Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 12, стр. 1137-1145

 

Расторопша пятнистая (Silybum marianum (L.) Gaertn) является сырьевым источником ценных биологически активных веществ, таких как флаволигнаны, флавоноиды, жирное масло, белки, углеводы, микро- и макроэлементы [1–5]. Лекарственные препараты на основе масла из плодов расторопши пятнистой (РП) используют при лечении ран, язв, пролежней и воспалительных процессов [3]. Масло РП – ценная биологически активная добавка (БАД) к пище. Наиболее ценными считаются БАД, выделенные из дикорастущего сырья. Необходимо контролировать качество таких БАД, так как их нередко фальсифицируют или разбавляют недорогими маслами, на порядок более дешевыми, чем подлинные БАД.

Одним из эффективных методов контроля качества и подлинности растительных масел и животных жиров является дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) [6–14]. В работах [6, 7] методом ДСК изучены теплофизические свойства семи типичных растительных масел, жидких при комнатной температуре. Эндотермические пики и их площади на термограммах ДСК плавления сопоставлены с жирнокислотным и триглицеридным составом, найденными хроматографическими методами, установлено наличие значимых корреляций между тепловыми эффектами и химическим составом масел. Для интерпретации кривых кристаллизации и плавления растительных масел и пищевых жиров (17 сортов) в работе [8] в качестве подтверждающих методов также использованы хроматографические данные о жирнокислотном и триглицеридном составе рассматриваемых жиров. Для исследования масел и жиров методом ДСК часто используют кривые кристаллизации, однако они хуже воспроизводятся, чем кривые плавления [7, 9, 11]. В работах [10, 12] применяли так называемую “быструю” ДСК с градиентом температур 10–20 град/мин. Показано, что при таких скоростях нагрева пики, характеризующие тепловые эффекты, разделяются хуже, частично или полностью сливаются, что снижает информативность термограмм, в то время как снижение скорости нагрева увеличивает продолжительность термического анализа. В связи с этим наиболее часто в ДСК растительных масел рекомендуют использовать скорость нагрева или охлаждения 5 град/мин [7].

Преимуществом применения метода ДСК для контроля качества и идентификации жировой фазы является его высокая чувствительность к ее составу. Метод не требует больших затрат времени, реактивов и растворителей, дополнительного лабораторного оборудования. Как показано в работе [13], по характерному профилю термограмм ДСК можно проверить не только аутентичность образца масла, но даже географическое происхождение и сорт масличного растения, из которого оно выделено. В работе [7] предложен алгоритм идентификации растительных масел с использованием контрольных карт, визуализирующих цифровую информацию, содержащую несколько параметров термограмм.

Цель настоящей работы – изучить теплофизические свойства масла плодов дикорастущей расторопши пятнистой из различных районов Дагестана, установить взаимосвязи характеристичных тепловых эффектов, наблюдаемых на термограммах ДСК плавления, с происхождением растительного сырья, опробовать использование полученных данных для проверки подлинности масла РП.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Образцы масла РП получены в лабораторных условиях в Дагестанском государственном университете методом сверхкритической флюидной экстракции диоксидом углерода [4]. Перед получением плоды сушили в сушильном шкафу при 50°C, измельчали на лабораторной мельнице ЛМ-201 до фракции 0.1–1.0 мм, выход фракции 99.0 ± 0.3%. Масло получали с помощью лабораторной экстракционной системы модели SFE 1000M1-2-FMC 50 (Waters, США). Пробу измельченных плодов РП (40 г) помещали в автоклав объемом 200 мл и обрабатывали диоксидом углерода под давлением 400 бар при 40°С и скорости потока СО₂ 50 г/мин в течение 60 мин. В табл. 1 представлена информация об образцах масла из сырья РП, полученного в разных районах Дагестана.

