Журнал аналитической химии, 2019, T. 74, № 6, стр. 421-425

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты и материалы. Для пробоподготовки образцов биологических жидкостей и приготовления подвижных фаз использовали ацетонитрил (для ВЭЖХ, Acros organics, Бельгия), муравьиную кислоту (х. ч., Неохим, Россия), воду деионированную (система Milli Q Synthesis). Анализируемые биологические объекты представлены образцами плазмы крови контрольной группы (12 образцов), пациентов с выявленным ТБ легких без начала лекарственной терапии (13 образцов) и на стадии лечения ПТП основного ряда (этамбутолом, пиразинамидом, рифампицином, изониазидом). Образцы плазмы крови пациентов с выявленным ТБ легких предоставлены НИИ фтизиопульмонологии (Санкт-Петербург).

Аппаратура и программное обеспечение. Жидкостный хроматограф Shumadzu LC-20 (Япония) с диодно-матричным детектором (SPD-M20A); жидкостный хроматограф с тройным квадрупольным масс-анализатором с ионизацией электрораспылением Shumadzu LCMS 8030 (Япония); колонка (150 × 2 мм, диаметр частиц 5 мкм) Luna C18(2) (Phenomenex, США); центрифуга Thermo Scientifiс SL16 (Thermo, США) с системой охлаждения.

Для хемометрической обработки хроматографических профилей использовали программный пакет R version 3.4.3 (The R Foundation for Statistical Computing, Австрия).

Подготовка образцов плазмы крови. Процедура подготовки образцов плазмы крови для анализа основана на ранее описанной методике определения ПТП [11] и включает осаждение белков путем добавления к образцу ацетонитрила в соотношении 1 : 3 (по объему), встряхивание в течение 2 мин, центрифугирование для отделения образовавшегося осадка в течение 10 мин (10 000 об./мин) при 4°С. Надосадочную жидкость отбирали в хроматографические виалы. Образцы плазмы крови до и после хроматографического анализа хранили при –20°С.

Условия анализа методами ВЭЖХ‒УФ и ВЭ‒ЖХ−МС/МС. Разделение выполняли в градиентном режиме элюирования с подвижной фазой 0.1%-ный водный раствор муравьиной кислоты (раствор А)–ацетонитрил (раствор Б). Программа градиентного элюирования: 5 мин – 3 об. % Б; 15 мин – 70 об. % Б; 20 мин – 70 об. % Б; 21 мин – 95 об. % Б; 25 мин – 95 об. % Б. Длина волны диодно-матричного детектора 254 нм.

Условия масс-спектрометрического детектирования метаболитов ПТП: ионизация электрораспылением (положительная полярность, напряжение на капилляре –4500 В, расход газа 15 л/мин, температура осушающего газа 250°С), режим мониторинга заданных реакций m/z 763.4 для 25-О-дезацетилрифампицина, m/z 136.1 для ацетилизониазида, m/z 107.0 для пиразиноевой кислоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Один из режимов химиотерапии ТБ включает одновременный прием изониазида, рифампицина, пиразинамида, этамбутола. Известно, что изониазид метаболизируется в печени до токсичного N-ацетилизониазида с помощью фермента N-ацетилтрансферазы (схема 1). Активность данного фермента обусловлена генетически. У медленных инактиваторов концентрация изониазида в крови всегда значительно выше, чем у быстрых, причем в последнем случае гораздо чаще наблюдаются различные побочные реакции [12]. Токсичный метаболит пиразинамида — пиразиноевая кислота, образующаяся в печени при участии фермента деамидазы, — ингибирует почечную экскрецию мочевой кислоты.

Рифампицин метаболизируется в печени путем деацетилирования с образованием метаболита дезацетилрифампицина, который является причиной таких побочных процессов, как гепатотоксичность, проявление аллергических реакций и т.д. [13, 14] Данную информацию необходимо учитывать в практике клинической медицины.

