Журнал аналитической химии, 2020, T. 75, № 5, стр. 430-437

ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Адсорбционную ТСХ позиционных изомеров модельной смеси 15 индивидуальных видов диацилглицеринов – гидрофобной основы молекул большинства классов липидов биомембран – проводили в подвижной фазе хлороформ–изопропанол (99 : 1, по объему) на пластинках с закрепленным слоем силикагеля G (Merck), который включал 2% ионов Ag⁺ [7]. Кроме значений относительной подвижности (R_f) отдельных компонентов этой смеси, для дальнейшего расчета взяты известные уровни R_f различных классов других липидов, также полученные путем адсорбционной ТСХ [8]. На первом этапе обработки исходных данных эти уровни были предварительно преобразованы в соответствующие им факторы удерживания k по формуле k = $R_{{\text{f}}}^{{ - {\text{1}}}}$ – 1 [9].

Кроме того, для расчета значения элюирующей силы смеси растворителей P' использовали стандартные величины P ' тех чистых растворителей, которые входили в состав системы для адсорбционной ТСХ; при этом предполагали, что значение $P_{{{\text{mol}}}}^{'}$ является аддитивным и представляет собой сумму произведений молярной доли каждого растворителя в такой смеси на параметр Р ', который может служить мерой элюирующей силы в распределительной хроматографии [9]. В ходе дальнейшей обработки данных сделали допущение, что величины произведений фактора удерживания отдельных классов липидов (k_i) на частицах силикагеля одного и того же типа связаны не только свойствами обеих фаз, но и с характерными для таких классов усредненными уровнями их относительной полярности: ${{\left( {P_{{{\text{mol}}}}^{'}} \right)}_{i}}$ = = $P_{{{\text{mol}}}}^{'}$k_i.

С учетом такого допущения ряд произведений величин полярности каждой подвижной фазы ($P_{{{\text{mol}}}}^{'}$) и последовательности значений k_i вполне можно представить в качестве массива уровней ($P_{{{\text{mol}}}}^{'}$)_i, удовлетворительно отражающих относительную полярность отдельных классов самих липидов. Расчетные значения $P_{{{\text{mol}}}}^{'}$ для каждой подвижной фазы оценивали, исходя не только из свойств ее отдельных компонентов, но и из их молярной доли в этой фазе, так как эти доли точнее, чем массовые, характеризуют получаемые аддитивные уровни полярности $P_{{{\text{mol}}}}^{'}$ самих фаз. Поэтому во всех последующих расчетах наряду с традиционными объемными соотношениями ($P_{{{\text{vol}}}}^{'}$) между отдельными компонентами обсуждаемых ТСХ-систем использовали именно молярные доли.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Значения $P_{{{\text{mol}}}}^{'}$ и $P_{{{\text{vol}}}}^{'}$ для каждой из трех подвижных фаз, использованных для ТСХ фосфо- и гликолипидов, а также соответствующие им уровни ${{\left( {P_{{{\text{mol}}}}^{'}} \right)}_{i}}$ и ${{\left( {P_{{{\text{vol}}}}^{'}} \right)}_{i}}$ отдельных классов этих липидов представлены в табл. 1–3. Наиболее подходящей парой для фиксации реперных значений P_i оказались два фосфолипида – фосфатилхолин и фосфатидилэтаноламин, которые представляют собой главные классы из всего разнообразия полярных ацилсодержащих фосфолипидов и почти всегда в тех или иных количествах присутствуют в составе большинства природных липидных смесей. С помощью пары этих значений оценили величины $P_{i}^{'}$ всех остальных классов липидов в трех подвижных фазах стандартного состава; две из таких фаз включали помимо хлороформа, метанола и воды либо уксусную кислоту, либо водный раствор аммиака и заметно отличались друг от друга кислой или щелочной реакцией среды (табл. 2 и 3 соответственно).

Кроме того, в состав табл. 1–3 также включены значения гидрофобности (HB)_i молекул глицеролипидов, обратно пропорциональные их уровням ${{\left( {P_{{{\text{mol}}}}^{'}} \right)}_{i}}$ и ${{\left( {P_{{{\text{vol}}}}^{'}} \right)}_{i}}{\text{:}}$ (HB_mol)_i = $\left( {P_{{{\text{mol}}}}^{'}} \right)_{i}^{{ - 1}}$ и (HB_vol)_i = = $\left( {P_{{{\text{vol}}}}^{'}} \right)_{i}^{{ - 1}}.$ Введение нового параметра (HB)_i в дополнение к уровню (P')_i, который вполне удовлетворительно отражает относительную полярность этих молекул в подвижных фазах разного состава, позволило заметно снизить величину погрешности, что было особенно актуально при определении абсолютных величин этого параметра для высокополярных липидов. Для расчета величин HB_i липидных молекул для той же системы использованы стандартные уровни hR_f= 100(R_f)_i [7]. В результате этого расчета массивы произведений значений k отдельных классов липидов на величину P ' подвижной фазы известного состава можно представить в качестве неких усредненных уровней полярности индивидуальных (молекулярных) видов липидов каждого такого класса, чьи молекулы характеризуются различной длиной и ненасыщенностью углеводородных цепей, а следовательно, собственными значениями L₁ и L₂. Эти массивы, т.е. расчетные величины $P_{i}^{'}$ и HВ_i, а также значения десятичных логарифмов HВ_i главных классов липидов и их метаболических предшественников представлены в табл. 1–3; все данные получены, исходя либо из объемных, либо из молярных соотношений между отдельными компонентами подвижных фаз c различными концентрациями H₃O⁺ (2 ≤ рН ≤ 10).