Иодное число (NI) образцов масла РП определяли по стандартной методике [15]. Для проведения термического анализа использовали прибор синхронного термического анализа STA 449 F3 Jupiter® фирмы “NETZSCH” (Германия). Для анализа отбирали навески образцов масла массой 15–22 мг. Навеску с алюминиевым тиглем, накрытым алюминиевой крышкой, помещали в прибор, выполняли взвешивание. Затем температуру навески увеличивали до 60°С со скоростью 5 град/мин для полного расплавления образца и снятия “тепловой предыстории”. Теплофизические свойства измеряли в диапазоне температур от –150 до +20°С, скорость нагрева 5 град/мин. Систему охлаждали жидким азотом со скоростью охлаждения 1 град/мин для исключения рекристаллизации (холодной кристаллизации). Измерения выполняли в атмосфере гелия (расход продувочного газа 10 мл/мин, расход защитного газа 10 мл/мин). Точность измерения температуры составляла ±0.3°С. Для повышения информативности термограмм, полученных методом ДСК, использовали программное разделение суперпозиции пиков тепловых эффектов, не накладывающихся друг на друга, в программе NETZSCH Peak Separation по алгоритму Gauss. Обозначения остатков жирных кислот в триацилглицеринах (ТАГ) (табл. 2): B – бегеновая, E – эйкозеновая, L – линолевая, О – олеиновая, P – пальмитиновая, S – стеариновая. Например, L₂О обозначает ТАГ, образованный двумя радикалами линолевой и одним радикалом олеиновой кислоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Триацилглицерины масла РП содержат в сумме от 75 до 90% ненасыщенных жирных кислот (ЖК) (в основном линолевой и олеиновой), 5–20% насыщенных ЖК (пальмитиновой, стеариновой, арахиновой и бегеновой) и некоторое количество (в сумме до 5%) минорных ненасыщенных и насыщенных ЖК (табл. 2) [1–7].

По данным работ [1–7] и цитируемых в них первоисточников, мы провели корреляционный анализ, установили значимые корреляции между соотношениями некоторых ЖК, обусловленные влиянием генотипических и фенотипических факторов. Так, при увеличении в масле РП доли пальмитиновой кислоты (С16:0), доля линолевой (С18:2) асимбатно падает: W(С18:2) = 104 – 7W(С16:0), R = = 0.59, n = 15. Доля стеариновой кислоты при этом симбатно растет: W(С18:0) = 1.7W(С16:0) – 9.0, R = 0.62, n = = 15. Аналогично доля арахиновой кислоты симбатно растет при увеличении доли стеариновой кислоты: W(С20:0) = 0.7W(С18:0) – 1.4, R = 0.82. Иначе говоря, при симбатном увеличении доли насыщенных ЖК в масле РП в первую очередь падает содержание основной ненасыщенной кислоты – линолевой (С18:2). В работе [6] показано, что между положением эндотермических максимумов кривых ДСК плавления, их площадью и содержанием основных ЖК в растительных маслах прослеживаются значимые корреляции. Таким образом, выявленные тренды должны закономерно отразиться на теплофизических свойствах жировой фазы РП, выращенной в разных условиях, так как фазовые переходы ТАГ с разным соотношением насыщенных и ненасыщенных ЖК проявляются при разных температурах [6, 7].

Жирные кислоты, характерные для масла РП, образуют около 20 разнообразных ТАГ (без учета положения остатков ЖК в структуре молекулы), которые в химической технологии подразделяют на четыре фракции по степени ненасыщенности: 1) триненасыщенные (содержат три остатка ненасыщенных ЖК) ТАГ – UUU (U – unsaturated); 2) диненасыщенные, мононасыщенные – UUS (S – saturated); мононенасыщенные, динасыщенные – USS; тринасыщенные ТАГ – SSS. Например, плоды РП, культивируемой в Липецкой области, содержат в масле около 60% ТАГ типа UUU и только 3% ТАГ типа SSS (табл. 3) [7].

