенозидов различной полярности разделяли на обращенно-фазовой колонке в режиме градиентного элюирования за 40 мин. В качестве подвижной фазы использовали 0.1%-ную муравьиную кислоту в воде и ацетонитрил. Ультрафиолетовое детектирование проводили при длине волны 230 нм. Масс-спектрометрическое детектирование осуществляли в режиме мониторинга выбранных ионов, характерных для ППТ (m/z 405, 423) и ППД (407, 425) сапогенинов. Гинсенозиды определяли в различных продуктах на основе женьшеня при помощи градуировочного графика и методом КАМС. Для определяемых гинсенозидов рассчитали значения факторов пересчета в условиях ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ–МС. Относительная ошибка метода не превышала 7 и 11% в случае применения методов ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ–МС для определения гинсенозидов соответственно в большом количестве анализируемых объектов. Полученные результаты показывают, что метод КАМС может быть успешно применен для определения гинсенозидов вместо метода внешнего стандарта в случае отсутствия стандартных образцов определяемых гинсенозидов. Показано также, что согласно американской и европейской Фармокопеи метод КАМС в сочетании с ВЭЖХ-УФ дает завышенные значения параметров, используемых для контроля качества продуктов на основе женьшеня, по сравнению с методом КАМС в сочетании с ВЭЖХ–МС. Это можно объяснить боле низкой селективностью метода ВЭЖХ-УФ. Таким образом, метод КАМС в сочетании с ВЭЖХ–МС можно успешно применять для оценки содержания гинсенозидов в продуктах на основе женьшеня.

* * *

Для целевого определения физиологически активных компонентов растений выбраны условия экстрагирования, не разрушающие целевые соединения и обеспечивающие высокие степени извлечения, а также подобраны условия хромато-масс-спектрометрического детектирования, позволяющие достичь низких пределов обнаружения. Для определения салидрoзида, розавина, розарина, псевдогинсенозидов F11 и RT5, схизандролов А и В, байкалина, байкалеина, вогонина, скутелларина, а также глицирризина использовали режим мониторинга выбранных реакций, обеспечивающий достижение низких пределов обнаружения соединений в диапазоне от 1 до 20 нг/мл. Гинсенозиды Rb1, Rg1, Rf и Re не способны образовывать протонированные молекулы в режиме регистрации положительных ионов, а интенсивность сигналов, соответствующих депротонированным молекулам в режиме регистрации отрицательных ионов низка, однако в масс-спектре данных соединений при использовании линейной ионной ловушки наблюдается характерные паттерны фрагментации, содержащие группу интенсивных сигналов. Таким образом, для определения данных гинсенозидов применен режим сканирования по сумме интенсивностей выбранных сигналов с использованием линейной ионной ловушки, который обеспечил возможность одновременной идентификации и высокочувствительного определения данных соединений с пределами обнаружения в диапазоне от 3 до 10 нг/мл. С использованием метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием в линейной ионной ловушке получены характерные паттерны фрагментации женьшеневых сапонинов и сапонинов, содержащихся в растениях рода Panax, листьях четочника молитвенного Abrus precatorius L. и корне солодки Glycyrrhiza glabra. Паттерны фрагментации, а также характерные времена удерживания сапонинов позволили провести групповую идентификацию гинсенозидов с ППТ-, ППД-, ОТ- и ОАК-сапогенинами, а также обнаружить присутствие группы абрусозидов из листьев A. precatorius и компонентов экстракта корня солодки в составе женьшеневого улуна, что обусловливает сладкий привкус этого вида чая. Также с помощью препаративной хроматографии и применения методов ЯМР, масс-спектрометрии высокого разрешения и ВЭЖХ–МС/МС подтверждена структура нескольких новых соединений в экстракте из женьшеневого улуна. Для количественной оценки содержания гинсенозидов, а также компонентов надземных частей растения T. terrestris, успешно применен метод КАМС, позволяющий по найденным факторам пересчета относительно референтного соединения с известной концентрацией проводить количественный анализ без применения стандартных образцов. Полученные результаты могут быть использованы для контроля качества широкого круга растительной продукции, изучения состава полезных растительных материалов, а также для создания лекарственных препаратов на основе идентифицированных физиологически активных компонентов.

Работа поддержана Российским научным фондом (РНФ) (№ гранта: 17-13-01146).