Из табл. 1–3 можно видеть, что независимо от состава подвижной фазы величины P ' и HВ у фосфатилилхолина находятся на почти одном и том же уровне (10.8 ± 1.4 и 0.10 ± 0.02 соответственно). Вместе с тем в подвижной фазе с рH > 7 значение P ' для фосфатидилэтаноламина трехкратно возрастает (табл. 2), а его вариация положительна (ΔP ' = = 4.2 ± 0.3 в зависимости от взятого соотношения между отдельными элюентами этой подвижной фазы), тогда как для другой подвижной фазы с рН < 7 она отрицательна (ΔP ' = = (–2.0) ± (–0.2), табл. 3). Тот же резкий рост селективности разделения имеет место не только для этих главных фосфолипидов, но и для тех классов глицерофосфатидов, которые имеют в составе молекул частично блокированную аминогруппу (N-Me-PtdEtn и N,N-Me₂PtdEtn) и отличаются друг от друга противоположным знаком уровня $\Delta P_{i}^{'}$ (2.1 ± 0.2 и –2.1 ± (–0.2) соответственно). В то же время уровень P ' молекул фосфатидилсерина в подвижной фазе с рН < 7 претерпевает почти шестикратное падение (ΔP ' = –24 ± 2), тогда как использование фазы с рН > 7 приводит к его трехкратному росту (ΔP ' = 24 ± 1). В случае фосфатидной кислоты этот рост уже пятидесятикратен, а вариации усредненных величин P ' для испытанной смеси ее индивидуальных (молекулярных) видов особенно значительны (ΔP ' = 94 ± 6). Близкий результат получен для смеси молекул фосфатидилинозита (ΔP' = (–11) ± (–1) и 24 ± 2 соответственно).

Предлагаемый подход позволяет количественно оценить взаимосвязь весьма условных усредненных относительных величин $P_{i}^{'}$ природных смесей^{отдельных классов глицеролипидов с присутствием или отсутствием фосфоэфирной группы в их молекулах, а также с наличием в последних иных дополнительных полярных или неполярных заместителей. Кроме того, появляется шанс оценить возможный вклад в эту величину вариаций структуры гидрофобной основы этих молекул. Следует отметить, что удерживание в адсорбционной ТСХ двух главных классов гликолипидов природного происхождения (моногалактозил- и дигалактозилдиацилглицеринов), молекулы которых не содержат такой группы, не претерпевает в диапазоне 2 ≤ рН ≤ 10 столь заметных перемен. Таким образом, можно предположить правомерность использования предложенного подхода с целью расчета величин $P_{i}^{'}$ и HВ_i для иных классов липидов. В качестве примера в табл. 4 представлены усредненные уровни $P_{i}^{'},$ HВ_i и lg(HВ_i) молекул главных классов нейтральных липидов, которые были получены, исходя из известных значений R_f, установленных другими авторами [8]. Можно видеть, что эти уровни вполне удовлетворительно отражают усредненную гидрофобность всех молекул отдельного класса таких липидов, каждая из которых имеет собственные значения L₁ и L₂.}

Полученные данные показывают, что величины $P_{i}^{'},$ усредненные по всем индивидуальным видам отдельных классов липидов, варьируют в относительно узком интервале, причем максимальное отклонение этих величин друг от друга можно наблюдать только для высокополярных соединений, где уровень возможной погрешности определения точных значений параметра (R_f)_i наиболее высок. Удовлетворительная корреляция между данными значениями и величинами $P_{i}^{'}$ отдельных классов липидов дает возможность расположить такие величины в некоторой последовательности их роста. Кроме того, ряд значений HВ_i тех же классов может быть представлен в качестве совокупности элементов шкалы гидрофобности липидов, величины которой варьируют от 0 до 100 и границами которой могут служить параметры стандартной двухфазной смеси (высший углеводород/вода).

Анализ результатов проведенного расчета позволяет сделать вывод о том, что значения $P_{i}^{'}$ и HВ_i вполне удовлетворительно отражают относительную полярность самих липидных молекул и могут служить в адсорбционной ТСХ на частицах силикагеля ориентиром для их сравнения между собой. Однако нельзя утверждать, что эти значения определяют последовательность элюирования индивидуальных видов всех классов липидов на иных сорбентах. Состав большинства этерифицированных жирных кислот разнообразных липидных молекул природного происхождения претерпевает весьма значительные вариации от объекта к объекту и даже внутри каждого такого объекта в зависимости от условий внешней среды. Любое аддитивное значение P ' липидных молекул i-го класса в фиксированный момент времени жизни клетки, а также их координационных комплексов может зависеть in vivo и от иных, пока неизвестных нам факторов, а не только от катионов переходных металлов из этой среды.