Триацилглицерины, образованные преимущественно ненасыщенными ЖК (UUU, UUS), имеют отрицательные температуры плавления, SSS – положительные [7]. В результате взаимной растворимости ТАГ из-за наличия эвтектик, различных фазовых переходов кривые ДСК плавления жиров (смесей ТАГ) имеют несколько максимумов и экстремумов, уникальных для различных жиров. Для кривых плавления масла РП можно выделить пять характерных эндотермических максимумов (рис. 1), которые характеризуют свойства не индивидуальных ТАГ, а интегральные характеристики их фракций, ТАГ в которых имеют близкие теплофизические свойства. Для определения T_i слабо выраженных термических эффектов, так называемых “плеч” на основных пиках, применяли вторые производные от ДСК по времени (рис. 1з).

В табл. 4 приведены установленные величины теплофизических характеристик исследуемых образцов – T_i и площади S_i, найденные в результате компьютерного разделения накладывающихся пиков.

В работах [6–8] показано, что жидкие растительные масла, содержащие >60% UUU и >17% UUS, например оливковое, имеют на кривых плавления ДСК наиболее ярко выраженный эндотермический пик в области от –42 до +6°С, на плечах которого слева и справа проявляются как минимум еще два−три пика. Основные тепловые эффекты в исследуемых нами образцах масла РП наблюдались в более узком диапазоне температур.

Максимум при Т₁. Как видно из табл. 4, максимум пика при Т₁ слабо варьирует от –37.6 до ‒31.1°С. Этот пик можно отнести, прежде всего, к фракции ТАГ UUU с наименьшими температурами плавления, в частности, он формируется за счет наличия L₃ [7].

Максимум при Т₂. Второй пик c максимумом при T₂ от –27.6 до –23.8°С имеет наибольшую площадь. Его формирует смесь фракций ТАГ UUU и UUS, в которых присутствуют остатки линолевой кислоты – L₃, L₂O, LOP, при этом возрастание доли ТАГ типа LOP, LOS, как показано в работе [7], приводит к смещению максимума пика в область более высоких температур за счет включения в состав ТАГ остатков пальмитиновой, стеариновой и других насыщенных ЖК.

Максимум при Т₃ смещается от –19.9 до ‒14.4°С, он формируется смесью, содержащей преимущественно ТАГ UUS с примесью UUU и USS. Увеличение доли олеиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот и суммы USS смещает максимум пика в область более высоких температур [7].

Максимум при Т₄. Этот нечеткий пик, скорее всего, образуют ТАГ из фракции USS.

Максимум при Т₅ от –4.7 до –1.2°С обусловлен наличием смеси ТАГ типа USS и SSS. Этот пик находится в области отрицательных температур, а значит, из-за небольшого количества ТАГ SSS, содержащих пальмитиновую, стеариновую, арахиновую и бегеновую кислоты, на термограммах исследуемых масел РП отсутствует пик, характеризующий “чистую” фракцию SSS.

В табл. 5 представлены результаты корреляционного анализа выборки образцов масла, полученного из дикорастущей РП из разных районов Дагестана, которые отличаются климатическими условиями (табл. 1) [16].

Изучение дикорастущей РП одного региона позволяет исключить генотипические различия и оценить, как на кривые ДСК влияют фенотипические факторы. Как видно из табл. 5, для образцов масла РП характерны не только значимые (абсолютное значение коэффициента парной корреляции |R| > 0.50), но и тесные корреляции (|R| ≥ 0.80) как между температурами максимумов пиков Т_i или между величинами S_i, так и между ними и отдельными климатическими условиями – высотой над уровнем моря (H), средним содержанием гумуса в почве (G), количеством солнечных дней (Q) и осадков (D) в году. Так, с повышением высоты над уровнем моря все значения T_i смещаются в сторону увеличения, что говорит о снижении степени ненасыщенности ТАГ в этом сырье. Об этом же говорят асимбатные корреляции между T_i и иодным числом NI. Чем сильнее наблюдаемое смещение T_i в сторону положительных температур на кривых ДСК, тем меньше иодное число образца масла. Аналогичная тенденция для T_i наблюдается с увеличением содержания гумуса в почве. Вместе с тем площади этих пиков S_i ведут себя по-разному. Так, площадь пика S₂ уменьшается, а площади S₃ и S₅ растут при смещении T_i в более положительную область, что указывает на увеличение доли ТАГ с меньшим числом двойных связей. Величины T₄ и T₅, обусловленные ТАГ USS и SSS, симбатно растут в масле при увеличении количества осадков. В то же время чем больше солнечных дней в зоне произрастания РП, тем более низкие значения Т₁ и Т₅ наблюдаются на кривых плавления, что указывает на увеличение степени ненасыщенности ТАГ, при этом заметно увеличивается площадь пика S₃, а значит, растет содержание в масле ТАГ типа UUU и UUS. Всего установлено 46 корреляций: (1)–(46). Таким образом, проверка образцов масла РП, растущей в Дагестане, по корреляциям (1)–(46) позволяет установить условия созревания данного растительного сырья и с большой долей вероятности место произрастания.