Нами проведен поиск возможных метаболитов ПТП методом обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ с МС-детектированием в режиме сканирования (m/z 100–900) в образцах плазмы крови доноров, находящихся на стадии лечения. Условия пробоподготовки и анализа образцов плазмы крови совпадают с условиями определения ПТП и их метаболитов [11], что дает возможность дальнейшего одновременного исследования метаболических профилей и детектирования остаточных количеств ПТП. По выделенным молекулярным ионам обнаружены следующие метаболиты: N-ацетилизониазид, пиразиноевая кислота, 25-O-дезацетилрифампицин. Наличие указанных соединений подтверждают результаты хромато-масс-спектрометрического анализа экстрактов плазмы крови по характерным осколочным ионам метаболитов (рис. 1) и соответствующие масс-спе-ктры.

Схема 1. Схемы образования метаболитов противотуберкулезных препаратов в организме (NAT 2 − N-ацетилтрансфераза 2 типа, DA – деамидаза).

Рис. 1.

Хроматограмма метаболитов противотуберкулезных препаратов с масс-спектрометрическим детектированием осколочных ионов и схемы их фрагментации: (а) – пиразиноевая кислота, (б) – N-ацетилизониазид, (в) – 25-О-дезацетилрифампицин. Условия разделения и детектирования указаны в “Экспериментальной части”.

Методом ОФ ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования со спектрофотометрическим детектированием (254 нм) получены и хемометрически обработаны характеристические профили образцов плазмы крови контрольной группы (“норма”) и доноров с выявленным ТБ легких. Такой подход может оказаться полезным при поиске независимого диагностического критерия ТБ, а также при экспресс-скрининге эффективности проводимой лекарственной терапии.

Полученные профили обрабатывали методом главных компонент (МГК), который позволяет выявить скрытую взаимосвязь между образцами и достаточно легко интерпретировать результаты. Для этой цели хроматограммы представляли в виде матрицы, где каждый ее элемент − значение интенсивности поглощения при конкретном времени удерживания с шагом 0.01 с. В матрице данных учитывали времена удерживания аналитов, начиная с пятой минуты. Данный шаг позволил не принимать во внимание неразделяемые компоненты биологического образца, слабо удерживаемые на обращенно-фазовом сорбенте и элюируемые с мертвым временем хроматографической колонки. На двумерном графике счетов МГК в координатах главных компонент ГК1 и ГК2 можно выделить кластеры “норма” и “патология” (рис. 2), причем 2 образца, принадлежащие классу “патология”, значительно отличаются от других объектов того же класса. Этот факт говорит лишь о каких-либо особенностях данных объектов (например, сопутствующее заболевание и т.п.), так как МГК не является способом классификации. Выделение четких групп образцов дает большую вероятность их отнесения к истинному классу. Значения объясненной дисперсии составили 53 и 19%.

Рис. 2.

График счетов для образцов плазмы крови здоровых (⚪) и больных туберкулезом легких (⚫) доноров.

Для задачи классификации образцов плазмы крови как “норма” и “патология” применили метод k-ближайших соседей (k-Nearest Neighbors, kNN). Суть метода заключается в вычислении расстояния от образца до его k-ближайших соседей: объекту присваивается тот класс, к которому принадлежит большинство. Обучающий набор состоял из 18 образцов (по 9 образцов каждого класса), тестовый – из 7. Метод kNN является параметрическим методом классификации, поэтому необходимо было выбрать оптимальное число соседей. После предварительного обучения, в ходе которого каждому образцу из набора присваивалась группа норма/патология, лучшие результаты классификации достигнуты для числа соседей, равного 3. Точность для изученной независимой тестовой выборки, рассчитанная как отношение числа правильно классифицируемых образцов к их общему количеству, составила 86% (1 образец патологии неверно классифицирован как “норма”).

* * *

Таким образом, на примере образцов плазмы крови больных ТБ показана возможность и перспективность применения характеристических хроматографических профилей для диагностики заболевания и оценки проводимой лекарственной терапии ТБ по профилю токсичных метаболитов.