Резкий скачок уровня полярности молекул полиненасыщенных липидов происходит при появлении в системе для ЖХ соединений, склонных к образованию с этими липидами лабильных координационных комплексов, например солей серебра [7, 10]. В наших опытах по планарной адсорбционной ЖХ (ТСХ) весьма узкий диапазон распределения рацемической модельной смеси индивидуальных видов sn−1,2-диацилглицеринов растительного происхождения по шкале гидрофобности их ненасыщенных молекул был многократно расширен в присутствии соли серебра. Это всегда происходило за счет образования π-комплексов олефиновых связей данных молекул с ионами кластеров Ag [7, 10]. В то же воемя насыщенные молекулы такой смеси характеризовались одними теми же значениями $P_{i}^{'}$ и HВ_i, практически идентичными найденным по данным [8], несмотря на разительные отличия в составе обеих подвижных фаз для ТСХ, использованных в данной паре опытов. Это позволяет судить о правомерности подхода к оценке $P_{i}^{'}$ и HВ_i в данной работе.

Вместе с тем для π-комплексов гексаеновых индивидуальных видов той же модельной смеси (дилиноленоата) величина L была ниже, чем у молекул дистеарата c тем же числом m не в два, как в отсутствие Ag⁺, а в целых три раза [7, 10]. Кроме того, в адсорбционной ТСХ с солью серебра были зарегистрированы отдельные зоны π-комплексов стеароолеоата и пальмитоолеоата, молекулы которых имели один и тот же уровень e, но разные величины L₁ (34 и 32 соответственно [7, 10]). Разность их расчетных значений $P_{i}^{'}$ составила здесь 3.0 ($\Delta P_{i}^{'}$ = 5.0 – 2.0), т.е. вклад одной метиленовой единицы в вариацию размера P ' этих молекул может быть оценен как 1.5.

Совсем недавно дополнительно подтверждено существование не только одиночных ионов Ag⁺, но и устойчивых высокоупорядоченных структур как катионных ${\text{Ag}}_{n}^{ + }$ и нейтральных Ag_n кластеров серебра, так и их анионных кластеров ${\text{Ag}}_{n}^{ - }$ с n ≥ 2, электронные характеристики и геометрия которых значительно меняются по мере увеличения числа n до 7, 18 и 22 [11]. Вероятно, высоконенасыщенные ацильные остатки в составе молекул липидов природного происхождения обладают повышенной склонностью к взаимодействию с такими кластерами сразу по нескольким внешним трехатомным участкам последних и легко могут тесно обволакивать внешнюю поверхность этих кластеров, что приводит к многократному росту полярности структуры самого комплекса и резко снижает его подвижность [10].

Всю совокупность характеристик молекул липидов отдельных классов нельзя воспринимать как некую статичную систему, где место каждого ненасыщенного индивидуального вида на шкале гидрофобности органических соединений строго определено. Заметное удлинение диапазона распространения молекул индивидуальных видов одного и того класса по этой шкале может быть вызвано как искусственным приемом, намеренно выполненным оператором с целью увеличения селективности разделения этих молекул, так и представлять собой чисто спонтанный процесс. Последний может быть связан с непроизвольным попаданием из внешней среды в достаточно замкнутую систему живой клетки с ограниченным набором природных соединений какого-либо вполне естественного метаболита, который способствует протеканию в том же направлении аналогичного процесса образования координационных комплексов, но с участием иных ионов или их кластеров.

Появление высокочувствительных вариантов масс-спектрометрии (МС) создало возможность, используя огромные базы данных, быстро идентифицировать и достоверно устанавливать место каждого мономолекулярного компонента в ряду всех элюируемых соединений. В ходе комплексных экспериментов по ВЭЖХ–МС сложных смесей триацилглицеринов получена новая информация [12]. В повседневной работе аналитик достаточно часто имеет дело с гомологическими рядами молекул в пределах одного и того же класса, т.е. с разнообразными комбинациями соединений с произвольными значениями m. В настоящее время липиды обычно фракционируют путем разнообразных комбинаций ГЖХ и ВЭЖХ с масс-спектрометрией [12]. В этой связи представляет особый интерес оценка последних данных колоночной ВЭЖХ–МС для отдельных вариантов такого фракционирования на еще более разнообразных комбинациях молекул высоконенасыщенных видов липидов природного происхождения. В таком случае для более корректного сравнения между собой уровней HВ_i молекул разной полярности относительно неполярного углеводорода (например, н-гексадекана), по-видимому, целесообразно использовать липиды с одним и тем же числом m в их ацильных цепях (16), что наиболее характерно лишь для некоторых объектов природного происхождения.

В заключение отметим, что попытку установить строгую взаимосвязь между значениями k при адсорбционной ВЭЖХ, а также величинами кислотности и поляризуемости отдельных классов органических соединений предпринимали и ранее [13]. Тем не менее, для достаточно аргументированного объяснения механизма фракционирования таких соединений необходимы еще более точные данные.