Анализ серии образцов подлинного масла дикорастущей РП позволил экспериментально установить диапазоны варьирования его теплофизических параметров (T_i, S_i). Продемонстрируем возможности метода ДСК в контроле подлинности масла РП, сравнивая данные для дагестанских дикоросов с образцом масла, выделенного нами из плодов РП, приобретенных в аптечной сети (“Биокор”, Россия) (табл. 4), и двумя пробами масла РП, приобретенного в торговой сети “ВкусВилл”, в которые специально добавили по 10% подсолнечного и кукурузного масел, как и в работе [7]. Для визуализации и анализа данных построили контрольные карты (КК) с нормализованными параметрами T_i и S_i в виде лепестковых диаграмм (рис. 3) [17], на которых выделили установленный коридор допустимых значений от 0 до 1 (сплошные линии) и данные контроля (линии штрихом).

где X_н – найденное нормализованное значение T_i или S_i, Х_макс и Х_мин – максимальное и минимальное значения этих параметров в выборке из табл. 4 для дагестанских дикоросов РП.

Масло РП из сырья фирмы “Биокор” только по одному показателю (T₁) незначительно выходило за пределы допустимого коридора, характерного для выборки из дагестанского региона; по теплофизическим характеристикам оно наиболее близко к маслу, полученному из РП Сулейман Стальского района (рис. 3а).

Как видно из рис. 3, в масле РП с добавкой подсолнечного масла в коридор допустимых значений от 0 до 1 не попадают по температуре в максимуме пика значения T₁, T₂, Т₃ и Т₅, а также площадь S₅ ниже нормы. Это означает, что в образце завышена по сравнению с маслом РП доля ТАГ UUU и UUS и занижена доля SSS. В образце с добавкой кукурузного масла занижено значение Т₁, заметно завышена площадь S₃ и занижена площадь S₅. Это указывает на изменение состава UUU, в частности, на увеличение доли L₃ [7], а также UUS, и на снижение доли SSS в искусственно приготовленных фальсификатах. Построение КК в виде нормализованных лепестковых диаграмм в оболочке MS Excel и внесение в них экспериментальных данных – удобный алгоритм идентификации подлинности растительных масел по данным ДСК.

* * *

Таким образом, получена и охарактеризована выборка данных по теплофизическим показателям масла дикорастущей РП из различных районов Дагестана с применением метода ДСК, установлен диапазон варьирования этих показателей, показан алгоритм установления подлинности масла РП по данным термического анализа. Выполненные исследования подтверждают тот факт, что фазовые переходы растительного масла взаимосвязаны с определенным фракционным составом триацилглицеринов, который варьирует при изменении фенотипических факторов в довольно широких диапазонах, но не случайным образом, а в соответствии с генотипом и природными закономерностями созревания растительного сырья. Найденные корреляции между тепловыми эффектами в образцах жирного масла РП и климатическими условиями произрастания сырья могут быть полезными не только с точки зрения термического анализа, но и для химии растительного сырья, биохимии и фармакогнозии.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта № МК-590.2020.8.